不同外源調(diào)節(jié)物質(zhì)對低溫脅迫下玉米的緩解效應(yīng)分析

趙小強(qiáng),彭云玲,方 鵬，武博洋，閆慧萍

(甘肅省干旱生境作物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070)

低溫冷害是農(nóng)業(yè)可持續(xù)穩(wěn)定發(fā)展最為重要的自然災(zāi)害之一，其具有大尺度性、綜合性及地區(qū)差異性等特點(diǎn)。據(jù)統(tǒng)計(jì)，嚴(yán)重災(zāi)害年可使我國糧食減產(chǎn)100億kg左右。玉米(ZeamaysL.)是一種起源于熱帶、亞熱帶的喜溫作物，萌發(fā)期和苗期對低溫十分敏感[1-2]。萌發(fā)期遇到10℃以下低溫時，玉米種子的發(fā)芽勢、發(fā)芽率、種子活力明顯降低；遇到5℃以下低溫時玉米種子不能發(fā)芽，甚至引發(fā)爛種[3-5]。苗期遇到10℃以下低溫時，玉米幼苗生長明顯受到抑制，生理生化代謝紊亂；6～8℃時幼苗停止生長；溫度更低時細(xì)胞和組織產(chǎn)生不可逆的傷害，幼苗死亡[6-8]。在中國北方特別是東北地區(qū)，每年因低溫冷害而造成這一區(qū)域春玉米減產(chǎn)幅度在15%以上[9-10]。因而，研究低溫脅迫對玉米萌發(fā)及幼苗的傷害機(jī)理，探索玉米抗寒性機(jī)制及制定玉米抗寒預(yù)防、抵御措施，對提高玉米抗寒性具有重要的理論和實(shí)踐意義。

脯氨酸(Proline，Pro)是一種可溶性小分子有機(jī)物，是植物蛋白質(zhì)組分之一，其游離狀態(tài)廣泛存在于植物體內(nèi)。而甜菜堿(Glycine betaine，GB)是一種烷基烴類含氮化合物，屬于甘氨酸的季銨衍生物，其廣泛存在于動植物和微生物體內(nèi)。當(dāng)植物受到逆境(低溫、鹽漬、干旱等)脅迫時，外源Pro或GB可作為滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)參與植物細(xì)胞的滲透調(diào)節(jié)、穩(wěn)定膜和蛋白等亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)及清除活性氧，保護(hù)細(xì)胞抵御逆境脅迫的不利影響[11-15]。

近年來，外源Pro或GB對低溫脅迫下植物耐寒性的影響已有報道。馬文廣等[16]報道外源Pro浸種能顯著促進(jìn)煙草種子發(fā)芽，提高低溫逆境下幼苗根長、苗高、幼苗干鮮重及SOD、POD、CAT和APX活性，10mg·L-1Pro綜合效果較好，可作為提高煙草種子及幼苗抗寒性的處理方法。梁小紅等[17]報道外源GB能夠有效緩解低溫脅迫下結(jié)縷草葉綠素含量的下降，減少電解質(zhì)滲透率和丙二醛含量的升高，顯著提高SOD、POD、CAT和APX的活性、可溶性糖含量和脯氨酸含量，外施100mmol/L GB對提高結(jié)縷草的耐低溫能力的效果最為顯著。這些研究雖然揭示一定濃度的外源Pro或GB可有效緩解低溫對植物的傷害，進(jìn)而提高植物的耐寒性，但不能明確外源Pro或GB對植物低溫緩解綜合效果的大小，而低溫脅迫下外源Pro或GB對玉米耐寒性方面的研究尚未見報道。為此，本研究以前期篩選、鑒定的3份寒敏感玉米自交系為試材，在10℃低溫脅迫下，萌發(fā)期和苗期添加不同濃度外源Pro或GB后，研究不同濃度外源Pro或GB對低溫脅迫下玉米種子萌發(fā)和幼苗的影響，并綜合評價其緩解效果，以期為提供玉米萌發(fā)期和苗期耐寒性提供參考，為外源Pro或GB的合理使用奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 供試材料

以本課題組前期篩選、鑒定的3份寒敏感玉米自交系為試驗(yàn)材料[18]，由甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院玉米課題組提供。其中H105W來源于33-16/A6323，K22來源于掖478衍生系，B68來源于BSSS衍生系。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 種子預(yù)處理 3份寒敏感自交系中選擇飽滿、均勻一致的種子，先用0.5%的NaClO溶液消毒10min后用雙蒸水沖洗3次且滅菌濾紙吸干附著水，再分別各以5種不同濃度的Pro或GB溶液，及雙蒸水常溫(25℃)浸種24h，備試驗(yàn)所需。5種Pro或GB溶液分別為：T1(200μmol·L-1)；T2(400μmol·L-1)；T3(600μmol·L-1)；T4(800μmol·L-1)；T5(1000μmol·L-1)或T1*(10μmol·L-1)；T2*(20μmol·L-1)；T3*(30μmol·L-1)；T4*(40μmol·L-1)；T5*(50μmol·L-1)。

1.2.2 低溫萌發(fā)試驗(yàn) 將T1～T5、T1*～T5*溶液浸種后的種子各30粒，分別置于消毒發(fā)芽盒中，雙層滅菌濾紙做發(fā)芽床，然后分別加入相應(yīng)濃度的Pro、GB溶液，將其先置于(10±1)℃的氣候培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng)7d，再轉(zhuǎn)置于(25±1)℃的氣候培養(yǎng)箱中繼續(xù)暗培養(yǎng)7d的種子作為試驗(yàn)處理。將雙蒸水浸種并用其培養(yǎng)的種子作為對照處理，其中(25±1)℃的氣候培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng)7d的種子作為正向?qū)φ誄K(+)，(10±1)和(25±1)℃的氣候培養(yǎng)箱中先后暗培養(yǎng)各7d的種子作為負(fù)向?qū)φ誄K(-)。氣候培養(yǎng)箱相對濕度60%～80%，培養(yǎng)期間每隔2d補(bǔ)一次對應(yīng)濃度溶液各15mL，待CK(-)處理的種子暗培養(yǎng)第10d時統(tǒng)計(jì)發(fā)芽勢，第14d統(tǒng)計(jì)發(fā)芽率，并測量胚芽長、胚根長、胚芽鮮重、胚根鮮重。試驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)。

1.2.3 幼苗生長試驗(yàn) 先將滅菌蛭石與雙蒸水按5g∶1mL比例均勻混合，再將T1～T5、T1*～T5*溶液及雙蒸水浸種后的種子各30粒，分別播種于裝有滅菌蛭石的營養(yǎng)缽中。將其置于晝/夜溫度為(25±1)/(20±1)℃的氣候培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待雙蒸水浸種的種子長至三葉一心時，用雙蒸水快速沖洗掉幼苗根部蛭石，并用滅菌濾紙吸干附著水，再將幼苗分別置于相應(yīng)濃度的Pro或GB溶液(300mL)中，并置于晝/夜溫度為(10±1)/(6±1)℃的氣候培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)7d的幼苗作為試驗(yàn)處理。雙蒸水浸種并用其培養(yǎng)的幼苗作為對照處理，其中晝/夜溫度為(25±1)/(20±1)℃的氣候培養(yǎng)箱中培養(yǎng)的幼苗作為正向?qū)φ誄K(+)，晝/夜溫度為(25±1)/(20±1)℃和(10±1)/(6±1)℃的氣候培養(yǎng)箱中先后培養(yǎng)的幼苗作為負(fù)向?qū)φ誄K(-)。所有幼苗培養(yǎng)期間，每天光照12h，光照強(qiáng)度600μmol/(s·m2)，相對濕度60%～80%。試驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)，每一處理下測定幼苗第三片葉的各項(xiàng)生理生化指標(biāo)。

1.3 測定項(xiàng)目和方法

1.3.1 萌發(fā)指標(biāo)測定 參照彭云玲等[19]方法，測定玉米種子各萌發(fā)性狀。發(fā)芽勢和發(fā)芽率按以下公式計(jì)算：發(fā)芽勢(germination potential，GP)=規(guī)定時間內(nèi)發(fā)芽種子數(shù)/供試種子數(shù)×100(%)，發(fā)芽率(germination rate，GR)=發(fā)芽種子數(shù)/供試種子數(shù)×100(%)。直接用直尺測定各自交系的胚芽長(plumule length，PL)=胚芽基部到胚芽頂部的長度，胚根長(radical length，RL)=最長胚根的長度，并測定胚芽鮮重(shoot fresh weight，SFW)和胚根鮮重(root fresh weight，RFW)。每一處理下取長勢均勻一致的種子10粒，取其平均值。

1.3.2 幼苗生理生化指標(biāo)測定 參照史樹德等[20]方法，測定各處理下玉米幼苗第3片葉的相對電導(dǎo)率(relative conductivity，RC)、丙二醛含量(malondialdehyde content，MDA)、脯氨酸含量(proline content，Pro)、可溶性糖含量(soluble sugar content，SS)、超氧化物岐化酶活性(superoxide dismutase activity，SOD)、過氧化物酶活性(peroxidase activity，POD)及過氧化氫酶活性(catalase activity，CAT)。

1.3.3 單個性狀的外源調(diào)節(jié)物質(zhì)低溫緩解指數(shù) 為方便評價外源Pro或GB對低溫脅迫的緩解效果，本試驗(yàn)根據(jù)低溫脅迫下不同濃度外源Pro或GB處理下的各測定性狀值，定義了各性狀的外源Pro或GB低溫緩解指數(shù)(ease index，EI)，其公式為：

(1)

(2)

式中，EIiTn為第i個性狀在第Tn種濃度下的外源調(diào)節(jié)物質(zhì)低溫緩解指數(shù)；XTn為第Tn種濃度處理下的相應(yīng)性狀測定值；XCK(+)為正向?qū)φ誄K(+)處理下的測定值；XCK(-)為負(fù)向?qū)φ誄K(-)處理下的測定值。若相應(yīng)性狀與耐寒性呈正相關(guān)，則采用(1)式計(jì)算，反之，則用(2)式計(jì)算。EI為正值表示相應(yīng)濃度的外源Pro或GB對低溫脅迫起正向緩解作用，EI為負(fù)值表示相應(yīng)濃度外源Pro或GB對低溫脅迫起負(fù)向緩解作用。

1.3.4 不同外源調(diào)節(jié)物質(zhì)低溫緩解綜合評價 以各測定性狀的EI值作為低溫緩解評價指標(biāo)，借鑒彭云玲等[21]方法，采用隸屬函數(shù)法綜合評價外源Pro或GB的低溫緩解效果，其公式為：

(3)

(4)

式中,UiTn為第i個性狀在第Tn種濃度下的外源Pro或GB低溫緩解隸屬值，EIimax為第i個性狀在n種濃度下的最大EI值，EIimin為第i個性狀在n種濃度下的最小EI值。若所測EI與外源Pro或GB的緩解效果呈正相關(guān)，則采用(3)式計(jì)算，反之，則用(4)式計(jì)算，累加各濃度外源Pro或GB的EI隸屬值，并求出均值后進(jìn)行比較，均值越大，外源Pro或GB的低溫緩解效果越大。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

所有試驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用Microsoft Excel 2013軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和繪圖，采用SPSS 19.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行Duncan多重比較方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 低溫脅迫下添加不同外源調(diào)節(jié)物質(zhì)后玉米相關(guān)性狀的方差分析

萌發(fā)期低溫脅迫下，添加不同濃度外源Pro或GB后玉米各萌發(fā)性狀進(jìn)行方差分析。由表1可知，萌發(fā)期低溫脅迫下，添加不同濃度外源Pro后，發(fā)芽勢、發(fā)芽率、胚芽長、胚根長、胚芽鮮重、胚根鮮重等6個性狀在自交系間達(dá)到1%差異水平；6個性狀在Pro濃度間達(dá)到1%差異水平；除胚根鮮重外，其余5個性狀在自交系與Pro濃度互作間達(dá)到5%或1%差異水平。另外，萌發(fā)期低溫脅迫下，添加不同濃度外源GB后，除發(fā)芽勢外，其余5個性狀在自交系間達(dá)到1%差異水平；6個性狀在GB濃度間達(dá)到了1%差異水平；6個性狀在自交系與GB濃度互作間達(dá)到5%或1%差異水平。說明萌發(fā)期低溫脅迫下，添加不同濃度的外源Pro或GB可顯著影響玉米的發(fā)芽勢、發(fā)芽率、胚芽長、胚根長、胚芽鮮重、胚根鮮重，且萌發(fā)期低溫脅迫下，不同玉米自交系對外源Pro或GB的敏感程度不同，耐寒性越弱的玉米自交系對外源Pro或GB的敏感程度越強(qiáng)。

苗期低溫脅迫下，添加不同濃度的外源Pro或GB后玉米幼苗各生理生化性狀進(jìn)行方差分析。由表2可知，苗期低溫脅迫下，添加不同濃度的外源Pro或GB后，玉米幼苗的相對電導(dǎo)率、丙二醛含量、脯氨酸含量、可溶性糖含量、SOD、POD及CAT活性等7個生理生化性狀在自交系間達(dá)到1%差異水平；7個性狀在Pro或GB濃度間達(dá)到1%差異水平；除丙二醛含量、可溶性糖含量外，其余5個性狀在自交系與Pro濃度互作間達(dá)到1%差異水平；另外，除可溶性糖含量外，其余6個性狀在自交系與GB濃度互作間達(dá)到1%差異水平。說明苗期低溫脅迫下，添加不同濃度的外源Pro或GB可顯著影響玉米的生理生化特性，且苗期低溫脅迫下，不同玉米自交系對外源Pro或GB的敏感程度不同，耐寒性越弱的玉米自交系對外源Pro或GB的敏感程度越強(qiáng)。

表1 低溫脅迫下添加不同外源調(diào)節(jié)物質(zhì)后各萌發(fā)性狀的方差分析

注：“**”或“*”分別表示“1%”或“5%”水平差異顯著。下同。

Note: “**”or “*” indicated significant difference at “1%” or “5%” level. The same as below.

表2低溫脅迫下添加不同外源調(diào)節(jié)物質(zhì)后各幼苗性狀的方差分析

Table 2 Variance analysis of seedling traits with ifferent exogenous regulating substances under low temperature

變異來源 Variance sourceRCMDAProSSSODPODCAT外源脯氨酸 Proline (Pro)自交系 Inbred line11.984??46.054??312.366??134.232??13.260??78.938??48.127??濃度 Concentration512.214??89.179??337.601??331.241??785.197??451.377??298.023??自交系×濃度Inbred line×Concentration 9.516??1.8538.272??1.9273.484??4.141??7.445??外源甜菜堿 Glycine betaine (GB)自交系 Inbred line81.142??348.297??391.926??8.664??518.049??192.384??79.917??濃度 Concentration953.580??279.797??680.027??18.874??1796.622??1000.609??294.633??自交系×濃度Inbred line×Concentration 8.252??5.255??4.888??1.63628.827??5.981??10.716??

2.2 低溫脅迫下不同外源調(diào)節(jié)物質(zhì)對玉米種子萌發(fā)的影響

玉米種子萌發(fā)時對溫度較為敏感，由圖1可知，CK(-)低溫脅迫處理明顯抑制玉米種子萌發(fā)(P<0.05)，與CK(+)常溫處理相比，CK(-)處理下，3份玉米種子的發(fā)芽勢、發(fā)芽率、胚芽長、胚根長、胚芽鮮重和胚根鮮重等6個萌發(fā)性狀分別降低了76.44%、63.08%、68.09%、71.91%、54.06%和83.20%。低溫脅迫下添加外源Pro或GB能有效地促進(jìn)玉米種子萌發(fā)，較CK(-)處理相比，其各萌發(fā)性狀都顯著升高(P<0.05)，但不同濃度外源Pro或GB對各萌發(fā)性狀的緩解程度不同。由圖1可知，就外源Pro而言，T4(800μmol·L-1)或T3(600μmol·L-1)濃度的Pro處理時，玉米的發(fā)芽勢、發(fā)芽率、胚芽長或胚根長、胚芽鮮重、胚根鮮重達(dá)最大，分別是CK(-)低溫脅迫處理的4.61、2.66、3.15或2.47、1.75、2.80倍，分別是CK(+)常溫處理的108.69%、98.21%、100.52%或 111.32%、81.08%、46.99%；而T1(200μmol·L-1)或T5(600μmol·L-1)濃度的Pro處理時，玉米的發(fā)芽勢、發(fā)芽率或胚芽長、胚根長、胚芽鮮重、胚根鮮重達(dá)最小，分別是CK(-)低溫脅迫處理的2.54、1.96或2.21、1.40、1.11、1.91倍，分別是CK(+)常溫處理的59.75%、72.21%或70.44%、 39.42%、51.11%、32.08%。就外源GB而言，T2*(20μmol·L-1)或T3*(30μmol·L-1)或T1*(10μmol·L-1)濃度的GB處理時，玉米的發(fā)芽勢、胚芽長、胚根鮮重或發(fā)芽率或胚根長、胚芽鮮重達(dá)最大，分別是CK(-)低溫脅迫處理的4.73、2.54、3.15或2.05或1.23、1.38倍，分別是CK(+)常溫處理的108.69%、46.99%、100.52%或75.71%或34.64%、63.23%；T5*(50μmol·L-1)或T1*(10μmol·L-1)濃度的GB處理時，玉米的發(fā)芽勢、胚芽長、胚根長、胚芽鮮重、胚根鮮重或發(fā)芽率達(dá)最小，分別是CK(-)低溫脅迫處理的1.38、0.48、0.78、0.09、1.06或1.23倍，分別是CK(+)常溫處理的32.62%、15.22%、21.89%、20.71%、17.79%或45.35%。

注：不同小寫字母分別表示同一自交系不同處理下5%水平差異顯著。下同。 Note: Different lowercase letters in the same inbred line indicated significant difference at 5% level. The same as below.圖1 低溫脅迫下不同外源調(diào)節(jié)物質(zhì)對玉米種子萌發(fā)的影響Fig. 1 Effects of different exogenous regulating substances (Pro or GB) on maize seed germination under low temperature

2.3 低溫脅迫下不同外源調(diào)節(jié)物質(zhì)對玉米幼苗生理生化特性的影響

玉米幼苗遭受低溫傷害時，其體內(nèi)一系列生理生化代謝發(fā)生紊亂，幼苗明顯受到傷害。由圖2可知，CK(-)低溫脅迫處理下，玉米幼苗葉片的7個生理生化性狀都明顯升高(P<0.05)，分別是CK(+)常溫處理的5.83、3.19、2.00、1.93、4.72、2.84和3.06倍。低溫脅迫下添加外源Pro或GB可明顯降低玉米葉片的相對電導(dǎo)率和丙二醛含量，可明顯升高玉米葉片的脯氨酸含量、可溶性糖含量及3種保護(hù)酶(SOD、POD和CAT)活性，且不同濃度外源Pro或GB對各生理生化性狀的影響程度不同。由圖2可知，就外源Pro而言，T2(400μmol·L-1)或T4(800μmol·L-1)或T5(1000μmol·L-1)濃度的Pro處理時，玉米葉片的可溶性糖含量、SOD、POD及CAT活性或相對電導(dǎo)率、脯氨酸含量或丙二醛含量達(dá)最高，分別是CK(-)低溫脅迫處理的130.30%、142.68%、128.32%、200.71%或61.55%、136.12%或59.89%，分別是CK(+)常溫處理的2.51、6.73、3.65、6.13或3.59、2.72或1.91倍；T1(200μmol·L-1)或T2(400μmol·L-1)或T5(1000μmol·L-1)濃度的Pro處理時，玉米葉片的脯氨酸含量或相對電導(dǎo)率、丙二醛含量或可溶性糖含量、SOD、POD及CAT活性達(dá)最低，分別是CK(-)低溫脅迫處理的104.48%或37.05%、35.78%或100.15%、115.32%、101.69%、113.89%，分別是CK(+)常溫處理的2.09或2.15、1.14或1.93、5.44、2.89、3.48倍。就外源GB而言，T5*(50μmol·L-1)或T1*(10μmol·L-1)濃度的GB處理時，玉米葉片的相對電導(dǎo)率、丙二醛含量或脯氨酸含量、可溶性糖含量、SOD、POD及CAT活性達(dá)最高，分別是CK(-)低溫脅迫處理的63.23%、107.89%或120.77%、129.38%、105.69%、125.34%、155.94%，分別是CK(+)常溫處理的3.69、3.44或2.41、2.49、4.98、3.56、4.77倍；T1*(10μmol·L-1)或T5*(50μmol·L-1)濃度的GB處理時，玉米葉片的相對電導(dǎo)率、丙二醛含量或脯氨酸含量、可溶性糖含量、SOD、POD及CAT活性達(dá)最低，分別是CK(-)低溫脅迫處理的39.76%、62.79%或102.89%、108.29%、89.99%、100.51%、109.41%，分別是CK(+)常溫處理的2.31、2.00或2.05、2.09、4.25、2.86、3.35倍。

圖2 低溫脅迫下添加不同外源調(diào)節(jié)物質(zhì)對玉米生理生化指標(biāo)的影響Fig.2 Effects of different exogenous regulating substances (Pro or GB) on maize physiological and biochemical indexes under low temperature

2.4 低溫脅迫下添加不同外源調(diào)節(jié)物質(zhì)后玉米相關(guān)性狀的低溫緩解指數(shù)

由表3可知，萌發(fā)期低溫脅迫下不同濃度的外源Pro或GB對玉米各萌發(fā)性狀的緩解方向和大小存在差異，其EI值不盡相同(P<0.05)。就外源Pro而言，低溫脅迫下T4(800μmol·L-1)濃度的外源Pro作用下玉米發(fā)芽勢、發(fā)芽率、胚芽長的EI值最大，分別為1.116、0.966和1.013，T3(600μmol·L-1)濃度的外源Pro作用下玉米胚根長的EI值最大，為0.579，T2(400μmol·L-1)濃度的外源Pro作用下玉米胚芽鮮重的EI值最大，為0.620，T3(600μmol·L-1)或T4(800μmol·L-1)濃度的外源Pro作用下玉米胚根鮮重的EI值最大，都為0.365；低溫脅迫下T1(200μmol·L-1)濃度的外源Pro作用下玉米發(fā)芽勢、發(fā)芽率的EI值最小，分別為0.473和0.554，T5(1000μmol·L-1)濃度的外源Pro作用下玉米胚芽長、胚根長、胚芽鮮重、胚根鮮重的EI值最小，分別為0.559、0.163、0.091、0.184。就外源GB而言，低溫脅迫下T2*(20μmol·L-1)濃度的外源GB作用下玉米發(fā)芽勢、胚芽長和胚根鮮重的EI值最大，分別為1.151、0.723和0.362，T1*(10μmol·L-1)濃度的外源GB作用下玉米胚根長和胚芽鮮重的EI值最大，分別為0.091和0.314，T3*(30μmol·L-1)濃度的外源GB作用下玉米發(fā)芽率的EI值最大，為0.614；低溫脅迫下T5*(50μmol·L-1)濃度的外源GB作用下玉米發(fā)芽勢、胚芽長、胚根長、胚芽鮮重、胚根鮮重的EI值最小，分別為0.128、-0.081、-0.237、-0.794和0.005，T1*(10μmol·L-1)濃度的外源GB作用下玉米發(fā)芽率的EI值最小，為0.134。

表3 低溫脅迫下添加不同外源調(diào)節(jié)物質(zhì)后各萌發(fā)性狀的緩解指數(shù)

注：EI1～EI6：發(fā)芽勢，發(fā)芽率，胚芽長，胚根長，胚芽鮮重和胚根鮮重的緩解指數(shù)。同列測定值不同小寫字母分別表示5%水平差異顯著，下同。

Note: EI1～EI6: Ease index of GP, GR, PL, RL, SFW and RFW. Different lowercase letters in the same column indicated significant difference at 5% level. The same as below.

由表4可知，苗期低溫脅迫下，不同濃度的外源Pro或GB對玉米各幼苗生理生化性狀的緩解方向和大小存在差異，其EI值不盡相同(P<0.05)。就外源Pro而言，低溫脅迫下，T2(400μmol·L-1)濃度的外源Pro作用下玉米葉片相對電導(dǎo)率、丙二醛含量、可溶性糖含量、SOD、POD、CAT活性的EI值最大，分別為0.757、0.931、0.639、0.544、0.445和1.492，T4(800μmol·L-1)濃度的外源Pro作用下玉米葉片脯氨酸含量的EI值最大，為0.746；低溫脅迫下，T4(800μmol·L-1)濃度的外源Pro作用下玉米葉片相對電導(dǎo)率的EI值最小，為0.457，T1(200μmol·L-1)濃度的外源Pro作用下玉米葉片脯氨酸含量的EI值最小，為0.098，T5(1000μmol·L-1)濃度的外源Pro作用下玉米葉片丙二醛含量、可溶性糖含量、SOD、POD、CAT活性的EI值最小，分別為0.579、0.015、0.200、0.029和0.199。就外源GB而言，低溫脅迫下，T1*(10μmol·L-1)濃度的外源GB作用下7個生理生化性狀的EI值都最大，分別為0.727、0.542、0.420、0.627、0.069、0.399和0.820，低溫脅迫下，T3*(30μmol·L-1)濃度的外源GB作用下玉米葉片相對電導(dǎo)率的EI值最小，為0.404，T5*(50μmol·L-1)濃度的外源GB作用下玉米葉片其余6個性狀的EI值最小，分別為-0.112、0.055、0.172、-0.133、0.010和0.136。

表4 低溫脅迫下添加不同外源調(diào)節(jié)物質(zhì)后各幼苗性狀的緩解指數(shù)

注：*EI1～EI7表示相對電導(dǎo)率，丙二醛含量，脯氨酸含量，可溶性糖含量，SOD活性，POD活性和CAT活性的緩解指數(shù)。

Note:*EI1～EI7 indicate ease index of RC, MDA, Pro, SS, SOD, POD and CAT.

2.5 不同外源調(diào)節(jié)物質(zhì)低溫緩解綜合評價

以萌發(fā)或幼苗相關(guān)性狀的EI值作為外源Pro或GB低溫緩解綜合評價指標(biāo)，采用隸屬函數(shù)法，對低溫脅迫下不同濃度外源Pro或GB的低溫緩解效果進(jìn)行科學(xué)、客觀、綜合評價。由表5可知，就外源Pro而言，萌發(fā)期低溫脅迫下，外源Pro對玉米的綜合低溫緩解效果隨Pro濃度的增大而呈先增強(qiáng)后降低的趨勢；T3和T4(600μmol·L-1和800μmol·L-1)濃度的外源Pro對玉米的綜合低溫緩解效果最佳(P<0.05)，都為0.882；T5(1000μmol·L-1)濃度的外源Pro對玉米的綜合低溫緩解效果最小(P<0.05)，為0.513。就外源GB而言，萌發(fā)期低溫脅迫下，外源GB對玉米的綜合低溫緩解效果也隨GB濃度的增大而呈先增強(qiáng)后降低的趨勢；T2*(20μmol·L-1)濃度的外源GB對玉米的綜合低溫緩解效果最佳(P<0.05)，為0.647；T5(50μmol·L-1)濃度的外源GB對玉米的綜合低溫緩解效果最小(P<0.05)，僅為0.022。就外源Pro和GB比較而言，萌發(fā)期低溫脅迫下，各濃度外源Pro對玉米的綜合低溫緩解效果遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于外源GB對玉米的綜合緩解效果，前者為后者的1.858倍。

由表6可知，就外源Pro而言，苗期低溫脅迫下，外源Pro對玉米的綜合低溫緩解效果隨Pro濃度的增大而呈先增強(qiáng)后降低的趨勢；T2(400μmol·L-1)濃度的外源Pro對玉米的綜合低溫緩解效果最佳(P<0.05)，為0.577；T5(1000μmol·L-1)濃度外源Pro對玉米的綜合低溫緩解效果最小(P<0.05)，僅為0.246。就外源GB而言，苗期低溫脅迫下，外源Pro對玉米的綜合低溫緩解效果隨GB濃度的增大而呈降低的趨勢；T1*(10μmol·L-1)濃度的外源GB對玉米的綜合低溫緩解效果最佳(P<0.05)，為0.500；T4(40μmol·L-1)濃度的外源GB對玉米的綜合低溫緩解效果最小(P<0.05)，為0.289。就外源Pro和GB比較而言，各濃度外源Pro對玉米的綜合低溫緩解效果與各濃度外源GB對玉米的綜合低溫緩解效果差異不大，前者僅為后者的1.064倍。

表5 萌發(fā)期低溫脅迫下不同外源調(diào)節(jié)物質(zhì)的緩解效果綜合評價

表6 苗期低溫脅迫下不同外源調(diào)節(jié)物質(zhì)的緩解效果綜合評價

3 結(jié)論與討論

3.1 外源Pro或GB對低溫脅迫下玉米種子萌發(fā)和幼苗生理生化特性的影響

從播種到幼苗形態(tài)建成是玉米最容易遭受低溫冷害的關(guān)鍵時期。本試驗(yàn)研究表明這一階段低溫冷害能顯著抑制玉米種子萌發(fā)，其發(fā)芽勢、發(fā)芽率、胚芽長，胚根長、胚芽鮮重、胚根鮮重顯著降低，這與陳銀萍等[22]的研究結(jié)果相一致。幼苗葉片膜脂過氧化程度、活性氧清除能力及滲透調(diào)節(jié)能力均增強(qiáng)，其相對電導(dǎo)率、丙二醛含量、脯氨酸含量、可溶性糖含量顯著增加，SOD、POD、CAT活性顯著增強(qiáng)，這與前人的研究結(jié)果相一致[23-24]。植物遭受低溫逆境脅迫時，外源Pro或GB可以作為滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)參與植物細(xì)胞的滲透調(diào)節(jié)，亦可作為滲透保護(hù)物質(zhì)進(jìn)而提高植物的抗逆能力[25-26]。本試驗(yàn)研究表明，外源Pro或GB對低溫脅迫下玉米種子的萌發(fā)具有一定的提高，其發(fā)芽勢、發(fā)芽率、胚芽長、胚根長、胚芽鮮重和胚根鮮重都顯著高于對照CK(-)，這與韓冬芳等[27]、劉俊英[28]的研究相一致；外源Pro或GB對低溫脅迫下玉米幼苗的傷害具有一定的緩解能力，其相對電導(dǎo)率和丙二醛含量顯著降低，脯氨酸含量、可溶性糖含量顯著升高，SOD、POD和CAT活性顯著增強(qiáng)，這與劉俊英[28]、Coughlan等[29]的研究結(jié)果一致。另外，本試驗(yàn)研究還表明不同濃度的外源Pro或GB顯著影響玉米種子的6個萌發(fā)性狀和7個幼苗生理生化性狀，且不同玉米對Pro或GB的敏感程度不同，耐寒性越弱的玉米對外源Pro或GB的敏感程度越強(qiáng)，萌發(fā)期和苗期低溫脅迫下，添加外源Pro或GB后玉米種子的6個萌發(fā)性狀和7個幼苗生理生化性狀在自交系間差異顯著，在Pro或GB濃度間差異顯著，在自交系與Pro或GB濃度間互作間差異顯著。

3.2 不同玉米生育時期外源Pro或GB對低溫脅迫緩解的綜合評價

外源Pro或GB對逆境脅迫下植物的逆境緩解的研究已有相關(guān)報道。如馬文廣等[16]研究表明外源Pro浸種能顯著促進(jìn)煙草種子發(fā)芽，提高低溫逆境下幼苗根長、苗高、幼苗干鮮重及SOD、POD、CAT和APX活性，10mg/L Pro綜合效果較好，可作為提高煙草種子及幼苗抗寒性的處理方法。梁小紅等[17]研究表明外源GB能夠有效緩解低溫脅迫下結(jié)縷草葉綠素含量的下降，減少電解質(zhì)滲透率和丙二醛含量的升高，顯著提高SOD、POD、CAT和APX的活性、可溶性糖含量和脯氨酸含量，外施100mmol/L GB對提高結(jié)縷草的耐低溫能力的效果最為顯著。劉俊英[28]研究表明鹽脅迫下加入外源Pro或GB后，加工番茄的幼苗地上部鮮重、地下部鮮重、株高顯著增加，幼苗葉片的丙二醛含量顯著降低，脯氨酸含量、可溶性糖含量、抗壞血酸含量顯著升高，SOD、POD、CAT及APX活性顯著增強(qiáng)，且1～5mmol·L-1GB和1mmol·L-1Pro都能夠很好地降低和緩解鹽脅迫對加工番茄植株的傷害。沙漢景[30]研究表明15～45mmol·L-1Pro浸種能提高鹽脅迫下水稻的發(fā)芽勢和發(fā)芽率，15和30mmol·L-1Pro浸種顯著提高鹽脅迫下水稻種子的α-淀粉酶和β-淀粉酶，而適宜濃度的Pro可顯著增加水稻葉片的可溶性糖含量、脯氨酸含量，并顯著增強(qiáng)水稻葉片的SOD、POD及CAT活性。這些研究雖然揭示了外源Pro或GB對逆境脅迫下各性狀的影響，或定性研究了外源Pro、GB對逆境脅迫的最佳緩解效果，但不能定量揭示外源Pro或GB對逆境脅迫的最佳緩解效果和大小。

為了揭示外源Pro或GB對低溫脅迫下玉米萌發(fā)期、苗期的最佳緩解效果和大小，本試驗(yàn)根據(jù)各萌發(fā)性狀及幼苗生理生化性狀，新定義了這些性狀的外源Pro或GB低溫緩解指數(shù)EI，并以EI為綜合低溫緩解指標(biāo)，采用隸屬函數(shù)法，科學(xué)、客觀、綜合評價外源Pro或GB對玉米的低溫緩解效果及大小。此方法不僅可以綜合各相關(guān)性狀，科學(xué)、客觀、綜合評價不同濃度外源Pro或GB的低溫緩解效果，而且在相同的試驗(yàn)處理下可以比較不同外源Pro或GB的綜合低溫緩解效果。用此方法綜合評價表明，萌發(fā)期，600和800μmol·L-1Pro或20μmol·L-1GB的綜合低溫緩解效果最佳為0.882或0.647，1000μmol·L-1Pro或50μmol·L-1GB的綜合緩解效果最小為0.513或0.022；苗期，400μmol·L-1Pro或10μmol·L-1GB的綜合低溫緩解效果最佳為0.577或0.500，1000μmol·L-1Pro或40μmol·L-1GB的綜合低溫緩解效果最小僅為0.246或0.289。萌發(fā)期和苗期，外源Pro的綜合低溫緩解效果是外源GB的1.858或1.064倍。

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