淋巴管密度、微血管密度與VEGF在胃癌中的生物學(xué)意義

沈源， 保麗玲， 吳桂霞， 滕佳， 張曉坤

（1.云南省第一人民醫(yī)院急診內(nèi)科，云南昆明650032；2.昆明醫(yī)科大學(xué)海源學(xué)院，云南昆明650101）

胃癌是一種嚴重威脅人類健康的常見消化系統(tǒng)惡性腫瘤，盡管隨著醫(yī)學(xué)的發(fā)展，在多種輔助治療手段下，以手術(shù)為主的綜合治療取得了一定的療效，但胃癌的預(yù)后效果仍不理想，這主要歸咎于惡性腫瘤具有局部浸潤和遠處轉(zhuǎn)移的能力.實體腫瘤的生長需要新的血管，而惡性腫瘤常見的轉(zhuǎn)移方式主要是淋巴道和血道轉(zhuǎn)移，兩種轉(zhuǎn)移途徑存在著相互和廣泛聯(lián)系，單純阻斷某一條轉(zhuǎn)移途徑并不能很好控制腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移.

血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelia growth factor，VEGF）是一種作用于血管內(nèi)皮細胞并在生理以及病理過程中調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細胞增殖與新生血管形成的血管內(nèi)皮生長因子［1］，可誘導(dǎo)腫瘤淋巴管形成［2］.CD105在腫瘤血管新生中發(fā)揮重要作用，同時是腫瘤新生血管較好的標記物.D2-40是腫瘤淋巴管的特異標記物，不參與血管內(nèi)皮反應(yīng)，只參與新生淋巴管內(nèi)皮細胞、微小淋巴管內(nèi)皮細胞反應(yīng).本實驗采用免疫組織化學(xué)法，檢測胃癌癌組織中VEGF的表達，同時采用CD105和D2-40分別標記組織中血管密度（microvessel density，MVD）與淋巴管密度（lymphatic vessel density，LVD），研究VEGF表達在胃癌中的臨床病理學(xué)意義及其與腫瘤微血管和微淋巴管生成的關(guān)系，為胃癌的治療及預(yù)后判斷提供實驗依據(jù).

1 材料與方法

1.1 標本來源

48例標本選自昆明醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院病理科2009年1月至2014年6月間存檔蠟塊，所有病例均為手術(shù)切除，患者術(shù)前均無輔助化療及內(nèi)分泌治療史，其中男27例，女21例，年齡35～89歲.經(jīng)病理醫(yī)師證實均為進展期胃腺癌，其中高、中分化腺癌（包括乳頭狀腺癌或管狀腺癌）24例，低分化腺癌（包括粘液腺癌、印戒細胞癌和未分化癌）24例，侵及漿膜周圍軟組織者28例，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者28例，同時依據(jù)病人年齡大小、腫瘤大小、分化程度、浸潤深度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移進行分組.另取43例切緣不典型增生組織（均病理證實無癌組織）以及29例距癌腫邊緣10 cm以上的正常胃組織作對照.

1.2 試劑

CD105鼠抗人轉(zhuǎn)化生長因子免疫單克隆抗體，克隆號（SN6H），D2-40鼠抗人單克隆抗體，克隆號（D2-40），VEGF鼠抗人血管內(nèi)皮生長因子免疫組化單克隆抗體，克隆號（VG1）及DAB顯色試劑盒均購于福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司.

1.3 方法

所有組織常規(guī)脫水，石蠟包埋，連續(xù)切片，分別用于常規(guī)HE和免疫組織化學(xué)染色，程序嚴格按照SP法試劑盒說明書進行，設(shè)置陰性對照組，進行VEGF、CD105和D2-40免疫組織化學(xué)染色.

1.4 結(jié)果觀察與判斷

VEGF表達于細胞胞漿和（或）細胞核出現(xiàn)棕色顆粒為陽性顯色，按照喬宏等［3］的標準進行判斷.①選染色均勻的陽性表達區(qū)域，以著色細胞占視野細胞總數(shù)的比例計分：無陽性細胞為0分；陽性細胞數(shù)占比≤25%為1分；26%～50%為2分；＞50%為3分.②按著色細胞染色強弱計分：無著色為0分；淡黃色為1分；棕黃色為2分；深棕色為3分.免疫組化結(jié)果以著色細胞計數(shù)與染色強度乘積表示，判斷結(jié)果：0～3為（-）；4～9為（+）.

MVD與LVD計數(shù)按 Weidner評判標準［4］進行：先在低倍鏡（100倍）下全面觀察切片，確定脈管密度最高處（即hot spot），凡棕黃色顆粒單個內(nèi)皮細胞或條索狀內(nèi)皮細胞簇均為1個陽性脈管計數(shù)，再于高倍光鏡下200倍（0.74 mm2）視野下計數(shù)，每例計數(shù)3個視野，取其均值為該病例血管密度或淋巴管密度.

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

統(tǒng)計學(xué)分析采用SPSS 18.0軟件，計量資料以（均數(shù)±標準差）（±s）表示，各組間數(shù)據(jù)比較依據(jù)資料的性質(zhì)，采用t檢驗或方差分析，P＜0.05為有統(tǒng)計學(xué)意義.

2 結(jié)果

CD105染色陽性為棕褐色或者棕黃色，定位于小血管內(nèi)皮細胞的胞漿（圖1），胃癌組織內(nèi)的微血管，形狀不規(guī)則，呈簇狀或管狀.D2-40染色定位于淋巴管內(nèi)皮細胞的胞漿，在胃癌組織中標記出淋巴管，腫瘤邊緣淋巴管腔較?。▓D2），單層，內(nèi)無紅細胞（圖3），淋巴管形態(tài)各異，呈孤立、環(huán)形或隙狀，簇狀或條索狀分布，有的細長，有的彎曲，有的呈線型［5］.VEGF表達定位于細胞漿，呈棕黃色顆粒.在正常組、不典型增生組及胃癌組中的表達程度不一，高表達主要見于胃癌組織的癌細胞（圖4）.

圖1 CD105在胃癌組織中免疫組織化學(xué)檢測（SP×800）Fig.1 The rusulits of immunohistochemistry of CD105 in gastric carcinoma（SP×800）

圖2 D2-40在胃癌組織中免疫組織化學(xué)檢測（SP×200）Fig.2 The rusulits of immunohistochemistry of D2-40 in gastric carcinoma（SP×200）

圖3 D2-40在胃癌組織中表達（SP×800）Fig.3 The rusulits of immunohistochemistry of D2-40 in gastric carcinoma（SP×800）

圖4 VEGF在胃癌組織中免疫組織化學(xué)檢測（SP×200）Fig.4 The rusulits of immunohistochemistry of VEGF in gastric carcinoma（SP×200）

2.1 MVD、LVD和VEGF統(tǒng)計結(jié)果

CD105標記的MVD值在正常組、不典型增生組、腫瘤組分別為（3.43±0.67）、（7.94±0.86）和（15.17±1.19）；D2-40標記的 LVD值在正常組、不典型增生組和胃癌組分別為（4.60±0.68）、（8.11±0.66）和（16.16±3.01）；VEGF免疫組化檢測結(jié)果的29例正常組織中，25例（-），4例（+），陽性率為14%；43例非典型增生組織中，23例（-），20例（+），陽性率為53%；48例胃癌組織中，11例（-），37例（+），陽性率為77%.在胃癌組織內(nèi)的VEGF，MVD，LVD較正常胃組織、不典型增生胃組織明顯增高，均有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05）.

2.2 MVD、LVD和VEGF表達與臨床病理因素之間的關(guān)系

MVD值在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組（15.58±1.21）顯著高于無轉(zhuǎn)移組（14.43±0.69），兩者有統(tǒng)計學(xué)差異（P＝0.009），浸潤深度上，T3、T4期（19.97±1.86）高于浸潤較淺的 T1、T2期（14.50±0.76）兩者有統(tǒng)計學(xué)差異（P＝0.002），MVD在分化程度、患者性別、年齡上無差異（表1）.

LVD值在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組（17.96±3.09）顯著高于無轉(zhuǎn)移組（14.11±0.82），兩者有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.001）；分化程度上，高、中分化（19.39±1.96）高于低分化（14.01±0.81）兩者有統(tǒng)計學(xué)差異（P＝0.008），浸潤深度上，T3、T4期（19.13±2.10）高于浸潤較淺的 T1、T2期（13.89±0.66）兩者有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.001），LVD在患者性別、年齡上無差異（表1）.

VEGF標記的表達強度在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組（6.90±2.20）顯著高于無轉(zhuǎn)移組（5.0±3.08），兩者有統(tǒng)計學(xué)差異（P＝0.25），浸潤深度上，T3、T4期（7.17±1.90）高于浸潤較淺的 T1、T2期（4.45±3.07）兩者有統(tǒng)計學(xué)差異（P＝0.001），VEGF在分化程度、患者性別、年齡上無差異（表1）.

表1 胃癌區(qū)MVD、LVD和VEGF與臨床病理學(xué)參數(shù)間的關(guān)系Table 1 MVD、LVD ang VEGF of human gastric cancer and clinicopathological parameters（±s）

表1 胃癌區(qū)MVD、LVD和VEGF與臨床病理學(xué)參數(shù)間的關(guān)系Table 1 MVD、LVD ang VEGF of human gastric cancer and clinicopathological parameters（±s）

0.009 ＜0.001 0.025無20 14.43±0.69 14.11±0.82 5.0±3.08有28 15.58±1.21 17.96±3.09 6.90±2.20分化程度 0.32 0.008 0.515高、中分化 24 14.78±1.34 19.39±1.96 5.57±2.64低分化 24 15.54±0.90 14.01±0.81 6.14±3.18浸潤深度 0.002 ＜0.001 0.001 T1、T2期 20 14.50±0.76 13.89±0.66 4.45±3.07 T3、T4期 28 19.97±1.86 19.13±2.10 7.17±1.90性別 0.96 0.12 0.382男27 17.33±3.27 15.19±2.23 6.23±3.18女21 17.27±3.02 16.91±3.36 5.45±2.60年齡/歲 0.22 0.29 0.778≤50 18 16.53±3.17 15.48±2.47 5.67±3.16淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移＞50 30 17.73±3.04 16.68±3.34 5.93±2.80

2.3 VEGF和 MVD、LVD的關(guān)系

VEGF表達陽性組的平均MVD為（15.54±6.00）高于陰性組（10.24±6.32）兩者差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001），而在 VEGF陽性組的平均LVD（16.06±7.09）和陰性組（18.7±8.68）之間無統(tǒng)計學(xué)差異（P＝0.57）.

3 討論

胃癌是一種常見消化道腫瘤，隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，對胃癌的演變過程、浸潤轉(zhuǎn)移及預(yù)后有了更進一步的研究.腫瘤組織中血管的生成和淋巴道轉(zhuǎn)移是影響胃癌患者預(yù)后和死亡的重要因素，抑制血管生成和淋巴道轉(zhuǎn)移是控制腫瘤生長、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的有效策略之一，可能成為腫瘤治療的新靶點.

CD105是80年代中期發(fā)現(xiàn)的一類新的細胞粘附因子，又名Endoglin，一種同型二聚體細胞膜糖蛋白，分子質(zhì)量為180 ku，是轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）受體復(fù)合物成分，能獨立存在于細胞的表面，可調(diào)節(jié)細胞對TGF-β的反應(yīng)，促進血管生成，參與腫瘤分化、生長、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā).在血管內(nèi)皮細胞中有豐富的表達［6］.在肝癌［7］、乳腺癌［8］等腫瘤中，CDl05可以成功標記新生血管，且明顯優(yōu)于CD34、Ⅷ因子等血管標記物［9］，而在正常組織的血管中則很少表達.由于CD105在惡性腫瘤組織中的表達可反映腫瘤血管生成和血管內(nèi)皮細胞活躍情況，所以CD105的高表達可作為惡性腫瘤轉(zhuǎn)移及預(yù)后判斷的指標之一［10］.

D2-40是新近發(fā)現(xiàn)的一種單克隆抗體，可與一種40 ku的唾液酸糖蛋白M2A［11-12］特異性結(jié)合，最初發(fā)現(xiàn)它是一種與生殖細胞腫瘤和胎兒睪丸精原細胞相關(guān)的唾液酸糖蛋白，可與M2A腫瘤胚胎性抗原特異性結(jié)合［13］，M2A僅表達于淋巴管內(nèi)皮而不表達于血管內(nèi)皮，臨床研究證明與M2A特異相結(jié)合的D2-40選擇性地表達于淋巴管內(nèi)皮，以區(qū)別于血管內(nèi)皮，在實驗研究中可用能標記淋巴管內(nèi)皮，便于鑒別血管內(nèi)皮，其特異性明顯高于目前常用的淋巴管標記物 VEGF-C、VEGFR-3等，是最具有特異性淋巴管標記物［14］.

VEGF是目前所知的作用最強的血管生成刺激因子［15］之一.VEGF與酪氨酸激酶受體VEGFR-1、VEGFR-2和VEGFR-3等結(jié)合，激活下游信號通路，刺激血管生成［16］.VEGF可特異地作用于血管內(nèi)皮細胞，促進其增殖，同時可間接抑制支持細胞的聚集，導(dǎo)致內(nèi)皮細胞之間、內(nèi)皮細胞與支持細胞之間、內(nèi)皮細胞與基質(zhì)之間的相互作用減弱，破壞血管結(jié)構(gòu)原有的穩(wěn)定性，由此引起毛細血管出芽及生長，形成新生血管；另外，VEGF還能提高血管壁通透性使血漿蛋白滲到血管外，并使?jié)B到血管外的血漿蛋白形成纖維蛋白凝塊，后者成為新生血管的支持物［17］.現(xiàn)有大量實驗研究證明，在許多腫瘤組織中VEGF表達增高，且其水平高低與腫瘤的某些生物學(xué)行為有密切關(guān)系［18-19］.

本實驗中，VEGF及 CD105標記的 MVD、D2-40標記的LVD表達在正常胃組織和非典型增生組中低于胃癌組；而且3者在浸潤較淺以及無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌中的表達均較弱，在浸潤較深以及有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的癌中表達均增強，而且，VEGF陽性組的MVD顯著高于陰性組均符合上述理論.

腫瘤組織中的LVD也與腫瘤的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和浸潤深度呈正相關(guān)，劉新蘭等［20］認為VEGF與其受體結(jié)合后也能促進新生淋巴管的形成，但本研究發(fā)現(xiàn)LVD在VEGF陽性組和陰性組之間無統(tǒng)計學(xué)差異.本實驗觀察發(fā)現(xiàn)胃癌中央淋巴管稀少、且大多閉鎖狀態(tài)，這一現(xiàn)象與部分研究結(jié)果相同［21-22］，可能是由于瘤細胞生長過快擠壓中央淋巴管使其變扁萎縮，成為無功能性淋巴管，同時增加了淋巴管的計數(shù)的難度，當然，也可能是腫瘤淋巴管生成其他因素的影響，有待進一步研究.

此外，腫瘤細胞分泌的VEGF，可導(dǎo)致周圍間質(zhì)中新生的脈管生成，而對這種刺激，無論患者年齡大或小，其機體的反應(yīng)可能都是一致的，所以MVD、LVD與患者年齡、性別上均無差異.

綜上，本研究結(jié)果顯示VEGF可促進腫瘤血管的新生，從而促進腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移；淋巴管的增多可促進腫瘤的淋巴轉(zhuǎn)移［23］.可見，VEGF、CD105、D2-40在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中起重要作用.腫瘤MVD、LVD較高者出現(xiàn)較強的侵襲能力和轉(zhuǎn)移能力.通過聯(lián)合運用VEGF和CD105標識MVD和D2-40標記LVD可較好地預(yù)測胃癌患者的淋巴轉(zhuǎn)移風(fēng)險，指導(dǎo)臨床的治療、預(yù)后評估和治療選擇.

［1］SAHARINEN P，TAMMELA T，KARKKAINEN M J，et al. Lymphatic vasculature： development， molecular regulation and role in tumormetastasis and inflammation［J］.Trends in Immunology，2004，25（7）：387-395.

［2］KARPANEN T，ALITALO K.Lymphatic vessels as targets of tumor therapy［J］.Journal of Experimental Medicine，2001，194（6）：F37-42.

［3］喬宏，杜進榮，付紅，等子宮內(nèi)膜樣癌微血管密度及血管內(nèi)皮生長因子表達的研究［J］.哈爾濱醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2002，36（1）：23-25.QIAO H，DU J R，F(xiàn)U H，et al.Study of microvessel density and the expression of vascular endothelial growth factor in endometrial carcinoma［J］Journal of Harbin Medical University，2002，36（1）：23-25.

［4］WEIDNER N，SPMPLE JP，WELCH W R，et al.Tumor angiogenesis and metastasis-correlation in invasive breast carcinoma［J］.N Engl JMed，1991，324（1）：1-8.

［5］AGARWAL B，SAXENA R，MORIMIYA A，et al.Lymphangiogenesis does not occur in breast cancer［J］.Am JSurg Pathol，2005，29（11）：1449-1455.

［6］王玥，劉愛東，龐久玲，等.CDl05在結(jié)直腸腺癌組織中的表達及意義［J］.山東醫(yī)藥，2007，47（20）：140-141.WANG Y，LIU A D，PANG J L，et al.Expression and clinicopathological significance of CD105 in colorectal cancer［J］.Shandong Medical Journal，2007，47（20）：140-141.

［7］YAO Y，PAN Y，CHEN J，et al.Endodin（CDl05）expression in angiogenesis of primary hepatocellular carcinomas：analysis tissue microarrays and comparisons with CD34 and VEGF［J］.Ann Clin Lab Sic，2007，37（1）：39-48.

［8］GRUDZINSKIM，CAMBRUZZI E，LAHUDE E，et al.Cox-2 and CDl05 expression in breast cancer and diseasefree survival［J］.Rev Assoc Med Bras，2006，52（4）：275-280.

［9］DING S，LI C，LIN S，et al.Comparative evaluation of microvessel density deternmined by CD34 or CDl05 in benign and malignant gastric lesions［J］.Hum Pathol，2006，37（5）：861-866.

［10］牛保華，皇甫超申，趙衛(wèi)，等.CD105及微血管密度與胃癌的關(guān)系［J］.河南大學(xué)學(xué)報（醫(yī)學(xué)版），2008，27（2）：24-25.NIU B H，HUANGPU C S，ZHAOW et al.Relationship between CD105 and MVD of colorectal carainoma［J］.Journal of Henan University（Medical Science），2008，27（2）：24-25.

［11］SUBHOJIT R，ALBERT C，JOHN Q，et al.D2-40，a novelmonoclonal antibody against the M2A antigen as a marker to distinguish hemangioblastomas from renal cell carcinomas［J］.Acta Neuropathologica，2005，109（5）：497-502.

［12］MARKS A，SUTHERLAND D R，BAILEY D，et al.Characterization and distribution of an oncofetal antigen（M2A antigen）expressed on testicular germ cell tumours［J］.Br JCancer，1999，80（3/4）：569-578.

［13］PUSZTASZERI M P， SEELENTAG W， et al.Immunohistochemical expression of endothelial markers CD31，CD34，yon Willebrand factor and Fli-1 in nonnal human tissues［J］.Journal of Histochemistry and Cytochemistry，2006，54（4）：385-395.

［14］GIORGADZE T A，BALOCH Z W，PASHA T，et al.Lymphatic and blood vessel density in the follicular patterned lesions of thyroid.d［J］.Mod Pathol，2005，18（11）：1424-1431.

［15］HOMSIJ，DAUD A I.Spectrum of activity and mechanism of action of VEGF/PDGF inhibitors［J］.Cancer Control，2007，14（3）：285-294.

［16］CEBE-SUAREZ S，ZEHNDER-FJALLMAN A.The role of VEGF receptors in angiogenesis；complex partnerships［J］.Cellular and Molecular Life Sciences，2006，63（5）：601-615.

［17］REINDERS M E，SHO M，IZAWA A，et al.Prointlammatory functions of vaseula endothelial growth factor in alloimmunity［J］.JClin Invest，2003，112（11）：1655-1665.

［18］陳秀慧，曲軍英.Ang-2及VEGF在早期宮頸癌中的表達及與血管及淋巴管密度的相關(guān)性［J］.福建醫(yī)藥雜志，2011，33（1）：4-7.CHEN X H，QU JY.Correlation between expression of Ang-2 and VEGF and the density of new blood vessels and lymphatic at early stage of cervical cancer development［J］.Fujian Medical Journal，2011，33（1）：4-7.

［19］KATO Y，ASANO K，MOGI T，et al.Clinical sig nificance of circulating vascular endothelial growth factor in dogs with mammary gland tumors［J］.Vet Med Sci，2007，69（1）：77-80.

［20］劉新蘭，李亦工，馬志蘭.胃癌組織中VEGF-C、VGFR-3表達和微淋巴管密度的研究［J］.寧夏醫(yī)學(xué)雜志，2014，36（5）：385-387；384.LIU X L，LIY G，MA Z L，et al.A study on expression of VEGF-C and VEGFR-3 and study on the lymphatic microvessel density in gastric carcinoma［J］.Ningxia Medical Journal，2014，36（5）：385-387；384.

［21］TOLL A，GIMENO-BELTRáN J，F(xiàn)ERRANDIZ-PULIDO C，et al.D2-40 immunohistochemical over expression in cutaneous squamous cell carcinomas：a marker of metastatic risk［J］.Journal of the American Academy of Dermatology，2012，67（6）：1310-1318.

［22］萬琳琳，趙光明，展瑞，等.D2-40標記微淋巴管密度對乳腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的臨床意義［J］.現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué)，2015，15：2136-2138.WANG L L，ZHANO G M，ZHAN R，et al.Detection of D2-40 marked micro-lymphatic vessel density in the tissues of human breast cancer［J］.Journal of Modern Oncology，2015，15：2136-2138.

［23］SUNDOV Z，TOMIC S，ALFIREVIC S，et al.Prognostic value of MVD，LVD and vascular invasion in lymph nodenegative colon cancer［J］.Hepato-Gastroenterology，2013，60（123）：432-438.