脾胃濕熱證大鼠模型血清蛋白質(zhì)組學(xué)差異表達(dá)研究

廖榮鑫，劉小虹，許仕杰

1.廣東藥科大學(xué)附屬第三醫(yī)院，廣東 廣州 510410；2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣東 廣州 510006

脾胃濕熱證是臨床常見(jiàn)的脾胃實(shí)證，中醫(yī)認(rèn)為其形成與氣候、飲食內(nèi)傷、疫氣以及體質(zhì)因素有關(guān)。由于脾胃濕熱證的特殊致病因素及其病理變化的特點(diǎn)，目前研究還處于籠統(tǒng)、多指標(biāo)、不確定狀態(tài)，缺乏一個(gè)整體、統(tǒng)一的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，有待進(jìn)一步多學(xué)科綜合研究。證候蛋白質(zhì)組學(xué)的提出，為整體研究證候?qū)嵸|(zhì)提供可能。血清中含有近萬(wàn)種蛋白質(zhì)，成分復(fù)雜，包括各種不同器官、組織和細(xì)胞分泌的多種蛋白質(zhì)，機(jī)體每一時(shí)間段的病理生理改變均可在血清中反映出來(lái)[1]。因而從血清蛋白質(zhì)組學(xué)的角度，將蛋白質(zhì)組學(xué)和中醫(yī)證型研究結(jié)合起來(lái)，探討脾胃濕熱證在某一時(shí)期的相關(guān)蛋白質(zhì)，對(duì)從整體水平研究、評(píng)價(jià)脾胃濕熱證的實(shí)質(zhì)具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。本研究從動(dòng)物模型入手，對(duì)與脾胃濕熱證模型大鼠相關(guān)的血清差異表達(dá)蛋白質(zhì)進(jìn)行探討。

1 材料和方法

1.1 動(dòng)物分組與模型制備 實(shí)驗(yàn)用動(dòng)物為6周齡SPF級(jí)SD雄性大鼠20只，購(gòu)自廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK(粵)2003-0001，批次：20060241，于廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)，體質(zhì)量(178.27±4.79)g。按照隨機(jī)數(shù)字表將實(shí)驗(yàn)大鼠隨機(jī)分為模型組和正常對(duì)照組，每組10只。模型組大鼠于造模前禁食12 h，自由飲水，測(cè)定肛溫、體質(zhì)量、飲食量。造模時(shí)間共28天，采用肥甘飲食+造模箱+大腸桿菌造模法[2]。肥甘飲食(在普通飼料中混入12%豬油，8%蜂蜜)喂養(yǎng)10天，然后置于造模箱[溫度(33±2)℃，相對(duì)濕度85%～95%]8天，第19天開(kāi)始灌胃，按10mL/kg給予大腸桿菌1次，24 h后再加強(qiáng)感染1次(1mL/200 g)，移出置于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心自然環(huán)境中，12 h后開(kāi)始灌服蒸餾水，40mL/kg，每天2次，灌胃8天。正常對(duì)照組不予任何干預(yù)。

1.2 標(biāo)本采集 第28天斷頭處死大鼠取全血，于4℃靜置30min后，以1 000 rpm的速度室溫離心5min，吸取上清液；置高速低溫離心機(jī)，在4℃條件下，以10 000 rpm的速度離心8min，再吸取上清液，分裝置－80℃低溫冰箱保存。

1.3 試劑和儀器 Sigma公司生產(chǎn)的3K18高速低溫離心機(jī)；AmershamPharmacia公司生產(chǎn)的IPGphor及附件、GS-710光密度透射掃描儀；Bio-Rad公司生產(chǎn)的ProteanⅡ垂直電泳單元及附件、Mini-PROTEAN電泳單元及附件；HITACHI公司生產(chǎn)的U-2001紫外分光光度計(jì)；北京四環(huán)科學(xué)儀器制造廠生產(chǎn)的恒溫循環(huán)器HX-1055。實(shí)驗(yàn)中所用試劑有：三羥基甲基氨基甲烷堿Tris、十二烷基硫酸鈉SDS、Bromopheolblue、Ultra urea、IPG buffer(pH 4～7)、固相pH梯度干膠條(IPG strip，13 cm，pH 3～ 10)(均購(gòu)自 AmershamPharmacia 公司)；AAm、Bis、Gly(購(gòu)自 Bio-Rad 公司)；PMSF(購(gòu)自 Merck 公司)；TEMED、Pharmalyte(pH 3～ 10)、CHAPS(購(gòu)自 Sigma 公司)；IAA、G250/R250(Fluka公司，批號(hào)：194863)；LMWmarker(購(gòu)自華美生物工程公司，批號(hào)：20061458)；二硫蘇糖醇DTT(購(gòu)自Promega公司)，BSA(購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液學(xué)研究所，批號(hào)：20061625)。

1.4 二維凝膠電泳（2-DE） 分離和分析 考馬斯亮藍(lán)G250法[3]測(cè)定血清蛋白質(zhì)濃度，然后按等質(zhì)量分別混和模型組和正常對(duì)照組的血清樣本，以組間配對(duì)的方式同時(shí)進(jìn)行2-DE分離。采用18 cm長(zhǎng)，pH值為4～7的固相pH梯度干膠條，上樣量為2.0 mg，以AmershamPharmacia Biotech公司IPGphor水平電泳儀進(jìn)行等電聚焦(isoelectric focusing，IEF)。IEF過(guò)程中采用濾紙片作為“鹽橋”，設(shè)定250 V 30min，500 V 30min的低電壓除鹽過(guò)程，總電壓時(shí)間積約為50 000 Vh。平衡后的膠條置12.5%濃度的SDS凝膠作第二相分離。以考馬斯亮藍(lán)G250對(duì)凝膠做膠體考染，用GS710光密度透射掃描儀掃描凝膠并保存圖像。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，共獲得6張2-DE凝膠圖像。以Image Master 2DElite軟件進(jìn)行圖像分析，設(shè)定表達(dá)量提高2倍為差異表達(dá)范圍，獲取最終有差異表達(dá)的蛋白質(zhì)斑點(diǎn)信息。

1.5 差異蛋白質(zhì)的質(zhì)譜分析和數(shù)據(jù)庫(kù)檢測(cè) 切取差異表達(dá)蛋白質(zhì)斑點(diǎn)，經(jīng)水洗、脫色處理后進(jìn)行膠內(nèi)酶切和萃取，獲得蛋白質(zhì)的肽混合樣品，再以美國(guó)ABI公司的Voyager DE STRMALDI-TOF質(zhì)譜儀對(duì)處理好的樣品進(jìn)行質(zhì)譜檢測(cè)，獲取肽質(zhì)量指紋圖譜(peptidemass fingerprint，PMF)。以Mascot軟件搜索NCBInr和EMBL等數(shù)據(jù)庫(kù)，查詢PMF所對(duì)應(yīng)蛋白質(zhì)及相關(guān)信息。

2 結(jié)果

2.1 血清蛋白質(zhì)差異表達(dá)蛋白分布圖 見(jiàn)圖1。在模型組大鼠和正常對(duì)照組大鼠血清中共找出12個(gè)表達(dá)量具有顯著差異的蛋白質(zhì)斑點(diǎn)。

圖1 血清蛋白質(zhì)差異表達(dá)蛋白分布圖位置(A為上調(diào)圖；B為下調(diào)圖)

2.2 血清差異表達(dá)蛋白質(zhì)情況 見(jiàn)表1。按照在圖像中檢測(cè)到的序號(hào)來(lái)分，分別為點(diǎn)5、16、52、74、120、153、191、196、211、208、263、281。通過(guò)對(duì)PMF的數(shù)據(jù)庫(kù)檢索，12個(gè)血清差異蛋白質(zhì)中除3個(gè)血清差異蛋白質(zhì)未獲得滿意的PMF圖譜，故無(wú)法檢出其具體物質(zhì)，其余9個(gè)可獲得數(shù)據(jù)庫(kù)的匹配信息，分別為備解素B因子、凝血因子Ⅱ、C-反應(yīng)蛋白、alpha-胰蛋白酶抑制劑重鏈H4、載脂蛋白AI、重組人載脂蛋白AI、血小板凝血酶敏感蛋白、α-巨球蛋白、補(bǔ)體3。

3 討論

近年來(lái)，蛋白質(zhì)組學(xué)作為后基因時(shí)代的標(biāo)志，目前已運(yùn)用到包括疾病標(biāo)志物研究、作用機(jī)制研究、藥物作用靶點(diǎn)研究、個(gè)性化醫(yī)療等多個(gè)領(lǐng)域中[4]。將蛋白質(zhì)組學(xué)引入到中醫(yī)證候的研究，主要通過(guò)對(duì)同一疾病不同證候和同一證候不同疾病的組織或細(xì)胞不同的蛋白質(zhì)表達(dá)譜進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)證候間的相同及差異之處，進(jìn)而揭示中醫(yī)證候的本質(zhì)，蛋白質(zhì)組學(xué)的整體性、復(fù)雜性、動(dòng)態(tài)性、信息化的特點(diǎn)和中醫(yī)學(xué)的理念不謀而合[5]。袁宏偉等[6]運(yùn)用蛋白質(zhì)組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)冠心病心腎陰虛證的內(nèi)在基礎(chǔ)，并找出了證型間的差異表達(dá)蛋白。孟慶宏等[7]分別從中醫(yī)證和蛋白質(zhì)組的概念、內(nèi)涵、特點(diǎn)、共性等幾個(gè)方面對(duì)將蛋白質(zhì)組學(xué)引入中醫(yī)證候的研究進(jìn)行了探討，認(rèn)為將蛋白質(zhì)組學(xué)引入到中醫(yī)證候?qū)W研究，為中醫(yī)證候物質(zhì)和功能基礎(chǔ)研究提供了新思路，對(duì)揭示中醫(yī)證的現(xiàn)代科學(xué)內(nèi)涵具有重要意義。

表1 血清差異表達(dá)蛋白質(zhì)情況

從本研究篩選出的9個(gè)差異蛋白質(zhì)可以看出，脾胃濕熱證模型大鼠差異表達(dá)的蛋白主要涉及機(jī)體免疫、物質(zhì)代謝、炎癥反應(yīng)及血液流變學(xué)等方面。與脾胃濕熱證免疫調(diào)節(jié)有關(guān)的蛋白有補(bǔ)體3、α-巨球蛋白、備解酶B因子。補(bǔ)體3、α-巨球蛋白表達(dá)均下降，備解素B因子表達(dá)上調(diào)，三者共同作用分別從激素調(diào)節(jié)、B淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的免疫和受體分解等方面共同發(fā)揮作用，引起機(jī)體免疫力下降，和已有關(guān)于脾胃濕熱證免疫力下降的諸多研究結(jié)果[8～10]是一致的?！端貑?wèn)》認(rèn)為：“脾胃為水谷之?！?、“脾胃為后天之本”，脾胃功能衰弱，脾胃運(yùn)化水谷精微功能失調(diào)，則正氣受損，是易于感受外邪而發(fā)病的基礎(chǔ)。因此，研究提示的免疫調(diào)節(jié)蛋白表達(dá)下降，引起機(jī)體免疫功能減低，可能是脾胃濕熱證正氣不足，易受邪而發(fā)病的實(shí)質(zhì)所在。

與機(jī)體炎癥反應(yīng)有關(guān)的蛋白質(zhì)有alpha-胰蛋白酶抑制劑重鏈H4和C-反應(yīng)蛋白。C-反應(yīng)蛋白是反映炎癥反應(yīng)的指標(biāo)[11]，alpha-胰蛋白酶抑制劑重鏈H4是感染、炎癥、創(chuàng)傷時(shí)常發(fā)生急性期反應(yīng)蛋白[12]。在脾胃濕熱證大鼠血清中，C-反應(yīng)蛋白表達(dá)下調(diào)，alpha-胰蛋白酶抑制劑重鏈H4表達(dá)上調(diào)。C-反應(yīng)蛋白表達(dá)下降及alpha-胰蛋白酶抑制劑重鏈H4表達(dá)上調(diào)，這一結(jié)果與楊春波等[8]發(fā)現(xiàn)脾胃濕熱證涉及的病種中，以炎癥性疾病占大多數(shù)，尤其與以循環(huán)系統(tǒng)障礙、滲出為主的急性期炎癥和亞急性期炎癥更為密切，說(shuō)明脾胃濕熱證炎癥的存在并不易愈合。

與機(jī)體營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)代謝有關(guān)的蛋白質(zhì)有重組人載脂蛋白AI及載脂蛋白AI，二者在調(diào)節(jié)脾胃濕熱證機(jī)體的脂肪代謝以及胰島素的釋放等方面發(fā)揮著重要的作用。重組人載脂蛋白AI及載脂蛋白AI表達(dá)均增強(qiáng)，提示機(jī)體脂肪蓄積太多，載脂蛋白表達(dá)增強(qiáng)，代償性加快脂類(lèi)在機(jī)體內(nèi)的代謝，和模型動(dòng)物使用高糖高脂飼料后表現(xiàn)為飲食減少、體質(zhì)量增加有關(guān)；與中醫(yī)理論的脾主運(yùn)化功能失常引起脾胃運(yùn)化水谷功能下降，水濕內(nèi)停的理論一致。

與血液流變學(xué)有關(guān)的蛋白質(zhì)有凝血因子Ⅱ、血小板凝血酶敏感蛋白，二者表達(dá)均增強(qiáng)。凝血因子Ⅱ是凝血酶原被激活形成凝血酶過(guò)程中釋放的產(chǎn)物，若增高提示體內(nèi)有凝血酶形成。脾胃濕熱患者存在著凝血方面的異常。研究表明慢性胃病不同證型都存在血流變的異常，脾胃濕熱證最突出，曹代娣[13]研究表明，血液流變異常程度為脾胃濕熱型＞肝郁氣滯型＞脾胃虛弱型。鄭家鏗等[14]研究發(fā)現(xiàn)脾胃濕熱證存在著高血黏、高血凝、高血細(xì)胞壓積等特點(diǎn)。凝血因子Ⅱ、血小板凝血酶敏感蛋白在脾胃濕熱證的表達(dá)均增強(qiáng)，說(shuō)明脾胃濕熱證在血液流變學(xué)上具有高凝、高黏的特點(diǎn)，與先前學(xué)者的相關(guān)研究報(bào)道[15]相一致。

本研究從動(dòng)物模型出發(fā)，初步探討了和脾胃濕熱證相關(guān)的血清特異表達(dá)蛋白質(zhì)，這些蛋白主要涉及機(jī)體免疫、物質(zhì)代謝、炎癥反應(yīng)及血液流變學(xué)等方面，和現(xiàn)有的脾胃濕熱證的相關(guān)研究結(jié)果是一致的，證實(shí)了從蛋白質(zhì)組的角度來(lái)研究脾胃濕熱證實(shí)質(zhì)是可行的。中醫(yī)證型的形成和發(fā)展是多種因素共同作用的結(jié)果，今后還需要進(jìn)一步將脾胃濕熱證相關(guān)的動(dòng)物模型、臨床病例的血清或者組織差異表達(dá)蛋白質(zhì)結(jié)合起來(lái)比較分析，對(duì)不同的差異表達(dá)蛋白進(jìn)行鑒定和功能驗(yàn)證，更深入地探討脾胃濕熱證的相關(guān)蛋白質(zhì)，以闡釋脾胃濕熱證的實(shí)質(zhì)。

[1] 鐘小蘭，呂志平，錢(qián)令嘉，等．肝郁證模型大鼠血清蛋白質(zhì)組的差異表達(dá)研究[J]．中華中醫(yī)藥雜志，2006，21(7)：399-401．

[2] 吳仕九，楊運(yùn)高．溫病濕熱證動(dòng)物模型的研制及清熱祛濕法機(jī)理的探討[J]．中國(guó)中醫(yī)藥科技，1999，6(2)：65-67．

[3] Candiano G，BruschiM，Musante L，etal． Blue silver：a very sensitive colloidal Coomassie G-250 staining for proteome analysis[J]． Electrophoresis，2004，25(9)：1327-1333．

[4] 王常松，傅曉晴，劉清華，等．中醫(yī)證蛋白質(zhì)組學(xué)研究探析[J]．中華中醫(yī)藥雜志，2011，26(3)：535-537．

[5] 王新賢，殷海波，姜泉，等．蛋白質(zhì)組學(xué)在中醫(yī)證候?qū)W研究中的應(yīng)用進(jìn)展[J]．世界中醫(yī)藥，2017，12(8)：1965-1969．

[6] 袁宏偉，杜武勛，朱明丹，等．冠心病心氣虛弱證/心腎陰虛證血清蛋白質(zhì)組學(xué)特征研究[J]．時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2012，23(4)：1014-1016．

[7] 孟慶宏，王常松，傅曉晴，等．蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)引入中醫(yī)證理論的可行性研究[J]．中醫(yī)學(xué)報(bào)，2011，26(2)：170-172．

[8] 楊春波，黃可成，肖可成，等．脾胃濕熱證的臨床研究-400例資料分析[J]．中醫(yī)雜志，1994，35(7)：425-427．

[9] 尹思源，張光華，張磊，等．慢性胃脘痛證候分布規(guī)律的調(diào)查(附115例典型病例分析)[J]．瀘州醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，1995，18(2)：109-111.

[10] 周正，黃志新，勞紹賢．脾胃濕熱證的現(xiàn)代研究進(jìn)展[J]．湖南中醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2003，9(6)：65-67．

[11] Choi-Miura NH，Takahashi K，Yoda M，et al． The novel acute phase protein，IHRP，inhibits actin polymerization and phagocytosis of polymorphonuclear cells[J]． InflammRes，2000，49(6)：305-310．

[12] Venugopal SK，Devaraj S，Jialal I． Effectof C reactive protein on vascular cell：evidence for a proinflamatory，proath erogenic role[J]． Curr Opin Nephrol Hypertens， 2005， 14(1)：33-37．

[13] 曹代娣．胃脘痛的宏觀辨證與微觀結(jié)合的初步探討[J]．遼寧中醫(yī)雜志，1994，21(2)：54-55．

[14] 鄭家鏗，張群豪，許少鋒，等．慢性胃病脾胃濕熱證與脾氣虛證的血液流變學(xué)觀察[J]．福建中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，1994，4(2)：6-8．

[15] 侯冬梅，劉勤社，郭安陽(yáng)．慢性萎縮性胃炎中醫(yī)證型與血液流變學(xué)的關(guān)系[J]．中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合脾胃雜志，1997，5(1)：14-16．