黑桃轉(zhuǎn)錄組微衛(wèi)星特征分析

劉麗麗 李建輝 鄭雪良 陳駿 楊海英 劉春榮

（浙江省衢州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院衢州324000）

黑桃是原產(chǎn)于我國(guó)浙西山區(qū)的一個(gè)稀有地方特色桃品種，又名烏桃，屬南方品種群硬肉桃亞群[1，2]。黑桃果實(shí)皮紫肉紅，汁液豐富，酸甜適中，口感爽脆獨(dú)特，具有濃郁的蜂蜜風(fēng)味及較高的藥用和保健價(jià)值，是目前非常稀少的集食用和保健于一體的珍貴水果。因此，隨著人們營(yíng)養(yǎng)和保健意識(shí)的增強(qiáng)，黑桃必將日益受到消費(fèi)者的親睞，發(fā)展前景十分廣闊。

近年來(lái)，隨著分子生物學(xué)研究的不斷深入和實(shí)踐應(yīng)用的快速發(fā)展，DNA分子標(biāo)記技術(shù)在桃研究中的應(yīng)用越趨廣泛[3，4]。微衛(wèi)星（Microsatellite）又稱(chēng)簡(jiǎn)單序列重復(fù)（simple sequence repeat，SSR），是一類(lèi)由幾個(gè)核苷酸（ 1～6bp）組成的串聯(lián)重復(fù)DNA序列，廣泛分布于各類(lèi)真核生物和部分原核生物基因組中，由于重復(fù)基元和次數(shù)不同從而形成了等位基因之間的多態(tài)性[5～7]。相比較其他分子標(biāo)記而言，微衛(wèi)星標(biāo)記具有較高的多態(tài)性和較好的重復(fù)性，同時(shí)還具有進(jìn)化所受選擇壓力小、共顯性遺傳、易于分析等特點(diǎn)[8，9]，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于分子生物學(xué)、遺傳學(xué)、育種學(xué)等領(lǐng)域[10～12]。

為此，本文利用IlluminaHiseqTM2500/MiSeqTM高通量測(cè)序平臺(tái)對(duì)黑桃轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行雙向測(cè)序，并對(duì)其微衛(wèi)星序列特征進(jìn)行分析，以期為后續(xù)開(kāi)展黑桃種質(zhì)資源創(chuàng)新和利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

2016年 9月在衢州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院果樹(shù)研究所試驗(yàn)基地采集黑桃健康幼嫩葉片，擦拭干凈后用液氮迅速冷凍，再裝入放有足量干冰的低溫貯藏箱中送至上海翰宇生物科技有限公司利用IlluminaHiseqTM2500/MiSeqTM高通量測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組雙向測(cè)序。

1.2 分析方法

從黑桃葉片中提取總RNA，使用2100Bioanalyzer對(duì)總RNA進(jìn)行質(zhì)檢，并對(duì)合格RNA樣本利用DNaseI（Takara，日本）在37℃消化30min。DNase消化后的RNA利用Dynabeads?Oligo(dT)25（Life，美國(guó)）進(jìn)行mRNA純化。將得到的RNA補(bǔ)足至100μl的體積，加100μl Binding Buffer，65℃加熱2min，立即置冰上冷卻，加入100μl預(yù)洗滌過(guò)的磁珠，室溫下充分混勻5min，置磁力架（Life，美國(guó)）上1～2 m i n，將上清吸取干凈，加200μl Washing Buffer B洗滌兩次后，加15μl預(yù)冷的10 mM Tris-HCl重懸磁珠，75℃～80℃加熱2min，立即置磁力架上1～2min，小心吸取上清，即為純化得到的mRNA。取100ng 純化的mRNA，用NEBNext?UltraTMRNA Library Prep Kit for Illumina（NEB，美國(guó)）構(gòu)建文庫(kù)。文庫(kù)構(gòu)建完成后，經(jīng)Qubit 定量、2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)、High-sensitivity DNA chip檢測(cè)，確保文庫(kù)質(zhì)量。取10ng 的文庫(kù)，用TruSeq PE Cluster Kit（illumina，美國(guó)）在cBot中進(jìn)行cluster generation，然后在IlluminaHiseqTM2500/MiSeqTM中進(jìn)行雙向測(cè)序。高通量測(cè)序得到的原始圖像數(shù)據(jù)文件經(jīng)CASAVA堿基識(shí)別（Base Calling）分析轉(zhuǎn)化為原始測(cè)序序列（Sequenced Reads），結(jié)果以FASTQ文件格式存儲(chǔ)。同時(shí)，為了保證信息分析質(zhì)量，再對(duì)原始數(shù)據(jù)過(guò)濾，得到Clean數(shù)據(jù)，后續(xù)分析都基于Clean數(shù)據(jù)，使用Trimmomaticv0.32[13]進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。隨后，使用Fastqc v0.10.0[[14]對(duì)樣品的測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量進(jìn)行可視化評(píng)估。最后對(duì)黑桃轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果采用MIcroSAt，使用Trinityv2.06[15]將clean數(shù)據(jù)denovo組裝成轉(zhuǎn)錄本。

對(duì)黑桃轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果采用MIcroSAt -ellite（MISA）軟件（http://pgrc.ipkgatersleben.de/misa/）搜索SSR重復(fù)序列，設(shè)定單核苷酸、二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸和六核苷酸最少重復(fù)分別為12、6、4、4、3和3次。復(fù)合SSR 兩個(gè)位點(diǎn)間最大間隔堿基數(shù)為100。

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序組裝結(jié)果及統(tǒng)計(jì)

對(duì)黑桃轉(zhuǎn)錄組測(cè)序共得到30536554個(gè)cleanreads，總數(shù)據(jù)量9.16 G。將clean數(shù)據(jù)denovo組裝成轉(zhuǎn)錄本，再對(duì)轉(zhuǎn)錄本去冗余，取每個(gè)轉(zhuǎn)錄本聚類(lèi)中最長(zhǎng)的作為Unigene，以此作為后續(xù)分析的參考序列。轉(zhuǎn)錄本及Unigene統(tǒng)計(jì)結(jié)果如表1所示，從中可以看出，黑桃轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果共組裝得到79161個(gè)轉(zhuǎn)錄本，去冗余后得到39120個(gè)Unigene，長(zhǎng)度介于224～16849，平均長(zhǎng)度為1019.17。

2.2 不同重復(fù)基元微衛(wèi)星的類(lèi)型

表1 黑桃轉(zhuǎn)錄組測(cè)序組裝結(jié)果統(tǒng)計(jì)

采用MISA軟件共搜索到11182個(gè)SSR，可分為7種類(lèi)型：復(fù)雜重復(fù)、單堿基重復(fù)、二堿基重復(fù)、三堿基重復(fù)、四堿基重復(fù)、五堿基重復(fù)、六堿基重復(fù)，數(shù)量分別為978個(gè)、4492個(gè)、3927個(gè)、1597個(gè)、127個(gè)、33個(gè)、28個(gè)，表明黑桃轉(zhuǎn)錄組中SSR重復(fù)基元類(lèi)型的數(shù)量主要以單堿基重復(fù)、二堿基重復(fù)以及三堿基重復(fù)為主，其他類(lèi)型的數(shù)量相對(duì)較少。

2.3 不同重復(fù)基元微衛(wèi)星的頻率

從黑桃轉(zhuǎn)錄組序列中單堿基基元重復(fù)次數(shù)總體分布情況來(lái)看（表2），單堿基微衛(wèi)星重復(fù)以(A)n和(T)n為主，數(shù)量分別為2179個(gè)、2287個(gè)，其中(T)n微衛(wèi)星重復(fù)的數(shù)量略多于(A)n。此外，單堿基重復(fù)次數(shù)主要集中在10個(gè)至14個(gè)，堿基重復(fù)數(shù)在15個(gè)以上的相對(duì)較少。黑桃轉(zhuǎn)錄組序列中二堿基重復(fù)有(AC)n、(AG)n、(AT)n、(CA)n、(CT)n、(GA)n、(GT)n、(TA)n、(TC)n、(TG)n，數(shù)量分別為 73、862、384、62、664、782、44、272、684、100，其中以(TC)n最多，(AG)n次之，(GT)n最少。黑桃轉(zhuǎn)錄組序列中三堿基重復(fù)以(GAA)n、(TTC)n、(AAG)n數(shù)量相對(duì)較多。

表2 黑桃轉(zhuǎn)錄組序列中SSR單堿基基元重復(fù)次數(shù)的分布

2.4 微衛(wèi)星的長(zhǎng)度分布

黑桃轉(zhuǎn)錄組序列中所發(fā)現(xiàn)的微衛(wèi)星長(zhǎng)度存在較大的差異，從10～213個(gè)堿基不等，平均長(zhǎng)度為22.5個(gè)堿基?？傮w而言，黑桃轉(zhuǎn)錄組序列中的微衛(wèi)星以重復(fù)長(zhǎng)度小于或等于20bp的短重復(fù)序列最多，占微衛(wèi)星總數(shù)的65.65%，而長(zhǎng)度大于20bp的長(zhǎng)序列重復(fù)僅占微衛(wèi)星總數(shù)的34.35%。

3 討論

微衛(wèi)星標(biāo)記具有較強(qiáng)的物種保守性和專(zhuān)一性，不同物種微衛(wèi)星側(cè)翼序列有所不同，從而限制了微衛(wèi)星引物的通用性，因此要對(duì)一個(gè)物種進(jìn)行微衛(wèi)星分析，通常需要預(yù)先開(kāi)發(fā)這個(gè)物種的微衛(wèi)星標(biāo)記[16]。目前，開(kāi)發(fā)微衛(wèi)星標(biāo)記的方法較多，但普遍存在步驟繁瑣、效率低、耗時(shí)長(zhǎng)等問(wèn)題。近年來(lái)，對(duì)轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行高通量測(cè)序已成為一種高效、快捷的獲得基因序列的研究手段，基于該技術(shù)進(jìn)行微衛(wèi)星標(biāo)記開(kāi)發(fā)具有信息量大和通用性好的特點(diǎn)，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于不同物種的微衛(wèi)星引物開(kāi)發(fā)[17，18]。

另一方面，微衛(wèi)星序列對(duì)基因的功能會(huì)產(chǎn)生重要影響，其序列特征是了解不同物種基因組差異的重要指標(biāo)[19]。從本研究結(jié)果來(lái)看，黑桃轉(zhuǎn)錄組共有11182個(gè)SSR，可分為7種類(lèi)型：復(fù)雜重復(fù)、單堿基重復(fù)、二堿基重復(fù)、三堿基重復(fù)、四堿基重復(fù)、五堿基重復(fù)、六堿基重復(fù)，其中單堿基重復(fù)、二堿基重復(fù)以及三堿基重復(fù)占多數(shù)，其他類(lèi)型的數(shù)量相對(duì)較少。黑桃轉(zhuǎn)錄組序列中單堿基微衛(wèi)星重復(fù)以(A)n和(T)n為主，二堿基重復(fù)以(TC)n、(AG)n數(shù)量較多，三堿基重復(fù)以(GAA)n、(TTC)n、(AAG)n數(shù)量較多。黑桃轉(zhuǎn)錄組微衛(wèi)星呈現(xiàn)出單堿基重復(fù)較多且單堿基重復(fù)主要以(A)n和(T)n為主的分布特征，表明單堿基在整個(gè)黑桃轉(zhuǎn)錄組中變異最為活躍，這在其他植物中也有類(lèi)似的報(bào)道[20，21]。此外，黑桃轉(zhuǎn)錄組序列中微衛(wèi)星長(zhǎng)度介于10～213個(gè)堿基，其中以重復(fù)長(zhǎng)度小于或等于20 bp的短重復(fù)序列最多，這與碧桃（Prunus persicacv.duplex）的研究結(jié)果基本一致[19]。

對(duì)黑桃進(jìn)行微衛(wèi)星標(biāo)記開(kāi)發(fā)，不僅可用于其種質(zhì)資源創(chuàng)新和利用，而且可為桃屬其他植物提供重要分子工具，因而具有廣泛的應(yīng)用前景。本研究對(duì)黑桃轉(zhuǎn)錄組微衛(wèi)星特征的分析可為后續(xù)開(kāi)發(fā)微衛(wèi)星標(biāo)記提供重要參考。從研究結(jié)果來(lái)看，在開(kāi)發(fā)黑桃微衛(wèi)星標(biāo)記過(guò)程中，推薦開(kāi)發(fā)(A)n和(T)n為主的單堿基微衛(wèi)星、(TC)n或(AG)n為主的二堿基微衛(wèi)星以及(GAA)n或(TTC)n或(AAG)n為主的三堿基微衛(wèi)星，這些微衛(wèi)星在黑桃基因組中出現(xiàn)的頻率較高，有助于提高引物開(kāi)發(fā)效率。

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