厚樸酚對大鼠實驗性牙周炎骨吸收抑制作用的研究

李春年

牙周炎是以細菌為主的多種因素作用下，牙周組織發(fā)生的破壞性、感染性的疾病，主要的臨床特征為牙齒松動移位，主要原因為牙槽骨的吸收;牙周病隨年齡增長發(fā)病率不斷升高，隨著我國人口老齡化的加快和人們對疾病治療的重視，我們口腔醫(yī)生將面對越來越多的牙周疾病患者;我們在利用經典的牙周治療手段給予患者積極治療的同時，如何利用藥物鞏固牙周治療的效果是我們要面對的主要問題。

厚樸是一味傳統(tǒng)中藥，有化濕導滯、行氣平喘、化食消痰、驅風鎮(zhèn)痛的功效。厚樸酚(magnolol)是厚樸的主要活性成分，具有抗菌、消炎、鎮(zhèn)痛等多種藥理作用，目前已知的在口腔中的主要作用為抑制變形鏈球菌等致齲菌，但在牙周治療方面的作用少見報道;厚樸酚是否能通過抑制牙周炎致病菌、改變牙周局部的骨保護因子(osteoprotegerin，OPG)、破骨細胞核因子κB受體活化因子配體(ligand of receptor activator of NF-κB，RANKL)水平進而抑制牙槽骨的骨吸收，是本實驗的研究目的。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、藥物與試劑

SD雄性大鼠［河北醫(yī)科大學實驗動物中心提供，許可證號:SCXK(冀)2013-1-003(編號:1401042)］;厚樸酚(西安開來生物工程公司，批號:K131022);大鼠骨保護因子抗體(OPG，武漢博士德公司);大鼠破骨細胞核因子κB受體活化因子配體(RANKL，武漢博士德公司)。

1.2 實驗分組

選取3月齡雄性SD大鼠65只，排除麻醉意外死亡、飼養(yǎng)死亡、建模抽檢等因素，最終入選50只隨機分為5組，每組10只，正常組(A組)、實驗性牙周炎組(B組)、實驗性牙周炎局部治療組(C組)、實驗性牙周炎厚樸酚治療組(D組)、實驗性牙周炎局部+厚樸酚治療組(E組)。

1.3 動物模型建立

B、C、D、E組大鼠10%水合氯醛腹腔麻醉，以0.2 mm的正畸鋼絲穿過第一二磨牙間隙，結扎雙側上頜第一磨牙，建立實驗性大鼠牙周炎模型。

1.4 動物模型鑒定

牙周結扎后1周，隨機抽取大鼠檢查鋼絲是否牢固，檢查牙周狀況，可見結扎絲周圍軟垢堆積，牙齦紅腫。牙周結扎后四周，隨機抽取大鼠12只，檢查牙周狀況可見牙齦紅腫、探診易出血、可探及牙周袋，處死大鼠，取上頜骨制作牙周牙髓聯合HE染色切片，可以觀察到牙周袋形成，結合上皮向根方增殖。

1.5 分組處理

正常組(A組):正常飼養(yǎng)12周，不處理;實驗性牙周炎組(B組):牙周結扎4周建立牙周炎模型，牙周炎模型成功后，繼續(xù)原條件飼養(yǎng)8周;實驗性牙周炎局部治療組(C組):牙周結扎4周建立牙周炎模型，牙周炎模型成功后，麻醉下去除結扎絲，建立牙周炎治療模型，清潔牙周局部，沖洗、上碘甘油，每周牙周局部治療，觀察8周;實驗性牙周炎厚樸酚治療組(D組):牙周結扎4周建立牙周炎模型，牙周炎模型成功后，按300 mg厚樸酚/kg體重大鼠灌胃8周;實驗性牙周炎局部+厚樸酚治療組(E組):在C組的基礎上，同時按300 mg厚樸酚/kg體重大鼠灌胃8周。

1.6 牙周組織切片的制作及觀察

大鼠10%水合氯醛腹腔麻醉下，股動脈放血處死，迅速取上頜骨，置于4%甲醇液固定標本48 h，流動水沖洗24 h，于10%EDTA脫鈣液中8周，修整組織塊，常規(guī)包埋，沿第一磨牙近遠中方向，厚度5μm連續(xù)切片。常規(guī)HE染色切片，置于光鏡下觀察牙周組織變化。

1.7 牙周組織免疫組化檢測及OPG、RANKL的測定

將牙周組織切片進行脫蠟，0.05%胰蛋白酶進行抗原修復，按照試劑步驟要求，分別加入過氧化物酶阻斷劑、兔抗大鼠抗體、DAB顯色，封片進行觀察。

OPG、RANKL免疫組化染色為陽性的標準細胞漿染色黃色或棕黃色，根據染色程度分為:無染色為陰性(－)，染色為淺棕黃色的為弱陽性(+)，染色為中等棕黃色的為陽性(++)，染色為深棕黃色的為強陽性(+++)。采用專業(yè)圖像分析軟件麥克奧迪數碼圖像分析軟件進行牙周組織的陽性染色的半定量分析。在400倍鏡下選擇第一磨牙遠中的牙周膜及牙槽骨進行觀測，每個部位分層隨機抽樣選取5個區(qū)陽性區(qū)，測定吸光度值，根據結果計算該切片的平均吸光度值(A)。

1.8 統(tǒng)計學處理

使用SPSS軟件進行統(tǒng)計分處理，各組數據先進行正態(tài)性檢驗，符合正態(tài)性分布進行處理，實驗數據珋x±s表示，樣本t檢驗分析處理，檢驗標準α=0.05、P＜0.05有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 臨床檢查

A組牙齦無明顯變化，牙齦色澤正常，牙周探診正常;B組牙齦紅腫，鋼絲周圍牙石、軟垢堆積，探診出血，可探及深牙周袋;C組牙齦已不紅腫，探診不出血，牙周袋探診淺;D組牙齦已不紅腫，探診不出血，牙周袋可探及;E組牙齦已不紅腫，探診不出血，牙周袋探診已達正常深度(表1)。

表1 牙周袋深度Tab 1 The depth of periodontal pocket

2.2 組織學檢查

A組:結合上皮位于釉牙骨質界處，結締組織無炎癥細胞，牙周膜纖維排列規(guī)則，牙槽骨無吸收(圖1A);B組:結合上皮向根方增殖，形成較深牙周袋，結締組織內大量炎癥細胞浸潤，牙周膜纖維排列紊亂，血管擴張，牙槽骨吸收，可見骨吸收陷窩(圖1B);C組:結合上皮向根方少量增殖，有較淺牙周袋，結締組織內少量炎癥細胞浸潤，牙槽骨內成骨細胞多，破骨細胞少，有新生骨(圖1C);D組:結合上皮向根方增殖，牙周袋變淺，結締組織內少量炎癥細胞浸潤，牙槽骨內骨吸收停止，成骨細胞多，破骨細胞少(圖1D);E組:結合上皮恢復至釉牙骨質界處，結締組織未見炎癥細胞，牙周膜纖維恢復排列規(guī)則，牙槽骨見大量新生骨，成骨細胞多(圖1E)。

圖1 組織病理學觀察 (蘇木精－伊紅染色，×100)Fig 1 Histopathdogical examination (HE staning，×100)

2.3 免疫組化檢測

2.3.1 牙周組織中OPG的表達 OPG在牙周組織中，主要表達于牙周膜成纖維細胞、骨細胞、成骨細胞、血管內皮細胞等，陽性染色為黃色或棕黃色顆粒，E組與其他各組比較明顯升高(P＜0.05)，C、D組差別不大(P＞0.05)，C、D 組較 A、B 組明顯升高(P ＜0.05)(表 2，圖 2)。

表2 各組牙周組織中的OPG平均吸光度值Tab 2 The average optical density value of OPGin periodontal tissue

2.3.2 牙周組織中RANKL的表達 RANKL在牙周組織中，主要表達于牙周膜成纖維細胞、骨細胞、破骨細胞、血管內皮細胞等，陽性染色為黃色或棕黃色顆粒，E組與B、C、D各組比較明顯降低(P＜0.05)，C、D組差別不大(P＞0.05)，B組較其他各組明顯升高(P ＜0.05，表 3，圖 3)。

3 討論

厚樸酚是我國傳統(tǒng)中藥厚樸的主要成分［1－2］，屬聯苯酚類化合物，有抗菌抗炎的作用，對多種細菌都具有抑制作用。查閱文獻可以發(fā)現，近些年關于厚樸酚在口腔的應用的研究主要集中在對變形鏈球菌等致齲菌的抑制，進而抑制齲病的發(fā)展的角度;關于厚樸酚對牙周炎的治療作用未見報道。目前已有將厚樸酚加入牙膏中作為添加劑輔助抑制口腔中的致齲菌，能否通過本實驗發(fā)現厚樸酚對牙周炎的抑制作用，進而在治療牙周炎方面有新的思路和治療藥物是本研究的出發(fā)點。

牙周炎發(fā)生牙槽骨發(fā)生吸收破壞，隨著對骨吸收機制的研究，OPG、RANKL對成骨、破骨時的密切相關細胞因子［3］。OPG 是由成骨細胞基質細胞產生［4］，是唯一的破骨細胞負向調節(jié)因子［5］;主要作用于破骨細胞分化末期，具有抑制破骨細胞前體細胞分化、促進破骨細胞凋亡、進而增加骨的密度的功能［6］。RANKL是骨吸收時的關鍵細胞因子，在體外能夠誘導破骨細胞形成，在體內能夠促進破骨細胞成熟［7］。在骨組織中，受到骨吸收因子刺激后，RANKL能夠特異性識別破骨細胞前體細胞，刺激其分化成熟，進而促進破骨細胞產生，發(fā)揮骨吸收的作用［8］。成骨細胞可以表達OPG，OPG競爭性與RANKL結合，抑制了破骨細胞前體細胞的分化［9］，缺乏OPG的實驗動物會發(fā)生骨質疏松，體內加入OPG可以恢復骨密度［10］。OPG、RANKL在牙周組織中的表達受到多種免疫因素的影響，牙周致病菌牙齦卟啉菌可以通過激活淋巴細胞促進RANKL的表達［11］，引起破骨細胞的分化成熟。牙周組織中的RANKL活性增高與炎癥細胞T細胞、B細胞、巨噬細胞的刺激密切相關［12］，提示減少牙槽骨吸收首先需要抑制RANKL［13］，而抑制RANKL需要抑制牙周組織中炎癥細胞和牙周致病菌;只有促進OPG的生成，減少RANKL的產生，才能減少牙槽骨的吸收。

圖2 牙周組織中OPG的表達情況 (免疫組化，×400)Fig 2 OPG expression in periodontal tissue (IHC，×400)

表3 各組牙周組織中的RANKL平均吸光度值Tab 3 The average optical density value of RANKL in periodontal tissue

圖3 牙周組織中RANKL的表達 (免疫組化，×400)Fig 3 RANKL expression in periodontal tissues (IHC，×400)

作者前期的實驗研究也證實中藥對實驗性牙周炎的治療能夠升高牙周組織中的 OPG、降低RANKL［14］，并且中藥對牙周組織的保護作用效果也很顯著［15］。

在本研究中發(fā)現厚樸酚作為抗菌抗炎的單組份中藥提取物，作用穩(wěn)定持久;可以在牙周刺激物存在的情況下，取得與牙周局部治療相同的效果，明顯的抑制牙周組織中的RANKL，升高OPG，促進牙周組織中的骨再生;在牙周局部治療和厚樸酚共同作用下可以促進牙周完全恢復，可能與厚樸酚抗菌抗炎進而改善牙周局部的OPG、RANKL有很大關系。研究表明，厚樸酚對于牙周主要致病菌牙齦卟啉菌、中間普氏菌、伴放線桿菌菌具有抑制作用，提示對牙周炎具有潛力巨大的治療作用［16］。

厚樸酚作為傳統(tǒng)中藥，不僅具有抑菌抗炎作用，而且抗菌譜廣泛，不易產生抗藥性，價值低廉的優(yōu)點;在現今牙周病治療越來越受到重視的情況下，厚樸酚必將以其能夠抑制牙周致病菌，并能明顯改善牙周骨代謝而受到重視并大量應用于口腔臨床。

［1］ 劉麗，彭楓.和厚樸酚的抗腫瘤作用研究進展［J］.華西醫(yī)學，2006，21(3):629－630.

［2］ Watanabe K，Watanabe H，Goto Y，et al.Pharmacological properties of magnolol and honokiol extracted from Magnolia officinalis:Central depressant effects［J］.Planta Med，1983，49(2):103－108.

［3］ Boyce BF，Xing L.Osteoclasts，no longer osteoblast slaves［J］.Nat Med，2006，12(12):1356－1358.

［4］ Lin JM，Callon KE，Lin CQ，et al.Alteration of bone cell function by RANKL and OPG in different in vitro models［J］.Eur J Clin Invest，2007，37(5):407 －415.

［5］ Tanaka S，Nakamura K，Takahasi N，et al.Role of RANKL in physiological and pathological bone resorption and therapeutics targeting the RANKL-RANK signaling system［J］.Immunol Rev，2005，208:30－49.

［6］ Breitkreutz I，Raab MS，Vallet S，et al.Targeting MEK1/2 blocks osteoclast differentiation，function and cytokine secretion in multiple myeloma［J］.Br J Haematol，2007，139(1):55－63.

［7］ Loser K，Mehling A，Loeser S，et al.Epidermal RANKL controls regulatory T-cell numbers via activation of dendritic cells［J］.Nat Med，2006，12(12):1372 －1379.

［8］ Boyle WJ，Simonet WS，Lacey DL.Osteoclast differentiation and activation［J］.Nature，2003，423(6937):337 －342.

［9］ Wittrant Y，Theoleyre S，Couillaud S，et al.Relevance of an in vitro osteoclastogenesis system to study receptor activator of NF-kB ligand and osteoprotegerin biological activities［J］.Exp Cell Res，2004，293(2):292－301.

［10］ Bucay N，Sarosi I，Dunstan CR，et al.osteoprotegerin-deficient mice develop early onset osteoporosis and arterial calcification［J］.Genes Dev，1998，12(9):1260 －1268.

［11］ Nishijima Y，Yamaguchi M，Kojima T，et al.Levels of RANKL and OPG in gingival crevicular fluid during orthodontic tooth movement and effect of compression force on releases from periodontal ligament cells in vitro［J］.Orthod Craniofac Res，2006，9(2):63－70.

［12］ Taubman MA，Valverde P，Han X，et al.Immune Response:The Key to Bone Resorption in Periodontal Disease［J］.JPeriodontol，2005，76 Suppl 11S:2033 －2041.

［13］ Kawai T，Matsuyama T，Hosokawa Y，et al.B and T lymphocytes are the primary sources of RANKL in the bone resorptive lesion of periodontal disease［J］.Am J Pathol，2006，169(3):987－998.

［14］ 李春年，李淑娟，楊冬茹，等.左歸丸對實驗性骨質疏松牙周炎大鼠牙周組織 OPG、RANKL表達的影響［J］.實用口腔醫(yī)學雜志，2011，27(2):270－273.

［15］ 葛超，楊冬茹，武明軒，等.槲皮素對實驗性牙周炎大鼠牙周組織的保護作用［J］.實用口腔醫(yī)學雜志，2015，31(5):619－622.

［16］ Ho KY，Tsai CC，Chen CP，et al.Antimicrobial activity of honokiol and magnolol isolated from Magnolia officinalis［J］.Phytother Res，2001，15(2):139 －141.