慢性阻塞性肺疾病中醫(yī)證型分布及不同證型間T淋巴細(xì)胞亞群指標(biāo)差異性的研究

劉梅，彭文照，郝小梅

1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 510006；2.廣東省第二中醫(yī)院，廣東 廣州 510095

慢性阻塞性肺疾病(COPD)是一種不完全可逆的，以氣流受限為特征的呼吸系統(tǒng)慢性疾病，呈進(jìn)行性發(fā)展，多與肺部對(duì)有害顆粒與氣體的異常炎癥反應(yīng)有關(guān)[1]。研究發(fā)現(xiàn)，在COPD的發(fā)病機(jī)制中，T淋巴細(xì)胞表達(dá)水平異常、免疫失衡等因素起重要作用。調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞(Treg)與輔助性T淋巴細(xì)胞(Th)17來(lái)源于初始T淋巴細(xì)胞，兩者在功能和分化過(guò)程中相互遏制，在正常機(jī)體內(nèi)，二者保持平衡，共同維持機(jī)體免疫平衡[2]。Th22細(xì)胞是體內(nèi)白細(xì)胞介素(IL)-22最主要的來(lái)源，在機(jī)體免疫調(diào)節(jié)、宿主防御及組織修復(fù)中發(fā)揮重要作用，固有免疫和獲得性免疫淋巴細(xì)胞通過(guò)生成IL-22作用于細(xì)胞來(lái)對(duì)宿主產(chǎn)生保護(hù)作用，參與炎癥反應(yīng)、自身免疫性疾病等的發(fā)生、發(fā)展[3]。在臨床觀察中可以發(fā)現(xiàn)，中醫(yī)辨證論治通過(guò)調(diào)節(jié)人體免疫功能、改善臨床癥狀、減慢COPD進(jìn)程等方面對(duì)患者進(jìn)行綜合調(diào)治，有積極的臨床效果。本研究通過(guò)分析COPD患者的中醫(yī)證型分布情況，及比較不同證型間T淋巴細(xì)胞亞群表達(dá)變化的差異，對(duì)Treg、Th17、Th22在COPD中的作用機(jī)制進(jìn)行初步探討。

1 臨床資料

1.1 一般資料 選取2017年3—7月于廣東省第二中醫(yī)院、廣東省中醫(yī)院呼吸內(nèi)科門診和住院治療的COPD患者，共115例，其中男66例(占57%)，女49例(占43%)，年齡47～91歲，平均67歲；同期體檢正常未患COPD者20例，其中男11例(占55%)，女9例(占45%)，年齡52～ 73歲，平均63歲。根據(jù)“邪氣勝則實(shí)，精氣奪則虛”，將風(fēng)寒束肺證、外寒內(nèi)飲證、痰熱壅肺證、痰濕阻肺證設(shè)為偏實(shí)證組；將脾肺氣虛證、肺腎氣虛證、肺腎氣陰兩虛證、氣虛血瘀證設(shè)為偏虛證組。

1.2 診斷標(biāo)準(zhǔn) 參照《慢性阻塞性肺疾病診治指南(2013年修訂版)》[1]中COPD的診斷標(biāo)準(zhǔn)。

1.3 辨證標(biāo)準(zhǔn) 參考《慢性阻塞性肺疾病中醫(yī)證候診斷標(biāo)準(zhǔn)(2011版)》[4]和《中醫(yī)內(nèi)科學(xué)》[5]制定中醫(yī)證候診斷標(biāo)準(zhǔn)觀察表，按證候要素綜合辨證。

1.3.1 風(fēng)寒束肺證 咳嗽，喘息，發(fā)熱，惡寒，無(wú)汗，痰白清稀，苔薄，脈浮緊等。

1.3.2 外寒內(nèi)飲證 咳嗽，喘息，痰多色白，氣逆不能平臥，喉中痰鳴，苔白、脈弦緊等。

1.3.3 痰熱壅肺證 咳嗽，喘息，胸悶，痰黏多色黃，發(fā)熱，口渴喜冷飲，舌質(zhì)紅、苔黃膩，脈滑數(shù)等。

1.3.4 痰濕阻肺證 咳嗽，喘息，痰多色白，口黏膩，苔白膩、食少納呆等。

1.3.5 脾肺氣虛證 咳嗽，喘息，氣短，動(dòng)則加重，乏力，脘腹脹滿，易感冒，便溏，舌體胖大有齒痕、舌質(zhì)淡，苔白，脈沉細(xì)、緩等。

1.3.6 肺腎氣虛證 喘息，氣短，動(dòng)則加重，神疲乏力，面目浮腫，易感冒，腰膝酸軟，夜尿多，舌體胖大、舌質(zhì)淡，脈沉細(xì)等。

1.3.7 肺腎氣陰兩虛證 喘息，氣短，動(dòng)則加重，乏力，自汗盜汗，腰膝酸軟，耳鳴，易感冒，手足心熱，舌質(zhì)紅，脈細(xì)數(shù)等。

1.3.8 氣虛血瘀證 面色紫暗，口唇紫暗，舌有瘀斑，舌下靜脈迂曲、粗亂，脈沉澀等。

1.4 納入標(biāo)準(zhǔn) 符合COPD診斷標(biāo)準(zhǔn)與以上的辨證標(biāo)準(zhǔn)。自愿接受本次研究并簽署知情同意書(shū)。

1.5 排除標(biāo)準(zhǔn) 不符合診斷標(biāo)準(zhǔn)與辨證標(biāo)準(zhǔn)；由支氣管擴(kuò)張、肺間質(zhì)纖維化等其他已知病因引起，或具有特征性病理表現(xiàn)的氣流受限疾病，如肺囊性纖維化、彌漫性泛細(xì)支氣管炎；合并非COPD引起的高血壓病、糖尿病及其他器官嚴(yán)重病變；不符合納入標(biāo)準(zhǔn)或臨床資料不全等影響辨證者。

2 研究方法

2.1 觀察指標(biāo) 檢測(cè)Th17細(xì)胞分?jǐn)?shù)、Treg細(xì)胞分?jǐn)?shù)、Th22細(xì)胞分?jǐn)?shù)。

2.1.1 主要試劑及儀器 Ficoll淋巴細(xì)胞分離液購(gòu)自MP Biomedicals公司，1640培養(yǎng)基和PBS液購(gòu)自Gibco公司，IL-22抗體購(gòu)自eBioscience公司，其他固定劑、破膜劑、CD3抗體、CD4抗體、CD25抗體、CD127抗體、IL-17A抗體均購(gòu)自BD Biosciences公司。流式細(xì)胞儀，型號(hào)BD FACSCanto II，美國(guó)BD公司。

2.1.2 檢測(cè)方法 于清晨抽取受試者空腹靜脈血5mL，置于肝素抗凝管中，1 260 r/min，離心5min，取適量血漿于-80℃凍存?zhèn)溆?。淋巴?xì)胞分離液分離出外周單核細(xì)胞，均分成兩部分，一部分行表面染色，避光孵育20min，上機(jī)檢測(cè)Treg細(xì)胞分?jǐn)?shù)。另一部分淋巴細(xì)胞加入含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)液重懸，計(jì)數(shù)并稀釋至(1～2)×107/mL，每孔200μL種板(96孔板)，加入2μL細(xì)胞刺激劑混勻。將培養(yǎng)板放入5%CO2、37℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)5～6 h。行細(xì)胞表面熒光染色，固定/破膜后再行細(xì)胞內(nèi)染色，設(shè)立對(duì)照管后上機(jī)檢測(cè)Th17細(xì)胞分?jǐn)?shù)、Th22細(xì)胞分?jǐn)?shù)。檢測(cè)要求圈定淋巴細(xì)胞為門內(nèi)細(xì)胞，獲取10 000個(gè)以上門內(nèi)細(xì)胞，并保存相關(guān)數(shù)據(jù)，計(jì)算Th17細(xì)胞/Treg細(xì)胞比值。

2.2 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。計(jì)量資料以(±s)表示，多組間比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 研究結(jié)果

3.1 COPD患者中醫(yī)證候分布情況 風(fēng)寒束肺證2例，占1.74%；外寒內(nèi)飲證1例，占0.87%；痰熱壅肺證22例，占19.13%；痰濕阻肺證29例，占25.22%；脾肺氣虛證21例，占18.26%；肺腎氣虛證23例，占20.00%；肺腎氣陰兩虛證6例，占5.22%；氣虛血瘀證11例，占9.57%。

3.2 不同中醫(yī)證型間T淋巴細(xì)胞亞群指標(biāo)比較 見(jiàn)表1。排除因樣本例數(shù)太少而無(wú)法進(jìn)一步統(tǒng)計(jì)分析的風(fēng)寒束肺證組和外寒內(nèi)飲證組。痰熱壅肺證組Treg細(xì)胞分?jǐn)?shù)、Th17細(xì)胞/Treg細(xì)胞比值、Th22細(xì)胞分?jǐn)?shù)與痰濕阻肺證組相比，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)；脾肺氣虛證組Th17細(xì)胞分?jǐn)?shù)、Treg細(xì)胞分?jǐn)?shù)、Th17細(xì)胞/Treg細(xì)胞比值、Th22細(xì)胞分?jǐn)?shù)與肺腎氣虛證組、肺腎氣陰兩虛證組、氣虛血瘀證組相比，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。痰濕阻肺證組Th17細(xì)胞分?jǐn)?shù)低于痰熱壅肺證組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；脾肺氣虛證組、肺腎氣虛證組、肺腎氣陰兩虛證組、氣虛血瘀證組的Th17細(xì)胞分?jǐn)?shù)、Th17細(xì)胞/Treg細(xì)胞比值、Th22細(xì)胞分?jǐn)?shù)均低于痰熱壅肺證組與痰濕阻肺證組(P＜0.05)，Treg細(xì)胞分?jǐn)?shù)均高于痰熱壅肺證組與痰濕阻肺證組(P＜0.05)。

表1 不同中醫(yī)證型間T淋巴細(xì)胞亞群指標(biāo)比較(±s)

表1 不同中醫(yī)證型間T淋巴細(xì)胞亞群指標(biāo)比較(±s)

與痰熱壅肺證組比較，①P<0.05；與痰濕阻肺證組比較，②P<0.05

組 別痰熱壅肺證組痰濕阻肺證組脾肺氣虛證組肺腎氣虛證組肺腎氣陰兩虛證組氣虛血瘀證組n 22 29 21 23 6 11 Th17(%)5.65±0.47 4.63±0.34①2.56±0.56①②2.41±0.58①②2.91±0.37①②2.61±0.36①②Treg(%)2.64±0.42 2.55±0.44 5.24±0.54①②5.46±0.68①②5.63±0.35①②5.34±0.57①②Th17/Treg 2.37±0.35 2.34±0.43 0.49±0.13①②0.53±0.11①②0.55±0.21①②0.52±0.23①②Th22(%)2.87±0.63 2.73±0.53 2.11±0.34①②2.15±0.48①②2.22±0.39①②2.01±0.44①②

3.3 偏虛、實(shí)證組與對(duì)照組T淋巴細(xì)胞亞群指標(biāo)比較 見(jiàn)表2。偏虛證組和偏實(shí)證組的Th17細(xì)胞分?jǐn)?shù)、Th17細(xì)胞/Treg細(xì)胞比值、Th22細(xì)胞分?jǐn)?shù)均高于對(duì)照組(P＜0.05)；偏虛證組Treg細(xì)胞分?jǐn)?shù)高于對(duì)照組(P＜0.05)，偏實(shí)證組Treg細(xì)胞分?jǐn)?shù)低于對(duì)照組(P＜0.05)；偏虛證組Th17細(xì)胞分?jǐn)?shù)、Th17細(xì)胞/Treg細(xì)胞比值、Th22細(xì)胞分?jǐn)?shù)均低于偏實(shí)證組(P＜0.05)，Treg細(xì)胞分?jǐn)?shù)高于偏實(shí)證組(P＜0.05)。

4 討論

目前，COPD的發(fā)病機(jī)制尚未完全明了，現(xiàn)認(rèn)為發(fā)病機(jī)制包括以下4個(gè)方面[6]：①炎癥學(xué)說(shuō)；②氧化/抗氧化失衡學(xué)說(shuō)；③蛋白酶/抗蛋白酶失衡學(xué)說(shuō)；④自主神經(jīng)系統(tǒng)功能紊亂。其中炎癥學(xué)說(shuō)占有重要地位。有研究認(rèn)為COPD以氣道、肺實(shí)質(zhì)和肺血管的慢性炎癥為特征，在肺的不同部位有肺泡巨噬細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞和中性粒細(xì)胞增加，激活的炎癥細(xì)胞釋放多種細(xì)胞因子參與COPD的發(fā)病[7]。當(dāng)存在炎癥反應(yīng)或者自身免疫性疾病時(shí)，一些細(xì)胞因子過(guò)度表達(dá)會(huì)影響初始T淋巴細(xì)胞分化，增加Th17分化，導(dǎo)致Treg與Th17失衡，從而引起一系列損害機(jī)體的炎癥反應(yīng)[2]。當(dāng)Th17細(xì)胞/Treg細(xì)胞比值增大時(shí)，提示機(jī)體炎癥反應(yīng)狀態(tài)更為嚴(yán)重[8]。

表2 偏虛、實(shí)證組與對(duì)照組T淋巴細(xì)胞亞群指標(biāo)比較(±s)

表2 偏虛、實(shí)證組與對(duì)照組T淋巴細(xì)胞亞群指標(biāo)比較(±s)

與對(duì)照組比較，①P<0.05；與偏虛證組比較，②P<0.05

組 別對(duì)照組偏虛證組偏實(shí)證組n 20 61 54 Th17(%)1.73±0.27 2.92±0.89①4.36±0.75①②Treg(%)4.42±0.71 5.16±1.55①2.77±0.70①②Th17/Treg 0.40±0.08 0.58±0.12①1.69±0.63①②Th22(%)1.30±0.33 2.30±0.42①2.59±0.62①②

《素問(wèn)》中有“邪氣勝則實(shí)，精氣奪則虛”之說(shuō)，故本研究在設(shè)置偏實(shí)證組與偏虛證組時(shí)，把外邪勝的風(fēng)寒束肺證、外寒內(nèi)飲證、痰熱壅肺證、痰濕阻肺證設(shè)為偏實(shí)證組；將內(nèi)在正氣不足而出現(xiàn)的脾肺氣虛證、肺腎氣虛證、肺腎氣陰兩虛證、氣虛血瘀證設(shè)為偏虛證組。血瘀一證，在平時(shí)辨證多認(rèn)為屬實(shí)證，但在本試驗(yàn)中考慮患者血瘀皆為老年久病氣虛血瘀，實(shí)屬“本虛標(biāo)實(shí)”，故列入偏虛證組。結(jié)果顯示：偏實(shí)證組痰熱壅肺證、痰濕阻肺證所占比例很大，風(fēng)寒束肺證、外寒內(nèi)飲證所占比例很小，可能與選取病例集中在3～7月，天氣漸暖有關(guān)；偏虛證組脾肺氣虛證、肺腎氣虛證所占比例較大，肺腎氣陰兩虛證、氣虛血瘀證所占比例較小，這也提示了在COPD患者本身病情發(fā)展中，以肺氣虛為主，氣虛與痰飲交織為患，呈進(jìn)行性發(fā)展。

本研究T淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè)結(jié)果顯示，痰濕阻肺證組Th17細(xì)胞分?jǐn)?shù)低于痰熱壅肺證組(P＜0.05)，提示痰熱壅肺證患者的炎癥反應(yīng)程度比痰濕阻肺證患者嚴(yán)重；脾肺氣虛證組、肺腎氣虛證組、肺腎氣陰兩虛證組與氣虛血瘀證組的Th17細(xì)胞分?jǐn)?shù)、Th17細(xì)胞/Treg細(xì)胞比值、Th22細(xì)胞分?jǐn)?shù)均低于痰熱壅肺證組與痰濕阻肺證組(P＜0.05)，Treg細(xì)胞分?jǐn)?shù)均高于痰熱壅肺證組與痰濕阻肺證組(P＜0.05)，提示COPD病情處于偏實(shí)證的痰熱壅肺證和痰濕阻肺證時(shí)，炎癥反應(yīng)與免疫失衡相對(duì)加重，促炎癥因子Th17所占比例增多，而介導(dǎo)免疫反應(yīng)的Treg所占比例減少。COPD患者外周血Th17細(xì)胞分?jǐn)?shù)、Th17細(xì)胞/Treg細(xì)胞比值、Th22細(xì)胞分?jǐn)?shù)均高于對(duì)照組，提示COPD患者持續(xù)存在氣道慢性炎癥；偏實(shí)證組Th17細(xì)胞分?jǐn)?shù)、Th17細(xì)胞/Treg細(xì)胞比值、Th22細(xì)胞分?jǐn)?shù)均高于偏虛證組，這可能與偏實(shí)證組選取病例的中醫(yī)證候集中在邪氣勝的4個(gè)證型，此時(shí)炎癥反應(yīng)較強(qiáng)有關(guān)。偏虛證組Treg細(xì)胞分?jǐn)?shù)高于對(duì)照組，可能與偏虛證組選取病例多是“精氣奪則虛”，正氣不足有關(guān)。COPD患者持續(xù)存在的氣道慢性炎癥可導(dǎo)致上皮細(xì)胞損傷甚至氣道重塑，最終導(dǎo)致肺功能損傷，由“邪氣勝”的實(shí)證向“精氣虛”的虛證轉(zhuǎn)變。

綜上所述，持續(xù)存在的慢性炎癥、自身免疫失衡與COPD病情變化密切相關(guān)，是導(dǎo)致COPD患者由“邪氣勝”的實(shí)證向“精氣虛”的虛證轉(zhuǎn)變的重要原因，相關(guān)T淋巴細(xì)胞亞群指標(biāo)或許可以作為臨床中醫(yī)辨證規(guī)范化的部分依據(jù)。但本研究樣本選擇時(shí)間段較集中，觀察指標(biāo)數(shù)相對(duì)較少，Th17細(xì)胞分?jǐn)?shù)、Treg細(xì)胞分?jǐn)?shù)、Th17細(xì)胞/Treg細(xì)胞比值、Th22細(xì)胞分?jǐn)?shù)在COPD進(jìn)展中的確切作用機(jī)制、與中醫(yī)證候發(fā)展的相關(guān)性仍有待進(jìn)一步研究。

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