菱莖多酚的提取工藝及其抗氧化、抑菌活性研究

申 凱,張 輝,嚴(yán)碧云,王清章,王洪斌,陳 佳

(武昌工學(xué)院食品與環(huán)境工程學(xué)院,湖北武漢 430065)

多酚是高等植物重要的次級代謝產(chǎn)物,廣泛分布于植物的各組織部位[1]。多酚因具有多種生物活性如抗氧化、抑菌、抗腫瘤、抗糖尿病和抗炎活性,而受到廣泛關(guān)注[2-6]。近年來,從食品加工副產(chǎn)物或廢棄物中獲取天然多酚并將其開發(fā)成新的藥物資源,引發(fā)了人們的強(qiáng)烈興趣[7-10]。多酚常見的提取方法主要有亞臨界水萃取[11]、超臨界流體萃取[12]、加壓流體萃取或加速溶劑萃取[13-14],而超聲波輔助提取技術(shù)因其設(shè)備要求簡單、成本低、效率高、對多酚的破壞程度低,而被廣泛地運(yùn)用于各種植物材料(葉、莖、果實(shí)和種子)的多酚提取[15]。

菱(TrapabispinosaRoxb.),一年生水生草本植物,其果實(shí)菱角兼具營養(yǎng)與藥用保健價(jià)值,受到人們的喜愛,是我國著名的水生蔬菜[16]。大量的菱殼和菱莖通常被作為廢棄物處理,僅有少量的用作肥料或燃料。研究表明,菱殼多酚表現(xiàn)出顯著的抑菌、降血糖、抗炎、抗氧化和抗癌活性[17]。最新研究表明,菱莖多糖也具良好的抗氧化活性[18]。然而,關(guān)于菱莖多酚的提取和生物活性方面的研究尚未見報(bào)道。

本研究以菱莖為實(shí)驗(yàn)材料,以超聲波為輔助提取手段,采用正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化多酚的提取工藝,并測定菱莖多酚體外抗氧化和抑菌能力,以期為菱莖多酚的有效開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

菱莖 采自湖北洪湖,整理洗凈,切成約5 cm長度,冷凍干燥后粉碎至60 目,置于-20 ℃下保存?zhèn)溆?供試微生物金黃色葡萄球菌、蠟樣芽胞桿菌、大腸桿菌、腐敗希瓦氏菌、青霉和釀酒酵母 中國典型培養(yǎng)物保藏中心;沒食子酸(Gallic acid)、維生素E(VE)、L-抗壞血酸(VC)、Folin-Ciocalteu試劑、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、2,2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽(ABTS)、2,4,6-三吡啶基三嗪(TPTZ) Sigma試劑有限公司;氨芐青霉素、兩性霉素B標(biāo)準(zhǔn)品 美國Amresco公司;乙醇、醋酸鈉、過硫酸鉀、三氯化鐵、乙酸 均為分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;營養(yǎng)肉湯、馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)基 北京陸橋技術(shù)有限公司。

LGJ-30F冷凍干燥機(jī) 北京松源華興科技發(fā)展有限公司;SPX-250B型生化培養(yǎng)箱 天津市泰斯特儀器有限公司;SB-5200DNT超聲波清洗儀 寧波新芝生物科技股份有限公司;PHS-25型pH計(jì) 上海虹益儀器儀表有限公司;UV-1800紫外-可見分光光度計(jì) 日本島津有限公司;ME104電子天平 梅特勒-托利多儀器上海有限公司;SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵 鄭州長城科工貿(mào)有限公司;RE52型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 單因素實(shí)驗(yàn) 多酚提取工藝流程:準(zhǔn)確稱取菱莖粉末1.0 g于100 mL三角瓶中,加入已調(diào)節(jié)pH的乙醇水溶液,置于一定溫度超聲波清洗儀(500 W,40 kHz,由預(yù)實(shí)驗(yàn)得)中水浴超聲提取,提取結(jié)束后迅速抽濾,濾液用相應(yīng)的乙醇溶液定容至50 mL,吸取1.0 mL提取濾液,稀釋適宜倍數(shù)后用于多酚含量的測定。按照該工藝流程依次考察乙醇濃度(v/v)、pH、提取溫度、提取時(shí)間、料液比(g/mL)對菱莖多酚提取得率的影響。單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)如表1所示:

表1 菱莖多酚單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)Table 1 Single-factor experiment for extraction of polyphenols from stems of Trapa bispinosa Roxb

1.2.2 正交實(shí)驗(yàn) 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果,以多酚提取得率為評價(jià)指標(biāo),按表2所示正交表 L16(45)設(shè)計(jì)正交實(shí)驗(yàn)。

表2 菱莖多酚提取正交實(shí)驗(yàn)因素水平表Table 2 Factors and levelsTable of orthogonal array design for extraction of polyphenols from stems of Trapa bispinosa Roxb

1.2.3 多酚含量的測定 多酚含量測定采用Folin-Ciocalteu法[19]。準(zhǔn)確吸取50 μL多酚提取液,加入450 μL蒸餾水和2.5 mL濃度為0.2 mol/L的Folin-Ciocalteu試劑,搖勻后反應(yīng)5 min,加入2 mL飽和碳酸鈉溶液(75 g/L),搖勻后在30 ℃下反應(yīng)1.5 h,在765 nm處測定吸光值。以80%甲醇溶液配置濃度為0～500 μg/mL的沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液,按同樣方法建立多酚含量測定的標(biāo)準(zhǔn)曲線(y=0.001x+0.0217,R2=0.9992),根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算提取液中多酚的含量,多酚提取得率以每克菱莖干粉末中所含相當(dāng)于沒食子酸量的毫克數(shù)表示(mg GAE/g DW)。

1.2.4 菱莖多酚的抗氧化活性測定

1.2.4.1 對DPPH自由基清除力的測定 參考文獻(xiàn)方法[20]:準(zhǔn)確吸取0.1 mL待測液,加入3.0 mL的 0.004%DPPH甲醇溶液,搖勻后避光反應(yīng)30 min,在517 nm處測定吸光值?？瞻讓φ諡榧状?陽性對照為VC和VE溶液。樣品液對DPPH自由基的清除率按公式(1)計(jì)算,同時(shí)計(jì)算樣品液對DPPH自由基的半清除濃度(IC50)。

自由基清除率(%)=(1-A實(shí)驗(yàn)組/A空白對照)×100

式(1)

1.2.4.2 對ABTS自由基清除力的測定 參考文獻(xiàn)方法[21]:分別將0.0384 g的ABTS與0.0134 g的過硫酸鉀溶于10 mL蒸餾水,將兩者按體積比1∶1混合均勻,避光反應(yīng)16 h得到ABTS自由基母液,使用之前以80%乙醇稀釋至在波長734 nm處吸光值為0.700±0.050,得到ABTS自由基工作液;準(zhǔn)確吸取0.1 mL待測樣品液,加入3.9 mL ABTS自由基工作液,搖勻后靜置反應(yīng)6 min,在734 nm處測定吸光值?？瞻讓φ諡?0%乙醇水溶液,陽性對照為VC和Ve溶液。按(1)式計(jì)算樣品液對ABTS自由基的清除率,并計(jì)算半清除濃度(IC50)。

1.2.4.3 對Fe3+還原力的測定 還原力的測定采用FRAP法[22]:將300 mmol/L、pH3.6的NaAc-HAc緩沖液,10 mmol/L的TPTZ溶液和20 mmol/L的FeCl3溶液按體積比10∶1∶1混勻得到FRAP試劑;準(zhǔn)確吸取0.1 mL待測樣品液,加入3.0 mL現(xiàn)配的FRAP試劑,混勻后在25 ℃水浴下反應(yīng)5 min,在 593 nm處測定吸光值,空白樣為蒸餾水,陽性對照為VC和Ve溶液。使593 nm處吸光值達(dá)到0.5時(shí)的樣品液濃度為菱莖多酚還原力的IC50值[23]。

1.2.5 菱莖多酚的抑菌活性測定 金黃色葡萄球菌、蠟樣芽孢桿菌、大腸桿菌、腐敗希瓦氏菌于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中37 ℃下培養(yǎng)24 h,使用前在相同培養(yǎng)條件下在試管斜面上活化培養(yǎng)24 h,青霉、釀酒酵母于PDA培養(yǎng)基中28 ℃下培養(yǎng)48 h,使用前在相同培養(yǎng)條件下在試管斜面活上化培養(yǎng)48 h,抑菌實(shí)驗(yàn)前調(diào)節(jié)菌懸液濃度為106～107CFU/mL。

抑菌實(shí)驗(yàn)采用濾紙片擴(kuò)散法[24-25]。用DMSO 溶解樣品,采用二倍稀釋法配制系列質(zhì)量濃度的菱莖多酚樣品液。準(zhǔn)確吸取100 μL菌懸液均勻涂布于平皿培養(yǎng)基上,在培養(yǎng)基上等間距平鋪4片已滅菌直徑為6 mm的濾紙片,其中3片滴加10 μL經(jīng)0.22 μm無菌濾頭處理的樣品液,另1片滴加等量的DMSO或陽性對照液;陽性對照為10.0 μg/mL的氨芐青霉素和1.0 mg/mL的兩性霉素B。細(xì)菌于37 ℃下培養(yǎng)24 h,真菌于28 ℃下培養(yǎng)48 h,采用十字交叉法量取抑菌圈直徑(包括濾紙片直徑)。觀察菌落生長情況,存在抑菌圈的最低樣品液濃度即為最低抑菌濃度MIC(mg/mL)。

1.3 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

采用Excel進(jìn)行初步數(shù)據(jù)處理,采用Origin 8.0軟件進(jìn)行顯著性分析和圖表制作。實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 乙醇濃度對菱莖多酚提取的影響 多酚物質(zhì)是一類極性較大的化合物,在乙醇中加入一定的水有利于多酚的溶出。如圖1所示,隨著乙醇濃度的增大,多酚提取得率呈現(xiàn)先增大后減小趨勢;當(dāng)乙醇濃度由20%增加到50%,多酚提取得率顯著(p<0.05)增加,在乙醇濃度為50%時(shí),多酚提取得率達(dá)到最大值37.17 mg GAE/g DW;隨著乙醇濃度的繼續(xù)增加,多酚提取得率顯著(p<0.05)下降,當(dāng)乙醇濃度增加到80%,多酚提取得率降低至26.97 mg GAE/g DW。這是由于乙醇濃度達(dá)到50%,繼續(xù)增加乙醇濃度,菱莖中其他醇溶性雜質(zhì)的浸出效率也隨之增加,雜質(zhì)與多酚物質(zhì)的競爭加強(qiáng),從而使多酚物質(zhì)的提取得率下降。故后續(xù)實(shí)驗(yàn)的乙醇濃度選定為50%。

圖1 乙醇濃度對菱莖多酚提取得率的影響Fig.1 Effects of ethanol concentration on extraction yield of polyphenols from stems of Trapa bispinosa Roxb.注:不同小寫英文字母表示提取得率 在0.05水平具有顯著差異(p<0.05);圖2～圖5同。

2.1.2 pH對菱莖多酚提取的影響 植物組織內(nèi)多酚物質(zhì)一部分以游離形式存在于液泡中,一部分與蛋白質(zhì)及多糖通過氫鍵或疏水鍵結(jié)合于細(xì)胞壁中,而酸性條件有利于結(jié)合酚的釋放[26]。如圖2所示,隨著pH的增加,多酚提取得率呈現(xiàn)先增加后下降的趨勢,當(dāng)pH為2時(shí)，提取得率達(dá)到最大值35.82 mg GAE/g DW,顯著(p<0.05)高于pH為1時(shí)的提取得率;隨著pH的繼續(xù)增加,多酚提取得率明顯(p<0.05)下降,當(dāng)pH為6時(shí)，多酚提取得率下降至最小值25.77 mg GAE/g DW,表明pH為2最有利于菱莖多酚的溶出。因此,后續(xù)提取液pH選定為2。

圖2 提取劑pH對菱莖多酚提取得率的影響Fig.2 Effects of pH value on extraction yield of polyphenols from stems of Trapa bispinosa Roxb.

2.1.3 提取溫度對菱莖多酚提取的影響 由圖3可知,隨著溫度的升高,菱莖多酚提取得率幾乎呈線性增加,當(dāng)提取溫度達(dá)到60 ℃時(shí)，提取得率達(dá)到最大值47.07 mg GAE/g DW,說明菱莖多酚具有較好的耐高溫性,當(dāng)提取溫度升至70 ℃,多酚提取得率顯著(p<0.05)下降,但仍顯著(p<0.05)高于20 ℃時(shí)的提取得率34.62 mg GAE/g DW。原因在于升高溫度雖然可促進(jìn)分子的熱運(yùn)動(dòng),增大菱莖多酚的溶出率,但提取溫度過高也會(huì)導(dǎo)致菱莖多酚的氧化與降解[27]。因此,后續(xù)實(shí)驗(yàn)的提取溫度選定為60 ℃。

圖3 提取溫度對菱莖多酚提取得率的影響Fig.3 Effects of temperature on extraction yield of polyphenols from stems of Trapa bispinosa Roxb.

2.1.4 提取時(shí)間對菱莖多酚提取的影響 如圖4所示,隨提取時(shí)間的增加,多酚提取得率呈先增加后減小的變化趨勢,當(dāng)提取時(shí)間為25 min時(shí)，提取得率達(dá)到最大值46.02 mg GAE/g DW;超過25 min,多酚提取得率顯著(p<0.05)下降,提取時(shí)間延長至55 min時(shí)，提取得率降至最低值27.42 mg GAE/g DW。分析認(rèn)為,提取時(shí)間較短時(shí),隨著時(shí)間的延長,多酚的溶出率增加,使得多酚提取得率增大,但時(shí)間過長,已溶出的多酚物質(zhì)易因長時(shí)間暴露在空氣中而發(fā)生氧化與降解,且長時(shí)間的超聲處理本身也可能會(huì)導(dǎo)致多酚化學(xué)結(jié)構(gòu)一定程度的破壞[28-29]。因此,后續(xù)實(shí)驗(yàn)中菱莖多酚超聲提取時(shí)間選定為25 min。

圖4 提取時(shí)間對菱莖多酚提取得率的影響Fig.4 Effects of time on extraction yield of polyphenols from stems of Trapa bispinosa Roxb.

2.1.5 料液比對菱莖多酚提取的影響 由圖5可知,隨著料液比由1∶10增加到1∶35,多酚提取得率逐步增加,在料液比為1∶35時(shí)達(dá)到最大值46.92 mg GAE/g DW,當(dāng)料液比超過1∶35時(shí)，菱莖多酚的提取得率反而呈現(xiàn)下降趨勢。分析可能是由于液料比較小時(shí),提取劑與菱莖粉末顆粒沒有達(dá)到充分接觸,而液料比的增加會(huì)促進(jìn)乙醇溶液主體與菱莖顆粒內(nèi)部多酚液的濃度差,進(jìn)而促進(jìn)多酚提取得率的增大,但當(dāng)液料比過大時(shí),會(huì)導(dǎo)致菱莖顆粒內(nèi)部多糖等雜質(zhì)的競爭性溶出,造成菱莖多酚提取得率的降低[30]。因此,菱莖多酚提取的飽和料液比在1∶35左右。

圖5 料液比對菱莖多酚提取得率的影響Fig.5 Effects of solid-to-liquid ratio on extraction yield of polyphenols from stems of Trapa bispinosa Roxb.

2.2 正交實(shí)驗(yàn)

以乙醇濃度、pH、提取溫度、提取時(shí)間、料液比為考察因素,以多酚提取得率為指標(biāo),進(jìn)行5因素4水平正交實(shí)驗(yàn),優(yōu)化菱莖多酚的提取工藝,實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表3。

表3 菱莖多酚提取正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 3 Orthogonal array design with experimental results for extraction of polyphenols from stems of Trapa bispinosa Roxb.

由表3的極差分析可知,影響菱莖多酚提取的各因素主次順序?yàn)镃>B>E>A>D,即提取溫度>pH>料液比>乙醇濃度>提取時(shí)間。由k值分析可得出最佳因素組合為A4B1C4D2E3,即乙醇濃度60%、pH為1、提取溫度為70 ℃、提取時(shí)間為35 min、料液比為1∶35,該最佳因素組合恰好在正交表中,且顯著(p<0.05)高于任何一個(gè)因素組合。按正交所得最佳提取工藝條件,進(jìn)行5次重復(fù)提取實(shí)驗(yàn),得到菱莖多酚的平均提取得率為67.31 mg GAE/g DW,說明由正交實(shí)驗(yàn)得到的最佳提取工藝條件是可行的,菱莖多酚的提取得到了優(yōu)化。在最佳提取工藝條件下得到的菱莖多酚提取液經(jīng)冷凍干燥用于后續(xù)的抗氧化、抑菌實(shí)驗(yàn)。

2.3 菱莖多酚的抗氧化活性

2.3.1 對DPPH自由基的清除力 由圖6可知,隨菱莖多酚質(zhì)量濃度的增加,DPPH自由基的清除率不斷升高,在10～80 μg/mL濃度范圍,DPPH清除力幾乎與陽性對照的VE相當(dāng),在濃度為640 μg/mL時(shí)對DPPH的清除率高達(dá)90.56%,在測定條件下,清除一半DPPH自由基所需的濃度(IC50)為228.34 μg/mL(y=0.169x+11.41,R2=0.980)。雖然弱于陽性對照組,但仍表現(xiàn)出較強(qiáng)的DPPH清除能力,且多酚樣品濃度與DPPH清除率呈現(xiàn)明顯的量效關(guān)系。

圖6 菱莖多酚對DPPH自由基的清除力Fig.6 DPPH radical scavenging capacity of polyphenols from stems of Trapa bispinosa Roxb.

2.3.2 對ABTS自由基的清除力 菱莖多酚對ABTS自由基的清除能力結(jié)果見圖7。可知,隨菱莖多酚濃度的增加,對ABTS自由基的清除率也不斷升高,在濃度為640 μg/mL時(shí)對自由基的清除率高達(dá)94.63%。在測定條件下,其IC50值為220.57 μg/mL(y=0.187x+8.753,R2=0.996),表明菱莖多酚具有較強(qiáng)的ABTS自由基清除能力,且多酚質(zhì)量濃度與ABTS自由基清除力呈現(xiàn)明顯的量效關(guān)系。

圖7 菱莖多酚對ABTS自由基的清除能力Fig.7 ABTS radical scavenging capacity of polyphenols from stems of Trapa bispinosa Roxb.

2.3.3 FRAP還原力分析 FRAP反應(yīng)的是抗氧化劑對Fe3+的還原能力。菱莖多酚的還原能力結(jié)果見圖8,可知,隨著菱莖多酚質(zhì)量濃度的增加,其總還原力呈線性增強(qiáng),當(dāng)濃度為640 μg/mL時(shí),在593 nm處的吸光值高達(dá)1.99,在測定條件下使A593達(dá)到0.5時(shí)所需的濃度(IC50)為152.00 μg/mL(y=0.003x+0.044,R2=0.995),稍弱于陽性對照的VE(IC50為151.12 μg/mL),說明菱莖多酚具有良好的還原能力,且多酚樣品濃度與總還原能力呈現(xiàn)明顯的量效關(guān)系。

圖8 菱莖多酚對鐵離子的還原能力Fig.8 FRAP capacity of polyphenols from stems of Trapa bispinosa Roxb.

2.4 菱莖多酚的抑菌效果

菱莖多酚對6種典型腐敗微生物生長的抑制作用結(jié)果見表4和表5。由表4可知,菱莖多酚對大腸桿菌、腐敗希瓦氏菌、青霉菌、釀酒酵母菌的生長抑制作用顯著(p<0.05)。樣品質(zhì)量濃度為25 mg/mL時(shí),平均抑菌圈直徑分別為17.17、16.25、14.00、14.33 mm,與陽性對照相當(dāng);對金黃色葡萄球菌、蠟樣芽胞桿菌的生長具有較好的抑制作用,抑菌圈直徑分別為7.83、9.04 mm。對6種菌的抑菌圈直徑均隨著樣品濃度的降低而減小,說明多酚質(zhì)量濃度與抑菌效果呈現(xiàn)一定的劑量效應(yīng)關(guān)系。由表5可知,菱莖多酚對供試菌的最低抑菌濃度(MIC)大小關(guān)系依次為金黃色葡萄球菌>蠟樣芽胞桿菌>青霉菌>釀酒酵母菌>腐敗西瓦氏菌>大腸桿菌。

表4 菱莖多酚對供試菌的抑菌效果Table 4 Inhibitory effect of polyphenols from stems of Trapa bispinosa Roxb. on the tested microorganisms

表5 菱莖多酚的最低抑菌濃度(MIC)Table 5 Minimum inhibitory concentration(MIC)of the polyphenols from stems of Trapa bispinosa Roxb.

可得出,菱莖多酚對革蘭氏陰性菌、霉菌和酵母菌均有強(qiáng)抑制作用,而對革蘭氏陽性菌的抑制作用較溫和。

在菱殼抑菌活性研究中,Yu和Shen的結(jié)果認(rèn)為菱殼多酚提取物對革蘭氏陽性菌有較強(qiáng)抑制作用,對革蘭氏陰性菌具有一定的抑制作用,而對真菌的抑制作用不明顯[31]。分析可能是由于菱莖、菱殼中抑菌成分存在差異性或?qū)ξ⑸锏淖饔脵C(jī)制不同,可在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中作進(jìn)一步探究。另外,實(shí)驗(yàn)結(jié)果也說明菱莖多酚和菱殼多酚提取物存在一定的抑菌互補(bǔ)性,因此可將菱莖、菱殼混合使用,以得到更好的抑菌效果。

3 結(jié)論

采用超聲波輔助提取菱莖多酚,通過單因素和正交實(shí)驗(yàn),得到菱莖多酚的最佳提取工藝條件:乙醇濃度60%、pH1、提取溫度70 ℃、提取時(shí)間35 min、料液比1∶35。在此工藝條件下多酚提取得率達(dá)到67.31 mg GAE/g DW。菱莖多酚對DPPH、ABTS自由基的IC50值分別為228.34 μg/mL和220.57 μg/mL,FRAP還原力的IC50值為152.00 μg/mL;對金黃色葡萄球菌、蠟樣芽孢桿菌、大腸桿菌、腐敗希瓦氏菌、青霉和釀酒酵母的最小抑菌濃度(MIC)分別為6.25、3.13、0.20、0.39、1.56和0.78 mg/mL。菱莖是良好的天然植物多酚來源材料,菱莖多酚具有良好的抗氧化和抑菌活性。但菱莖多酚的分離純化、結(jié)構(gòu)鑒定、功能穩(wěn)定性、抑菌機(jī)制及其它生物活性還有待作進(jìn)一步探究。本文首次研究菱莖多酚的提取工藝、抗氧化和抑菌活性,為菱莖多酚開發(fā)為天然抗氧化劑和抑菌劑提供一定的理論依據(jù)和參考。

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