高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)常染色體隱性Alport綜合征兩個(gè)家系遺傳特征的實(shí)驗(yàn)診斷研究*

李 昂，吳維青，呂 辛，崔英霞，夏欣一，劉志紅，李曉軍

(1.江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)院，江蘇鎮(zhèn)江 212013；2.解放軍南京總醫(yī)院a.檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)研究所；b.腎臟病研究所，南京 210002)

Ⅳ型膠原基因COL4A3，COL4A4和COL4A5突變可導(dǎo)致Alport綜合征(Alport syndrome，AS)，三個(gè)基因分別包含52，47，51個(gè)外顯子，且沒(méi)有突變熱點(diǎn)，應(yīng)用傳統(tǒng)Sanger測(cè)序進(jìn)行基因診斷費(fèi)時(shí)費(fèi)力且價(jià)格高昂[1]。COL4A3，COL4A4基因突變臨床表型具有高度異質(zhì)性，可導(dǎo)致常染色體顯性AS，常染色體隱性AS，良性家族血尿(benign familial hematuria，BFH)等[2]。臨床上對(duì)AS和BFH的診療方案及預(yù)后判斷不同，疾病早期癥狀不典型，故很難進(jìn)行鑒別診斷[3]，因此，應(yīng)用恰當(dāng)方法對(duì)疑似AS患者及家系進(jìn)行早期病因?qū)W診斷及鑒別診斷尤為重要。二代測(cè)序技術(shù)(next generation sequencing，NGS)由于其高通量、低成本等優(yōu)勢(shì)逐漸應(yīng)用于科研及臨床診斷[4]。本研究擬探討靶基因捕獲聯(lián)合二代測(cè)序技術(shù)在AS病因診斷及家系不同臨床表型成員遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)診斷中的應(yīng)用價(jià)值。

1材料與方法

1.1 研究對(duì)象 2012年1月～2014年12月期間，在南京軍區(qū)南京總醫(yī)院就診的2個(gè)遺傳性腎病家系，先證者依據(jù)經(jīng)典gregory標(biāo)準(zhǔn)[5]確診為Alport綜合征，2家系先證者的父母均為近親婚配，見(jiàn)圖1。

1.2 試劑和儀器 QIAamp DNA Blood MiNi Kit(Qiagen，Hilden，Germany)基因組DNA提取試劑；課題組自行設(shè)計(jì)的遺傳性腎病捕獲芯片(NimbleGen，Roche)；Illumina Hiseq2500測(cè)序平臺(tái)(美國(guó))；ABI 3730xl DNA測(cè)序儀。

1.3 研究方法

1.3.1 基因組DNA的提?。航?jīng)患者簽署知情同意書(shū)后，抽取先證者及家系成員外周血4 ml，EDTA抗凝，按照全血DNA提取試劑盒標(biāo)準(zhǔn)步驟進(jìn)行。

1.3.2 靶序列捕獲芯片的設(shè)計(jì)：根據(jù)NCBI和OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)，確定常見(jiàn)遺傳性腎病(包括 PKD，AS，BFH，SRNS等)的相關(guān)78個(gè)致病基因，根據(jù)這些基因序列設(shè)計(jì)特異雜交捕獲探針，捕獲區(qū)域包含這些基因外顯子及側(cè)翼序列，制定特異性遺傳腎病相關(guān)基因捕獲芯片(NimbleGen，Roche)。

1.3.3 目標(biāo)區(qū)域高通量二代測(cè)序：根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)流程進(jìn)行目標(biāo)序列的捕獲和富集、測(cè)序文庫(kù)的建立和高通量測(cè)序，大體步驟如下：使用超聲波儀將基因組DNA打斷變成200～300 bp的碎片(Covaris S2，Massachusetts，USA)。末端連接Illumina的寡核苷酸接頭(單端)，在連接完成后使用一種高保真聚合酶以及包含定制barcode序列的PCR引物4個(gè)循環(huán)的擴(kuò)增來(lái)驗(yàn)證接頭連接是否成功。通過(guò)PCR來(lái)完成文庫(kù)構(gòu)建并用于進(jìn)一步分析，來(lái)自10個(gè)文庫(kù)的DNA接頭連接片段和索引片段被混在一起并與定制的寡核苷酸探針進(jìn)行雜交。完成雜交和清洗后，使用300 ml洗脫緩沖液(qiagen，valencia，CA，USA) 洗脫探針溶液中與寡核苷酸探針結(jié)合在一起的DNA片段。測(cè)序引物完成雜交之后，在中國(guó)天津華大基因股份有限公司的Illumina Hiseq2500平臺(tái)上(illumine，San Dieago，CA，USA)進(jìn)行雙端測(cè)序。

1.3.4 生物信息學(xué)分析：測(cè)序獲得的原始數(shù)據(jù)由Illumina Pipeline version (1.3.4版)軟件進(jìn)行處理，經(jīng)過(guò)濾去污染后使用BWA軟件包(Burrows Wheeler Aligner)比對(duì)干凈讀數(shù)[6]。由GATK IndelGenotyper確定插入和缺失變異，SOAP snp軟件確定SNP[7]。分析數(shù)據(jù)流程中使用的對(duì)照人群數(shù)據(jù)庫(kù)包括千人基因組數(shù)據(jù)庫(kù)，dbSNP數(shù)據(jù)庫(kù)和華大內(nèi)部數(shù)據(jù)庫(kù)。采用PolyPhen-2[8]和SIFT algorithm[9]算法來(lái)預(yù)測(cè)錯(cuò)義突變對(duì)基因功能的影響，用Phylop (phyloP46wayPlacental)軟件來(lái)計(jì)算變異位點(diǎn)的保守度。

1.3.5 Sanger驗(yàn)證：根據(jù)基因組序列，應(yīng)用Primer Premier 5軟件設(shè)計(jì)上述NGS測(cè)序發(fā)現(xiàn)的突變位點(diǎn)特異性引物，PCR擴(kuò)增先證者及家系所有成員相應(yīng)位點(diǎn)，應(yīng)用Sanger測(cè)序法進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。

1.3.6 基因型和表型分析：綜合分析2個(gè)家系所有成員的臨床表型、實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果、病理診斷結(jié)果及基因突變結(jié)果。

2結(jié)果

2.1 NGS測(cè)序結(jié)果 家系F1先證者(Ⅱ1)檢測(cè)到COL4A3基因純合突變c.3769G>A(p.G1257R)，家系F2先證者檢測(cè)到COL4A4 基因c.1715G>C(p.G572A)純合突變。

2.2 生物信息學(xué)分析結(jié)果 COL4A3 c.3769G>A和COL4A4 c.1715G>C均為甘氨酸置換突變，分別置換為精氨酸和丙氨酸。在千人基因組數(shù)據(jù)庫(kù)，dbSNP數(shù)據(jù)庫(kù)和華大內(nèi)部數(shù)據(jù)庫(kù)中均無(wú)頻率記錄，Phylop(phyloP46wayPlacental)軟件預(yù)測(cè)突變高度保守，PolyPhen-2和SIFT algorithm均預(yù)測(cè)突變有害。根據(jù)ACMG標(biāo)準(zhǔn)[10]，這兩個(gè)錯(cuò)義突變均屬于可能致病性突變。

2.3 Sanger測(cè)序驗(yàn)證結(jié)果 F1家系先證者(F1-Ⅱ1)攜帶COL4A3基因純合突變 c.3769G>A(p.G1257R)，先證者父母及胞妹均為此突變的雜合子，見(jiàn)圖2；F2家系先證者(F2-Ⅱ1)攜帶COL4A4基因純合突變c.1715G>C(p.G572A)，先證者父母及胞妹均為此突變的雜合子，見(jiàn)圖3。

2.4 基因型和表型分析結(jié)果

2.4.1 家系F1：具有COL4A3基因純合突變 c.3769G>A(p.G1257R)的先證者(F1-Ⅱ1)，其臨床表現(xiàn)為血尿、蛋白尿、肌酐輕度增高伴高頻感音性耳聾；電鏡下基底膜厚薄不一、致密層撕裂分層；Ⅳ型膠原免疫熒光檢測(cè)結(jié)果顯示基底膜α3鏈節(jié)段缺失，α5鏈完全缺失；臨床診斷為AS。攜帶雜合COL4A3 c.3769G>A突變的先證者父母(F1-Ⅰ1，F(xiàn)1-Ⅰ2)、胞妹(F1-Ⅱ2)的臨床表現(xiàn)均為孤立性血尿，見(jiàn)表1。

家系F2：具有COL4A4 c.1715G>C(p.G572A)純合錯(cuò)義突變的先證者(F2-Ⅱ1)，其臨床表現(xiàn)為血尿、蛋白尿、正常腎功能伴高頻感音性耳聾；電鏡下基底膜厚薄不一、致密層撕裂分層，呈“花籃樣”改變；IV型膠原免疫熒光檢測(cè)結(jié)果顯示基底膜α3鏈和α5鏈均節(jié)段缺失；臨床診斷為AS。攜帶COL4A4 c.1715G>C(p.G572A)雜合突變的先證者母親(F2-Ⅰ2)及胞妹(F2-Ⅱ2)臨床表現(xiàn)為孤立性血尿，而同樣為此突變的雜合子的先證者父親(F2-Ⅰ1)未見(jiàn)異常表現(xiàn)，見(jiàn)表1。

Hom，homozygote代表純合子；Het，Heterozygote代表雜合子。

Hom，homozygote代表純合子；Het，Heterozygote代表雜合子。

表1 兩個(gè)AS家系成員臨床資料和基因突變結(jié)果

3討論Alport綜合征(AS)是遺傳性腎病最常見(jiàn)的類型之一，致病基因?yàn)棰粜湍z原編碼基因COL4A3，COL4A4及COL4A5。COL4A3和COL4A4基因突變可導(dǎo)致常染色體顯性或隱性Alport綜合征，而COL4A5基因突變導(dǎo)致X連鎖隱性AS[11]。這三個(gè)基因分別包含52，47，51個(gè)外顯子，且沒(méi)有突變熱點(diǎn)，因而應(yīng)用傳統(tǒng)的PCR結(jié)合Sanger測(cè)序法進(jìn)行致病基因突變成本昂貴且耗時(shí)耗力。本課題組，自行設(shè)計(jì)了遺傳性腎病致病基因捕獲芯片，結(jié)合二代測(cè)序技術(shù)，可對(duì)導(dǎo)致Alport綜合征、多囊腎等多種遺傳性腎病78個(gè)基因同時(shí)進(jìn)行突變檢測(cè)。我們的研究數(shù)據(jù)表明，本檢測(cè)方法能夠在較短時(shí)間內(nèi)明確絕大多數(shù)AS患者致病原因，也可對(duì)表型較為輕微的疑似患者進(jìn)行鑒別診斷。鑒于靶基因捕獲二代測(cè)序技術(shù)所具有的高通量、低成本及在致病基因突變檢測(cè)的有效性，在Alport綜合征病因診斷、鑒別診斷等方面已經(jīng)開(kāi)始取代傳統(tǒng)的Sanger測(cè)序，發(fā)揮了越來(lái)越重要的作用。

COL4A3和COL4A4基因編碼Ⅳ型膠原蛋白α3，α4鏈，這兩個(gè)基因雜合突變可引起常染色顯性Alport綜合征[3]，薄基底膜病(thin basement membrane nephropathy，TBMB)或稱為家族良性血尿(benign familial hematuria，BFH)[2]，也有研究表明亦和局灶性節(jié)段性腎小球硬化癥(FSGS)相關(guān)[12]。也就是說(shuō)COL4A3或COL4A4基因的雜合突變表型具有非常高的異質(zhì)性，攜帶者臨床表現(xiàn)譜非常廣泛，包含了完全正常、BFH及Alport綜合征；即便是在攜帶同一突變的同一家系內(nèi)部，不同成員的臨床表現(xiàn)也具有明顯差異。本研究家系F2中，同樣為COL4A4 c.1715G>C突變攜帶者，F(xiàn)2-I 2和F2-Ⅱ1表現(xiàn)為BFH，而F2-I 1則完全正常，也證明了Ⅳ型膠原基因變異臨床表型的異質(zhì)性，這可能和疾病不全外顯有關(guān)。

BFH和常染色體隱性Alport綜合征可同時(shí)影響一個(gè)家系，但二者的臨床表現(xiàn)及預(yù)后明顯不同，Alport綜合征臨床表現(xiàn)為血尿、蛋白尿、進(jìn)行性腎損傷伴或不伴高頻感音性耳聾及視力異常，而B(niǎo)FH以孤立性血尿?yàn)榕R床特征，腎功能往往正常。早期使用血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑(ACEI)可有效緩解Alport綜合征進(jìn)展為終末期腎病，而B(niǎo)FH可僅觀察及預(yù)防，所以兩種疾病的早期診斷和鑒別診斷尤為重要[13～15]。以往BFH和Alport綜合征的診斷依賴臨床癥狀和病理，但在早期臨床癥狀和病理結(jié)果不典型情況下，做出明確診斷非常困難[16]，而且不是所有患者或家屬能夠接受活檢這樣的有創(chuàng)檢測(cè)。而外周血標(biāo)本進(jìn)行基因診斷卻具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，相比于病理診斷，其對(duì)病人造成的創(chuàng)傷小且更加精準(zhǔn)高效，結(jié)果不隨病人疾病進(jìn)展發(fā)生變化。本研究中，攜帶基因突變的夫妻生育的每個(gè)孩子都有四分之一的概率為Alport綜合征患者，而兩家系先證者胞妹均具有血尿表現(xiàn)，因而不能排除Alport綜合征的可能。經(jīng)過(guò)基因診斷，均被證明為基因突變攜帶者。我們建議，針對(duì)有血尿傾向的疑似Alport綜合征的家系，尤其是有血尿家族史而無(wú)詳細(xì)臨床和病理資料時(shí)，家系所有成員都需進(jìn)行基因診斷、明確基因型，這不僅有助于已有臨床表現(xiàn)患者的鑒別診斷，還可以預(yù)測(cè)其他家系成員將來(lái)可能的臨床表現(xiàn)，從而指導(dǎo)家系的遺傳咨詢和精準(zhǔn)診療。

總之，我們的研究表明靶基因捕獲聯(lián)合高通量測(cè)序技術(shù)在Alport綜合征病因診斷中發(fā)揮重要的作用；結(jié)合Sanger測(cè)序法，可對(duì)Alport綜合征家系不同表型患者做出精準(zhǔn)診斷；建議具有家族性血尿的家系所有患者都進(jìn)行基于二代測(cè)序的基因突變檢測(cè)，為家系的精準(zhǔn)診療和遺傳咨詢創(chuàng)造條件。

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