海洋藻類藻膽蛋白的提取、純化與應(yīng)用研究進展

于 嬌,胡 曉,楊賢慶,陳勝軍,*

(1.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所,國家水產(chǎn)品加工技術(shù)研發(fā)中心, 農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品加工重點實驗室,廣東廣州 510300; 2.上海海洋大學(xué)食品學(xué)院,上海 201306)

我國海洋藻類資源豐富,海水養(yǎng)殖面積達140千公頃,年產(chǎn)量高達217萬t[1],具有巨大的碳匯潛力[2]和經(jīng)濟開發(fā)價值。迄今,雖然部分海藻已實現(xiàn)工業(yè)化培育、養(yǎng)殖和采收,但海洋藻類仍舊作為初級產(chǎn)品進入銷售市場,高新技術(shù)利用不足,精深加工產(chǎn)品較少,海洋藻類經(jīng)濟效益有待提升。藻膽蛋白(phycobiliprotein,PBP),作為一種具有良好生理功能和生物活性的海藻提取物,主要存在于紅藻、藍藻、隱藻和一些甲藻中,可根據(jù)光譜特性的差異分為藻紅蛋白(phycoerythrin,PE)、藻藍蛋白(phyeocyanin,PC)、別藻藍蛋白(allphycocyanin,APC)和藻紅藍蛋白(phycoerythrocyanin,PEC)。其中PE可根據(jù)其光譜特性的細微差異分為R-PE、C-PE、B-PE,而PC又可分為R-PC和C-PC[3],簡稱前分別冠以C-、B-、R-,這些字母用于表示不同的吸收光譜特性[4]。PBP因具有良好的生理功能和生物活性而用途廣泛,其良好的熒光特性被廣泛應(yīng)用于臨床醫(yī)學(xué)、免疫學(xué)和細胞學(xué)等應(yīng)用領(lǐng)域,其光敏特性可作為光敏劑應(yīng)用于醫(yī)療領(lǐng)域,其作為一種純天然、無公害的色素還可應(yīng)用于食品、化妝品和染料等工業(yè)領(lǐng)域,其抗氧化、抗炎癥和抗腫瘤等生物活性可作為保健成分應(yīng)用于保健食品和藥品行業(yè)領(lǐng)域。

PBP因具有良好的光學(xué)特性,其純度一般采用最大可見吸收峰波長處的吸光值與280 nm處的吸光值之比(Aλmax/A280)來表示。為了獲取高純度、高活性的PBP,國內(nèi)外研究者們集中于破壁方法和分離純化技術(shù)做了大量的工作。而PBP產(chǎn)品多是來自于純天然海洋生物提取,工業(yè)生產(chǎn)時常遇到來源于產(chǎn)品得率、產(chǎn)品純度和生產(chǎn)成本的挑戰(zhàn),因此市場上的PBP產(chǎn)品通常價格高昂,這就限制了其加工生產(chǎn)和推廣利用。為了達到高純度、低成本的商品化生產(chǎn)要求,PBP的提取與分離純化主要集中于合理搭配多種技術(shù)、縮減操作流程以及規(guī)?；a(chǎn)。本文主要對PBP的分離純化和應(yīng)用研究予以概述,以期為促進海藻的開發(fā)和精深加工提供重要參考。

1 藻膽蛋白的提取

目前,國內(nèi)外提取PC的原料多為螺旋藻,而PE的提取原料多為龍須菜和紫菜。作為一種優(yōu)質(zhì)的胞內(nèi)蛋白,提取PBP的首要步驟是破碎藻體組織細胞壁。隨著生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)的迅猛發(fā)展,新型破壁方法如液氮研磨法、酶法、超聲輔助提取法、微波輔助提取法和多針-板電暈放電技術(shù)提取法等被應(yīng)用到PBP的提取過程中,與傳統(tǒng)破壁方法相比,具有純度高、成本低、穩(wěn)定性和延展性好等優(yōu)勢。

1.1 傳統(tǒng)提取方法

傳統(tǒng)提取方法如水溶液提取法、組織破碎法和反復(fù)凍融法,存在著產(chǎn)品耗時長、易變性、效率低和能耗高等缺點,不利于PBP的推廣和使用。水溶液提取法耗時長、效率低,不適合規(guī)模化生產(chǎn),而且溶液雜質(zhì)的殘留可能會影響后期的分離純化。趙麗等[5]采用水溶液提取法破碎紅藻藻體組織細胞壁提取R-PE,提取時長120 h,純度才達到0.38。組織破碎法操作簡單、省時,但機械破碎時間過長易致使蛋白質(zhì)變性,需做好降溫措施。鄭江等[6]采用組織破碎法破碎紅毛藻組織細胞,10 min后測得上清液中的PE純度為0.30。反復(fù)凍融法是通過-20 ℃下冷凍,5 ℃下融解后引起冰粒的形成和鹽濃度的增加破碎藻體細胞,促進蛋白的溶出以實現(xiàn)PBP的提取富集。反復(fù)凍融法雖操作簡單,但其耗時長,能耗高,應(yīng)用成本較高,只適合實驗室小規(guī)模生產(chǎn)。鄭蔚然[7]等采用反復(fù)凍融法提取R-PE,凍融6次,每次凍融3 h,R-PE的純度為0.42。

1.2 新型提取方法

1.2.1 液氮研磨法 液氮的溫度為-196 ℃,它不僅能使藻體組織的硬度、脆性增加,易于研磨,還能保護組織成分不被破壞和降解。通常,先用液氮處理藻體使組織細胞被完全凍結(jié),再將組織研磨成粉,置于緩沖溶液中解凍,最后高速離心濃縮粗提液[8]。Soni等[8]采用液氮冷凍藻體,研磨至粉末狀,再置于Tris-HCl緩沖液中解凍,提取的C-PC純度達0.42。與傳統(tǒng)破壁方法相比,液氮研磨法不僅能夠有效維持蛋白質(zhì)的活性,還具有操作簡單、成本低、重復(fù)性和延展性好的優(yōu)勢[9],可用于規(guī)?；扑樵弩w組織細胞。丙瀟瀟等[10]向瓷研缽中的紅藻壇紫菜粉加入液氮,反復(fù)研磨15 min,并溶于0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液中,離心后測得粗提液中的R-PE的純度為0.38。

1.2.2 酶輔助提取法 海藻細胞壁的主要成分是具有多糖類結(jié)構(gòu)的纖維素,可利用纖維素酶或果膠酶水解海藻細胞壁,減少了細胞壁和細胞間質(zhì)的傳質(zhì)阻力,有利于PBP高效的流出。趙麗等[5]用纖維素酶提取的R-PE,處理時長15 h,純度可達0.37。與傳統(tǒng)的堿提法相比,酶法反應(yīng)條件溫和,而且不易引入雜質(zhì),且能更好的維持蛋白質(zhì)的構(gòu)型、構(gòu)象和光學(xué)特性。施瑛等[11]比較了纖維素酶、果膠酶對紫菜PE的提取效果,研究發(fā)現(xiàn)纖維素酶和果膠酶的最佳酶配比為7∶3的復(fù)合酶液提取效果更好,得率可達2.26%,純度可達1.66。復(fù)合酶比單一酶在藻體組織細胞壁降解效果上更有優(yōu)勢,為PBP的規(guī)模化生產(chǎn)提供了新思路。

1.2.3 超聲波輔助提取法 該法是利用超聲波產(chǎn)生的空穴、熱和機械效應(yīng)破碎藻體組織細胞壁,促使細胞內(nèi)的PBP充分溶解出來。超聲波輔助提取法一般不單獨使用,僅作為細胞破壁的輔助手段,通常與水溶液提取法聯(lián)合使用。丙瀟瀟等[10]采用超聲波法破碎法提取紅藻中的R-PE,處理時長20 min,其純度可達0.51。與傳統(tǒng)方法相比,超聲波輔助提取法引入的雜質(zhì)少,耗時短,效率高,但超聲過程中會產(chǎn)生較多熱量,因此需要及時降溫,以免藻膽蛋白變性。Benavides等[12]采用超聲輔助提取紫球藻中的B-PE,研究發(fā)現(xiàn)其提取率是水提法的5倍。為了獲得理想的溶解促進和傳質(zhì)強化的效果,少數(shù)研究者采用交替雙頻逆流超聲技術(shù)提取蛋白質(zhì)。交替雙頻逆流超聲技術(shù)綜合了交替雙頻超聲技術(shù)與逆流提取技術(shù)的優(yōu)勢,既有交替雙頻超聲模式的促溶效果好、節(jié)能環(huán)保的優(yōu)點,又有逆流超聲技術(shù)提取效率高、能量均一的好處。曲文娟等[13]采用交替雙頻逆流超聲輔助提取條斑紫菜蛋白質(zhì),獲得的蛋白得率為24.35%,明顯高于傳統(tǒng)提取方法的蛋白得率7.19%。交替雙頻逆流超聲輔助提取方法較水溶液提取法在生產(chǎn)成本上具有顯著的技術(shù)優(yōu)勢和推廣價值。

1.2.4 微波輔助提取法 微波輔助提取(microwave-assisted extraction,MAE)是一種新型的蛋白質(zhì)提取技術(shù),比常規(guī)提取方法在純度和提取時間上具有顯著的技術(shù)優(yōu)勢[14]。為了防止處理時間過長或溫度過高導(dǎo)致蛋白質(zhì)失活,需要控制好處理暴露持續(xù)時間和處理溫度。Juin[15]首次采用微波輔助提取紫球藻中的PE,研究發(fā)現(xiàn)40 ℃時PE具有熱穩(wěn)定性,并于微波照射10 s后獲得PE的純度最高可達2.2?？紤]到產(chǎn)品純度、延展性和生產(chǎn)成本,微波輔助提取法是一種非常高效的提取方法。

1.2.5 多針-板電暈放電提取法 多針-板電暈放電提取法是一種新型的藻體組織細胞壁破壁提取方法,通過多余的負離子與正離子中和放出的巨大的能量使得藻體細胞壁產(chǎn)生0.4～40 μm大小不等的空洞,從而使藻膽蛋白從空洞溶出,并且等離子體溫度較低,不會導(dǎo)致熱量過高引起蛋白質(zhì)變性。與常規(guī)提取方法相比,具有操作簡單、效率高、耗時短、成本低、環(huán)保無污染的技術(shù)優(yōu)勢,多針-板電暈放電提取法是一種非常高效的提取方法。趙麗等[5]采用多針-板電暈放電提取紅藻中的R-PE,并通過與溶脹法、反復(fù)凍融法和CaCl2破碎法相比較,研究發(fā)現(xiàn)僅用3 min就能夠達到最好的破碎效果,獲得的R-PE純度可達0.47,而且整個過程不需要添加任何化學(xué)試劑,不需要提取預(yù)冷,可在室溫下處理。以PE為例,根據(jù)以上文獻總結(jié)不同提取方法的優(yōu)缺點,見表1。

表1 PE的不同提取方法的優(yōu)缺點Table 1 Advantages and disadvantages of different extraction methods of phycoerythrin

1.3 聯(lián)合法

新型提取方法還可與傳統(tǒng)提取方法組合使用,優(yōu)勢互補,進而實現(xiàn)高提取率粗提液的規(guī)?；a(chǎn)。目前,常見的組合方式有酶法與水溶液提取法、超聲波輔助提取法與反復(fù)凍融法等。段杉等[16]研究發(fā)現(xiàn)纖維素酶結(jié)合水溶液提取法比水溶液提取法在蛋白質(zhì)提取率上具有更大的優(yōu)勢。白露等[17]采用超聲波輔助提取法與反復(fù)凍融法結(jié)合提取壇紫菜蛋白質(zhì),表明組合法比單一法在提取得率和含量上效果更優(yōu)。

2 藻膽蛋白的分離純化

粗提液中PBP純度低、雜質(zhì)多,需要分離和純化以除去雜蛋白、多糖和其他成分,從而提高PBP純度。國際上PBP產(chǎn)品的純度可劃分為四種級別:食品級(Aλmax/A280>0.7)、藥品級(Aλmax/A280>3.0)、反應(yīng)級(Aλmax/A280>3.9)和試劑級(Aλmax/A280>4.0)。蛋白質(zhì)純化的關(guān)鍵是根據(jù)實驗?zāi)康倪x擇合適的純化技術(shù),并可多種純化技術(shù)組合使用,以縮減操作流程、提高純度和降低成本。新型分離純化方法有利凡諾沉淀法、殼聚糖吸附沉淀法、活性碳吸附沉淀法和雙水相萃取法等。

2.1 傳統(tǒng)的分離純化方法

隨著人們對PBP的研究逐漸深入以及各種分離純化技術(shù)的不斷出現(xiàn),對于其分離提純的方法也越來越多。PBP的傳統(tǒng)分離純化方法主要有凝膠層析法、離子交換層析法、羥基磷灰石柱層析法、等電點沉淀法、鹽析法和超濾法。凝膠層析是最簡單和最溫和的層析技術(shù),可用于藻膽蛋白的脫鹽、分離提純和濃縮,但其生產(chǎn)規(guī)模小,成本較高。Reisf等[18]利用Sephacryl S-100 HR凝膠純化PE,使其純度從0.8提高到3.5。而離子交換層析是最常用的層析方法,具有純化效果好,分析速度快等優(yōu)點,但其離子交換層析介質(zhì)成本較高,這就限制了其工業(yè)推廣使用。馮亞非等[19]采用一步羥基磷灰石柱層析法,利用磷酸緩沖液梯度洗脫,后經(jīng)冷凍干燥,得到藥品級標(biāo)準(zhǔn)的PE。等電點沉淀法應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)時,不僅易于擴展,也不需要復(fù)雜的操作步驟。目前,常用的等電點沉淀介質(zhì)是冰醋酸,Zhu等[20]采用冰醋酸作為等電點沉淀介質(zhì)沉淀PBP,冰醋酸溶液易揮發(fā)分離,簡化了生產(chǎn)工藝。硫酸銨沉淀法是最常用的蛋白質(zhì)沉淀方法,操作簡便,但其最大缺點是耗時長、蛋白質(zhì)易變性。Sorensen等[21]采用一步、二步硫酸銨沉淀提取C-PC,C-PC的純度提高到0.7和1.1。超濾是一種膜分離技術(shù),不僅能凈化粗提液,濃縮PBP,還可維持其結(jié)構(gòu)特性和光學(xué)特性,具有耗時短、產(chǎn)量高和純度高的優(yōu)點。

2.2 新型的分離純化方法

2.2.1 利凡諾沉淀法 利凡諾沉淀法是一種用于蛋白質(zhì)的分離純化的新型簡化方法,通過與蛋白質(zhì)形成復(fù)合物使得蛋白質(zhì)與其他粗提物分離開來。利凡諾試劑可用于沉淀和消除藻類多糖等雜質(zhì),還可使用硫酸銨沉淀使目標(biāo)蛋白與雜蛋白差異分離,可獲得較高純度的目標(biāo)蛋白[22]。與傳統(tǒng)層析法相比,該法避免了透析步驟,簡化了分離純化步驟,具有簡便、成本低和可擴展性等優(yōu)點。但試劑的介入帶入了雜質(zhì),可通過進一步的凝膠過濾結(jié)合除去雜質(zhì)。Minkova等[23]采用利凡諾試劑對細胞提取液四步沉淀處理,上清液中C-PC純度增加至3.9。這種技術(shù)為PBP的分離純化提供了新思路,但該技術(shù)仍需發(fā)展成熟才能投入到工業(yè)化生產(chǎn)中去。

2.2.2 殼聚糖和活性炭吸附沉淀法 殼聚糖對帶負電荷的蛋白質(zhì)具有吸附沉淀的作用,因而可通過調(diào)節(jié)pH使得雜蛋白被吸附沉淀,從而實現(xiàn)目的蛋白的分離純化。殼聚糖吸附沉淀法不僅能避免繁雜的層析純化步驟,還具有效率高、成本低、產(chǎn)量高和延展性好的優(yōu)勢[3]。而活性炭是一種低成本且接觸面積大的疏水性吸附劑,對疏水性蛋白質(zhì)具有吸附沉淀的作用,通過吸附雜蛋白并使之沉淀實現(xiàn)藻膽蛋白的分離純化。廖曉霞等[24]研究發(fā)現(xiàn)殼聚糖和活性炭結(jié)合使用可使PC純度由0.93提高至2.78,與傳統(tǒng)的鹽析法相比,殼聚糖和活性炭結(jié)合使用具有耗時短、得率高、條件溫和、縮減操作流程等優(yōu)勢。Gantar等[25]采用活性炭和殼聚糖純化C-PC,研究發(fā)現(xiàn)其純度由2.0增加到3.6。

2.2.3 雙水相萃取法 與傳統(tǒng)層析法相比較,雙水相萃取法具有低溶劑、傳質(zhì)和分相效率高、安全環(huán)保等優(yōu)勢[26]。雙水相萃取法通常作為初步使用,同時也需要與超濾、層析技術(shù)相結(jié)合使用,提升純度并除去雙水相萃取中的聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG)和小分子雜質(zhì)。但目前PEG的去除仍有難度,PEG的分子量越大,空間阻力就越大,雙水相體系粘度增加直接加大了分相的難度。Sorensen等[21]采用雙水相萃取法純化提取C-PC,并采用超濾法進一步純化,研究發(fā)現(xiàn)C-PC的產(chǎn)量高達42%,純度高達4.5。雙水相萃取法不僅可單次使用,還可多次雙水相萃取以制備高純度的藻膽蛋白。Patil等[27]利用雙水相萃取法分離純化從螺旋藻中提取的C-PC,在單次萃取中C-PC的純度分別為3.23,多次萃取后C-PC的純度提高到4.02。目前,聚乙二醇(PEG)/葡聚糖/水是比較常用的雙水相成分,但由于聚合物的價格昂貴,難以應(yīng)用到PBP規(guī)模化生產(chǎn)中去。因此,有待研究開發(fā)新型的相成分以促進萃取法在藻膽蛋白工業(yè)化生產(chǎn)中的應(yīng)用。

3 藻膽蛋白的應(yīng)用

3.1 天然色素

由于人工合成色素的毒性作用,人們對天然色素的需求越來越大[28],因此PBP作為天然、安全的天然色素添加劑備受食品加工業(yè)青睞[29],但其因容易受pH、溫度、光照、礦質(zhì)元素[30]等因素的影響而在應(yīng)用上有所限制。蔣保季等[31]對天然食用色素PBP進行了大、小鼠經(jīng)口LD50,骨髓微核實驗,睪丸精母細胞染色體畸變分析,Ames實驗以及離乳大鼠30 d喂養(yǎng)測定分析,發(fā)現(xiàn)PBP對實驗動物無明顯毒性作用,具有廣泛的發(fā)展前景。作為一種天然色素,PBP既可取代人工合成的色素[32],還可人為調(diào)配PE、PC和APC的比例達到人工染料所不能達到的效果,當(dāng)其純度大于0.7(食品級)時,可應(yīng)用于食品、化妝品和染料等工業(yè)領(lǐng)域。在歐美、日本等國,PBP廣泛用作食品和化妝品的天然色素,并被制成康復(fù)藥品和保健食品。Santos等[33]利用螺旋藻提取PC,并作為食品中的天然色素應(yīng)用于口香糖、乳制品產(chǎn)品和果凍中。

3.2 保健食品和醫(yī)藥

現(xiàn)代研究表明,PBP有免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤等多種生物學(xué)功能[34],能提高人體免疫力、促進血紅細胞生成、抑制癌細胞,從而在醫(yī)藥等行業(yè)領(lǐng)域有著非常廣闊的應(yīng)用前景,當(dāng)其純度大于3.0(藥品級)可應(yīng)用于保健食品和醫(yī)藥領(lǐng)域。葉翠芳等[35]研究發(fā)現(xiàn)PBP、多糖、類菌胞素氨基酸等紫菜提取物對紫外輻射損傷有修復(fù)作用;PR等[36]研究發(fā)現(xiàn)C-PC對腦缺血損傷有明顯的保護作用,從而改善運動功能;Soni等[37]研究發(fā)現(xiàn)C-PE能夠劑量反應(yīng)性地降低CCl4誘發(fā)的毒性;Soni等[38]又發(fā)現(xiàn)了C-PE對糖尿病并發(fā)癥具有修護作用。此外,PBP還具有抗氧化、抗輻射和抗炎癥等功能,能有效的修復(fù)氧化損傷和輻射損傷,因此在保健食品行業(yè)具有良好的應(yīng)用前景。Gupta等[39]研究發(fā)現(xiàn)C-PC能夠有效地修復(fù)TBT誘導(dǎo)的氧化損傷;Patel[40]等發(fā)現(xiàn)PC具有良好的羥基和過氧基清除能力;Benedetti等[41]研究發(fā)現(xiàn)微藻中的PC具有抗炎癥和抗氧化的功能。

3.3 熒光探針

PBP是一類新型的熒光探針,與傳統(tǒng)化學(xué)熒光探針相比,具有靈敏度高、保存期長、無毒副作用、易交聯(lián)、選擇性和穩(wěn)定性好等優(yōu)勢,當(dāng)其純度大于4.0(試劑級)時可應(yīng)用于臨床醫(yī)學(xué)、免疫學(xué)和細胞學(xué)等應(yīng)用領(lǐng)域。PBP中可用于熒光探針的有PE、PC和PEC。PE熒光特性穩(wěn)定且量子產(chǎn)率高,是最為常用的熒光探針,而PEC因在藻體的含量極低,研究較少。

3.4 光敏劑

光敏劑于特定波長的激光照射下形成激發(fā)態(tài),而激發(fā)態(tài)的光敏劑通過能量傳遞形成單態(tài)氧,然后通過相鄰的生物大分子的氧化反應(yīng)殺死腫瘤細胞,從而達到治療腫瘤的目的。傳統(tǒng)的光敏劑血卟啉在紫外波段吸收較強,而在太陽光波段吸收也容易引起較強的光敏反應(yīng),這就要求患者光敏治療后需要避光數(shù)周,盡可能降低毒性反應(yīng)[42]。PBP克服了傳統(tǒng)光敏劑血卟啉易引發(fā)強烈的皮膚光敏毒性的弱點,在其峰吸收波長的激光輻照下引發(fā)很強的光敏反應(yīng),而在太陽光的照射下則吸收較弱,相應(yīng)的光敏反應(yīng)也較弱,對皮膚光敏毒性小,當(dāng)其純度大于3.0(藥品級)時,可應(yīng)用于到醫(yī)學(xué)治療領(lǐng)域,為光敏劑治療腫瘤開啟了新的思路。目前,已有諸多學(xué)者正在做PE、PC和APC作為光敏劑的研究。蔡春爾等[43]用大于120 μg·mL-1的PE介導(dǎo)的激光作用下處理人肝癌BEL-7402細胞,研究發(fā)現(xiàn)細胞存活率不到30%。李冠武等[42]研究發(fā)現(xiàn)Photofrin Ⅱ、PE、PC和APC在太陽光照射下的細胞存活率分別為39%、62%、86%、91%,PE、PC和APC的光敏毒性依次降低,并且均較傳統(tǒng)血卟啉光敏劑的日光光敏毒性弱,可用于開發(fā)成新型光敏藥物。

4 展望

PBP的生物活性和生理功能使其在工業(yè)、輕工業(yè)和醫(yī)療行業(yè)表現(xiàn)出廣泛的應(yīng)用前景。隨著生物技術(shù)的持續(xù)發(fā)展,PBP的提取與純化的新型工藝已成為了研究的熱點和焦點。國內(nèi)外學(xué)者基于高收益、高效以及安全環(huán)保的規(guī)?；a(chǎn)做了大量的研究工作,新型方法與傳統(tǒng)方法相比較具有低成本、效率高、擴展性好的優(yōu)勢,但其通常也具有產(chǎn)品易變性等缺點。如何將新型方法與傳統(tǒng)方法相聯(lián)合,取其利,避其弊,研究出最適合商品化生產(chǎn)的高純度PBP的提取純化工藝是當(dāng)下要解決的關(guān)鍵技術(shù)問題。

迄今,諸多學(xué)者針對于PBP的生物活性做了大量工作,并通過體外實驗證明其具有抗氧化、抗腫瘤、提高免疫力等多種生物功能。隨著技術(shù)的飛速發(fā)展和人們保健意識的提升,PBP的制備工藝會更加成熟,應(yīng)用前景將更加廣泛,將促進其在工業(yè)、輕工業(yè)和醫(yī)療行業(yè)領(lǐng)域的開發(fā)和利用。

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