濃香型白酒大曲在發(fā)酵和成熟過程中主要功能酶活力分析

王玉霞,李 兵,2,申孟林,2,尹旭敏,郭小麗,陳 橋,張 超,*

(1.宜賓學院生命科學與食品工程學院,四川宜賓 644000; 2.西華大學食品與生物工程學院,四川成都 610039; 3.重慶農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工研究所,重慶 401329)

白酒是中國的國酒[1],具有悠久的歷史,與威士忌、白蘭地、朗姆酒、伏特加和金酒并稱為世界六大蒸餾酒。我國是世界上利用微生物制曲釀酒最早的國家,具有世界獨創(chuàng)性的白酒固態(tài)發(fā)酵、固態(tài)蒸餾生產(chǎn)工藝。制曲釀酒技術,經(jīng)歷了幾千年的傳承和發(fā)展,使中國白酒成為享譽全球的發(fā)酵酒精飲品[2]。大曲是影響大曲酒釀造最為關鍵的因素之一,具有糖化、發(fā)酵、酒化和生香等功能,不僅為大曲酒的發(fā)酵、成香提供必不可少的微生物菌群和風味前驅物,還提供發(fā)酵所必需的豐富生物催化劑——酶類[3]。

大曲中的酶類根據(jù)催化功能可分為淀粉酶、蛋白酶、氧化還原酶、酯化酶、脂肪酶、纖維素酶、半纖維素酶、單寧酶、裂解酶、果膠酶和異構酶等酶類[4]。大曲內豐富的功能酶系在釀酒過程中所起的復雜作用,是大曲酒品質和產(chǎn)量的重要保障,這使得大曲成為我國白酒釀造過程品質控制的核心指標之一。大曲具有“一菌產(chǎn)多酶,一酶源于多菌”的特征,構成了大曲復雜的菌系、酶系基礎[5-7]。

大曲的生產(chǎn)工藝主要包括:原料選配、潤糧破碎、壓制成型、接種發(fā)酵和貯存后熟等五個工序[6],其中后兩個工序,通過不同的工藝手段,控制溫度、水分和曲塊內部氧氣濃度等各項條件,使其有利于特定風格大曲的形成。期間通過微生物菌群錯綜復雜的發(fā)展演變和更迭交替,最終形成種類繁多而又必不可少的龐大功能酶系。

基于大曲發(fā)酵環(huán)境狀況以及大曲內菌群微生態(tài)條件的不斷變化,曲塊表層與內部微生物群系的演變更迭,以及微生物產(chǎn)生的功能酶系對白酒釀造所具有的非凡意義,許多學者針對大曲與特定酶活力的研究,主要集中在各酶系的作用、制曲時間對酶活力的影響,以及成品曲存放期酶活力的變化和特殊產(chǎn)酶微生物等方面[6,8-9]。如李祖明對清香和醬香四種成熟酒曲的糖化酶和蛋白酶等活力進行了分析比較,結果顯示不同類型大曲糖化酶和蛋白酶活力變化差異明顯[10]。魯珍等從高溫醬香白酒大曲中分離了高產(chǎn)糖化酶菌株,其中蠟樣芽胞桿菌(Bacilluscereus)GX06產(chǎn)糖化酶能力最強,糖化酶活性可達917.03 U/g[11]。在眾多大曲酶相關研究中,針對濃香型大曲特殊發(fā)酵、成熟工藝,跟蹤同一批大曲,從制作、發(fā)酵到存放成熟過程中主要酶活力變化規(guī)律,以及與同時期微生物類群相互對應關系的研究,還較為少見。因此,課題組對大曲制作、發(fā)酵、成熟過程中主要功能酶活力變化規(guī)律及特定產(chǎn)酶微生物種屬多樣性進行了考察。擬通過對不同時期α-淀粉酶、單寧酶、木聚糖酶和脂肪酶活力的測定,分析曲皮和曲心酶活變化規(guī)律,以期為高產(chǎn)功能酶微生物的利用、制曲工藝的優(yōu)化以及特定加強型功能大曲酶制劑的研制提供基礎數(shù)據(jù)和理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大曲樣品 宜賓傳統(tǒng)濃香型大曲制曲工廠;冰乙酸、酒石酸鉀鈉、三氯乙酸、可溶性淀粉、果膠、酪氨酸、酪蛋白、福林酚試劑、環(huán)己烷、3,5-二硝基水楊酸 均為分析純,成都科龍化工試劑廠。

PB2002-N稱量天平、AB204-E分析天平 Mettler-Toledo公司;Delta 320-S精密pH計 瑞士Mettler Toledo公司;Spectramax-M2酶標儀 美國Molecular Devices;3K冷凍高速離心機 德國Sigma公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 取樣及處理 隨機選擇夏季開始制作的某批大曲,全程跟蹤其制作、發(fā)酵和成熟過程,并在成形、長霉、起火、大火、后火、養(yǎng)曲、成熟1月、成熟2月、成熟3月和出庫使用十個關鍵點取樣。在曲房不同位置隨機挑6塊大曲,每塊大曲沿對角線分開,每半塊大曲分別切取表皮往內的0～3 cm為曲皮樣、從曲塊的心部往外0～3 cm為曲心樣品,再將其分別粉碎,-20 ℃儲存?zhèn)溆?。各樣品編號見?。

表1 樣品編號及說明Table 1 Sample code and detail

1.2.2 大曲宏蛋白酶液的提取 根據(jù)文獻[12]方法改進:稱取5.0 g大曲粉,于10 mL乙酸-乙酸鈉緩沖溶液中(0.1 mol/L,pH4.6),4 ℃條件浸提過夜,4層紗布過濾,濾液在4 ℃條件下4000 r/min離心10 min,棄去沉淀,上清液即為大曲宏蛋白粗酶提取液,重復三次,合并提取液于-20 ℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3α-淀粉酶活力測定 根據(jù)文獻[13]方法稍作改進:取1 mL粗酶液于70 ℃保溫15 min后,加入1%(w/v)淀粉溶液1 mL,于40 ℃水浴中保溫反應5 min后,迅速冷卻至室溫。取適量酶解液適當稀釋后,以DNS法測定反應體系中還原糖濃度并換算成大曲α-淀粉酶活力,重復三次。

α-淀粉酶活力定義(U):在40 ℃、pH4.6的條件下,1.0 g大曲1 min分解可溶性淀粉產(chǎn)生1.0 mg麥芽糖所需要的酶量。

α-淀粉酶活力(U)=C×稀釋倍數(shù)×10/5/T/反應酶量

式中:C為還原糖濃度(mg/mL);10為提取的粗酶液量(mL);5為稱取的大曲量(g);T為反應時間(min)。

1.2.4 單寧酶活力測定 按照參考文獻[14-15]的方法進行操作。

單寧酶活力定義(U):在30 ℃、pH5.0條件下,1.0 g大曲1 min分解沒食子酸丙酯產(chǎn)生1.0 mg沒食子酸所需要的酶量。

單寧酶活力(U)=C×稀釋倍數(shù)×10/5/T/反應酶量

式中:C為沒食子酸濃度(mg/mL);10為提取的粗酶液量(mL);5為稱取的大曲量(g);T為反應時間(min)。

1.2.5 木聚糖酶活力測定 按照參考文獻[16-17]的方法進行操作。

木聚糖酶活力定義(U):在40 ℃、pH4.6條件下,1.0 g大曲1 h分解木聚糖產(chǎn)生1.0 mg木糖所需要的酶量。

木聚糖酶活力(U)=C×10/5/T/反應酶量

式中:C為木糖濃度(mg/mL);10為提取的粗酶液量(mL);5為稱取的大曲量(g);T為反應時間(h)。

1.2.6 脂肪酶活力測定 按照參考文獻[18-19]的方法進行操作。

脂肪酶活力定義(U):在37 ℃、pH4.6的條件下,1.0 g大曲1 min分解對硝基苯酚棕櫚酸酯產(chǎn)生1.0 mg對硝基苯酚所需要的酶量。

脂肪酶活力(U)=C×10/5/T/反應酶量

式中:C為對硝基苯酚濃度(mg/mL);10為提取的粗酶液量(mL);5為稱取的大曲量(g);T為反應時間(min)。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

數(shù)據(jù)應用SPSS 19.0處理分析,以平均值±標準偏差表示。

2 結果與分析

2.1 大曲α-淀粉酶活力變化情況

大曲制作的原料中含有大量淀粉類物質,為提供給自然接種后曲塊表層與內部微生物生長繁殖需要,離不開原料中淀粉類物質的降解,α-淀粉酶能催化淀粉分子內部α-1,4糖苷鍵斷裂而獲得還原糖和糊精為微生物提供營養(yǎng)[20-21]。實驗對大曲發(fā)酵與成熟過程中α-淀粉酶活力變化規(guī)律的分析,結果如圖1所示。

圖1 大曲α-淀粉酶活力分析Fig.1 α-Amylase activities in the Daqu注:(A):曲皮,(B):曲心;不同小寫字母 表示差異顯著(p<0.05),不同大字字母 表示差異極顯著(p<0.01),圖2～圖4同。

圖1數(shù)據(jù)顯示,在整個考察時間段內,曲皮樣品中α-淀粉酶活力變化情況,總體上呈現(xiàn)出先升高再降低,最后趨于平緩的變化趨勢。在曲塊的發(fā)酵階段(P1～P4),酶活力迅速升高,于大火期(P4)達到最大值765.78 U,較初始樣品(P1)酶活力提高了8.39倍。進入成熟階段后(P7～P10),曲塊的α-淀粉酶活力呈現(xiàn)出較為緩慢的降低變化,至成熟三個月時期后,酶活力基本保持著550 U左右較為平穩(wěn)的狀況(P9～P10)。

曲心樣品中最高酶活力出現(xiàn)在大曲成熟階段(X7～X10),為成熟一個月大曲樣品(X7)912.09 U,較初始樣品酶活力提高了863.56%,且曲塊發(fā)酵和成熟階段曲心α-淀粉酶活力變化差異較大(p<0.05)。發(fā)酵階段,曲心樣品α-淀粉酶活力表現(xiàn)出迅速升高與較緩回落的變化情況,峰值為曲心大火期X4樣品。而進入成熟階段后一個月時,α-淀粉酶活力又再次快速升高,達到整個考察期的活力極值(X7),隨后又迅速下降并維持著平穩(wěn)活力狀況直至出庫使用。分析這個現(xiàn)象的原因可能為,曲塊培育期間微生物大量生長繁殖,α-淀粉酶產(chǎn)生菌群產(chǎn)生的酶在細胞內,進入存貯期后,曲庫環(huán)境與曲塊內的微環(huán)境的差異變化較大,使得原本在細胞內的酶類,由于菌體營養(yǎng)細胞的大量死亡而釋放了出來[20]。

2.2 大曲單寧酶活力變化情況

單寧酶(E.C.3.1.1.20)是指能水解單寧酸分子中酯縮酚酸鍵而釋放出沒食子酸、葡萄糖和沒食子酰基酯的一類水解酶[22]。以沒食子酸法測定大曲曲皮和曲心樣品單寧酶活力情況如圖2所示。

圖2 大曲單寧酶活力分析Fig.2 Tannase activities in Daqu

通過測定反應體系中沒食子酸含量,考察濃香型大曲曲塊在發(fā)酵和成熟階段,單寧酶活力變化結果(圖2)顯示,所有大曲樣品酶活力變化范圍為5.07～34.18 U。其中,曲皮樣品的酶活力變化幅度是5.24～34.18 U,曲心為5.07～27.89 U。

大曲曲皮樣品中的單寧酶活力在整個研究階段有兩個較為快速的上升時期和一個較緩慢的下降時期(圖2A)。P1到P2時期為第一個快速上升的階段,單寧酶活力由5.24 U上升到20.20 U,隨后出現(xiàn)小幅波動(P2～P4),由大火進入后火期時,濃香型大曲的曲皮單寧酶活力再次迅速升高,達到曲皮樣品中最大酶活力34.18 U(P5)。隨著發(fā)酵的進行和曲塊入庫的存貯成熟,酶活力又開始逐漸下降至三個月成熟期的最低值6.70 U。根據(jù)圖2B結果可以得出,由大曲成形開始,曲心單寧酶活力呈現(xiàn)出相對較為平穩(wěn)的增大變化,至后火樣品(X5)酶活力最大,比成形(X1)時酶活力提高了5.50倍,但比同時期曲皮樣品(P5)最大單寧酶活力值低了6.29 U。

分析比較曲皮和曲心樣品單寧酶活力變化情況可以發(fā)現(xiàn),曲皮和曲心樣品總單寧酶活力變化趨勢較為相似,平均單寧酶活力為16.09 U和14.47 U,差異不顯著(p>0.05)。整個研究階段中,酶活力的動態(tài)變化現(xiàn)象,揭示出隨著曲塊發(fā)酵成熟的進行,大曲曲皮或曲心微生態(tài)環(huán)境條件的改變,導致產(chǎn)酶微生物類群或產(chǎn)酶優(yōu)勢微生物種屬發(fā)生變化,以及衰老細胞的凋亡使原本在細胞內的酶被釋放到大曲物料中的可能機制。

2.3 大曲木聚糖酶活力變化情況

在白酒釀制過程中,木聚糖酶能降解原料中的半纖維素,加速其它酶或微生物對原料的轉化利用,從而提高發(fā)酵效率、增加出酒率[23-24]。在整個研究階段內,大曲樣品木聚糖酶活力結果如圖3所示。

圖3 大曲木聚糖酶活力分析Fig.3 Xylanase activities in Daqu

由圖3可知,曲皮與曲心樣品的木聚糖酶活力變化趨勢具有一定相似性。其中,曲皮樣品的木聚糖酶活力在曲塊的發(fā)酵期間(圖3A),逐級上升至P6時期達到最大值119.72 U,顯著高于其它曲皮樣品酶活力,較大曲成形時樣品(P1)的酶活力提高了106.05 U。隨著曲塊入庫成熟時間的延長,大曲曲皮樣品木聚糖酶活力逐級下降,在使用時略有上升,最終酶活力值為99.85 U,較成熟階段的最小值增加了31.61 U,但比養(yǎng)曲時期的最大活力降低了19.87 U。

曲心樣品中木聚糖酶活力變化情況主要表現(xiàn)出逐級升高再迅速下降的規(guī)律。曲心樣品木聚糖酶活力范圍為13.67～80.51 U,最高活力也為養(yǎng)曲階段的X6樣品,進入曲庫后的成熟期前期(X7),曲心樣品酶活力并未如曲皮樣品同一時期(P7)活力值出現(xiàn)下降的情況,而是大致保持著最高酶活力。隨著成熟時間的進一步延長,曲心樣品木聚糖酶活力急速下降,達到三個月成熟時間的最低值(47.09 U),較最高活力降低了41.51%。

2.4 大曲脂肪酶活力變化情況

在白酒制曲和發(fā)酵期間,脂肪酶參與脂肪類物質的水解,使白酒發(fā)酵過程中酵母等微生物能夠較為充分地利用和轉化原料,提高出酒率。此外,脂肪酶的酶促作用,還能提高酒體中有機酸和甘油的含量,對白酒口感的醇厚、豐滿有較好的提升作用。大曲在整個發(fā)酵、成熟過程中脂肪酶活力變化趨勢顯示(圖4),曲皮、曲心樣品間變化規(guī)律差異明顯,但總體趨勢上呈現(xiàn)出初期低后期高的變化。曲皮各樣品在整個考察時期內,脂肪酶酶活力呈現(xiàn)出先上升后下降再上升下降的波浪式動態(tài)變化。曲皮樣品脂肪酶活力在曲塊成形時(P1)只有75.31 U,隨著曲塊發(fā)酵的進行,酶活力迅速升高到起火時期(P3)達到一個小峰值(288.64 U);當曲塊發(fā)酵進入大火期后,酶活力下降了104.05 U(P4),隨后再次迅速升高達到曲皮樣品的最大酶活力階段(P6),較P1提高了7.29倍。隨著大曲發(fā)酵進程的結束,進入成熟期的曲塊脂肪酶活力,處于持續(xù)降低的階段,到曲塊成熟完成時,曲皮樣品脂肪酶活力值僅為231.38 U。

圖4 大曲脂肪酶活力分析Fig.4 Lipase activities in Daqu

與曲皮樣品相比,曲心樣品中脂肪酶活力在大曲發(fā)酵至成熟的整個過程中,發(fā)酵階段的酶活力一直處于較為平穩(wěn)的緩慢增長,至入庫成熟的一個月時期達到極大值597.50 U(X7),比曲皮樣品P6的最大活力高48.42 U。隨著成熟期的延長,至成熟兩個月(X8)時曲心樣品脂肪酶活力急劇降低了221.26 U。隨后,酶活力再次開始緩慢升高,至曲塊使用時活力達到496.33 U,比曲心樣品的最高酶活力降低了16.93%。

3 結論

大曲是大曲酒生產(chǎn)必不可少的起酵劑,其中功能各異的酶系是大曲酒品質和產(chǎn)量保障的重要基礎。在大曲發(fā)酵和成熟過程中,不同的微生物在曲塊中的競爭生長和優(yōu)勝劣汰,并隨著微生物生長和微環(huán)境條件的改變,造成了主要產(chǎn)酶微生物類群或產(chǎn)酶優(yōu)勢微生物的種屬變化,使四種酶活力出現(xiàn)不同程度波動或升降的變化。

本研究主要針對大曲中α-淀粉酶、單寧酶、木聚糖酶和脂肪酶活力在大曲發(fā)酵、成熟過程中的變化情況進行測定分析。實驗結果表明,在整個考察時間內:

a.曲皮樣品中α-淀粉酶活力在發(fā)酵初期升高后,基本在523.28～765.78 U范圍內波動,而曲心樣品中該酶活力升降變化幅度大于曲皮樣品。

b.單寧酶活力在曲皮和曲心樣品間變化規(guī)律較為相似,都呈現(xiàn)出先迅速升高,在后火期達到最大值后再緩慢降低的變化情況。

c.曲皮樣品的木聚糖酶活力變化情況為,持續(xù)上升至養(yǎng)曲階段達到最大值119.72 U后逐漸下降;而曲心木聚糖酶活力在養(yǎng)曲和成熟初期活力最大。

d.脂肪酶活力變化趨勢,曲皮樣品與曲心樣品之間差異較大,其中曲皮樣品的酶活力是先升高再降低,然后出現(xiàn)再次升高降低的變化規(guī)律;而曲心樣品的脂肪酶活力一直表現(xiàn)出持續(xù)升高至最大值后急劇下降,然后再次緩慢升高的變化情況。

分析曲皮和曲心樣品最大酶活力出現(xiàn)階段,為分離篩選特定功能酶產(chǎn)生菌提供了重要的借鑒,如篩選高產(chǎn)脂肪酶微生物的適宜時期主要集中在發(fā)酵后期至成熟前期階段。本實驗結果以及課題組同期進行的其它酶活力分析、相應產(chǎn)酶微生物多樣性、大曲宏基因組分析等方向的研究,不但為特定功能加強型大曲的研制和功能酶制劑的開發(fā)提供參考,也將在一定程度上完善大曲微生物與功能酶系的關系打下基礎,各種現(xiàn)象的可能性推測也為課題組對大曲的深入研究,提供了借鑒的思路。

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