湖泊水體營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)對(duì)沉積物好氧氨氧化菌異質(zhì)性的影響

孫 旭，胡志新，楊柳燕

(1.南京大學(xué)環(huán)境學(xué)院，江蘇 南京 210023; 2.污染控制與資源化國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210023;3.環(huán)境保護(hù)部南京環(huán)境科學(xué)研究所，江蘇 南京 210042; 4.南京工程學(xué)院環(huán)境工程學(xué)院，江蘇 南京 211167)

與反硝化耦合的硝化作用在湖泊氮循環(huán)中起著重要作用。氨氧化過程是硝化過程的限速步驟，氨氧化細(xì)菌(ammonia-oxidizing bacteria，AOB)是氨氧化過程的驅(qū)動(dòng)者，但是隨著對(duì)氨單加氧酶α亞基基因作為分子生物標(biāo)記物研究的深入，發(fā)現(xiàn)在好氧氨氧化過程中還存在另一類原核微生物——氨氧化古菌(ammonia-oxidizing archaea, AOA)[1-2]。研究表明，在土壤、河口、海洋、淡水沉積物中均發(fā)現(xiàn)AOA的蹤跡，且數(shù)量遠(yuǎn)超過AOB。在寡營(yíng)養(yǎng)和極端環(huán)境中，AOA是好氧氨氧化過程的主要驅(qū)動(dòng)者[3-4]。

AOA和AOB在不同生境的分化除了自身進(jìn)化的差異外，環(huán)境因子如氨濃度、DO、pH等也是其分布的主要調(diào)控因素[5-7]，另外，湖泊水體的營(yíng)養(yǎng)狀況也是影響沉積物氨氧化微生物分布和功能的一個(gè)潛在因素。研究表明，隨著湖泊富營(yíng)養(yǎng)化程度的加重，沉積物中AOA和AOB的多樣性增加，且富營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)湖泊沉積物中AOB的豐度和多樣性都遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于貧營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)湖泊[8-11]，但是也有研究表明，不同湖區(qū)沉積物中氨氧化微生物的豐度和多樣性與湖泊營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)無關(guān)[12-13]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，不同生態(tài)類型湖泊沉積物中AOA和AOB群落組成并無顯著差異，而沉積物中有機(jī)質(zhì)含量是影響AOA和AOB異質(zhì)性分布的主要因子[14-15]，湖泊生態(tài)類型與富營(yíng)養(yǎng)化程度有時(shí)會(huì)存在不一致的現(xiàn)象，因此湖泊富營(yíng)養(yǎng)化狀態(tài)與湖泊沉積物好氧氨氧化菌組成的關(guān)系還存在爭(zhēng)議[12,16]。鑒于湖泊生態(tài)系統(tǒng)的復(fù)雜性以及營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)劃定的差異，有必要對(duì)不同營(yíng)養(yǎng)狀況下好氧氨氧化菌的異質(zhì)性進(jìn)行深入研究。

本研究以江蘇省7個(gè)湖泊為研究對(duì)象，利用分子生物學(xué)的方法，對(duì)不同營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)湖泊沉積物中氨氧化菌的群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，目的在于了解不同營(yíng)養(yǎng)狀況下湖泊沉積物氨氧化菌的群落特征，同時(shí)探索其潛在的調(diào)控因子，為富營(yíng)養(yǎng)化湖泊氮素控制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)概況

以江蘇省洪澤湖(HZ)、白馬湖(BM)、高郵湖(GY)、玄武湖(XW)、石臼湖(SJ)、固城湖(GC)和太湖(T)7個(gè)湖泊為研究對(duì)象，具體采樣點(diǎn)位置見圖1。于2012年4月，用采水器采集距水面0.5 m處的上覆水，低溫保存在1 L的聚乙烯瓶?jī)?nèi)，帶回實(shí)驗(yàn)室立即測(cè)定葉綠素a(Chl-a)及其他常規(guī)理化指標(biāo)。采用彼得森采集器采集湖泊沉積物樣品，取表層5 cm樣品混勻后放入無菌的聚乙烯自封袋，低溫保存運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，保存在-80℃低溫冰箱中備用。

圖1 湖泊采樣點(diǎn)位置

1.2 水質(zhì)常規(guī)理化指標(biāo)分析

1.3 沉積物AOA和AOB豐度及群落結(jié)構(gòu)分析

按照土壤DNA試劑盒(MoBio Laboratories, Carlsbad, USA)的操作說明提取沉積物基因組DNA，用50 μL無菌水洗脫后，用0.8%瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證及230、260、280 nm吸光值測(cè)定檢驗(yàn)提取效率和純度，用NanoDrop?2000分光光度計(jì)(NanoDrop Technologies Inc, Wilmington, DE) 測(cè)定待測(cè)DNA樣品的濃度。采用引物AF/AR和1F/2R分別擴(kuò)增AOA和AOB的amoA基因，其拷貝數(shù)采用熒光定量PCR方法(Bio-Rad CFX96 real-time System)進(jìn)行分析，使用一系列10倍稀釋的質(zhì)粒制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，AOA的amoA基因拷貝數(shù)從1.0×101μL-1到1.0 ×106μL-1，擴(kuò)增效率為91.8%(R2=1.00)；AOB的amoA基因拷貝數(shù)在1.0×102μL-1到1.0×107μL-1之間，擴(kuò)增效率為90.2% (R2=0.99)。Ct值(threshold cycle)和數(shù)據(jù)分析通過iCycler software (version 1.0.1384.0 CR)完成[19]。采用CEQ 8000 Genetic Analyzer (Beckman CEQ8000)遺傳分析儀分別用限制性內(nèi)切酶MspⅠ和Hpy8Ⅰ對(duì)AOB和AOA的amoA基因進(jìn)行限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(terminal restriction fragment length polymorphism，T-RFLP)分析[15]。

1.4 數(shù)據(jù)分析

湖泊營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)采用綜合營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)指數(shù)(trophic status index, ITSI)法進(jìn)行評(píng)價(jià)，評(píng)價(jià)指標(biāo)參數(shù)包括Chl-a、TN、TP、CODMn和透明度共5項(xiàng)[20]。

以T-RFLP圖譜中每一個(gè)限制性片段(T-RF)為一個(gè)可操作分類單元(operational taxonomic unit，OTU)，OTU豐度按照Saikaly的方法計(jì)算，即以相對(duì)峰高值(每個(gè)T-RF的峰高除以累計(jì)峰高值，舍去小于2%的值)作為OTU豐度，峰高值低于200熒光單位的峰不予考慮。根據(jù)圖譜中OTU的數(shù)目及其豐度用BIODAP程序進(jìn)行Shannon-Wiener多樣性指數(shù)計(jì)算。

采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)方差和相關(guān)性分析，采用Canoco 4.5軟件分析AOA和AOB的T-RFLP指紋圖譜，確定其群落結(jié)構(gòu)，所有的環(huán)境因子和每個(gè)T-RF的相對(duì)峰值都進(jìn)行l(wèi)g(x+1)轉(zhuǎn)化，分別構(gòu)成環(huán)境矩陣和物種矩陣，進(jìn)行典范對(duì)應(yīng)分析(canonical correspondence analysis, CCA)。

2 結(jié)果與分析

2.1 湖泊富營(yíng)養(yǎng)化狀態(tài)

如圖2所示，根據(jù)水體綜合營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)指數(shù)ITSI，7個(gè)湖泊共計(jì)23個(gè)研究湖區(qū)的營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)可分為兩個(gè)等級(jí)，14個(gè)湖區(qū)處于中營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)(30

圖 2 不同湖泊不同湖區(qū)水體綜合營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)指數(shù)

2.2 湖泊水體營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)對(duì)沉積物好氧氨氧化菌豐度的影響

采用熒光定量PCR方法分析湖泊沉積物AOA和AOB的豐度，結(jié)果見圖3。隨著湖泊營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)的提升，沉積物AOA和AOB的豐度也有所增加，每克底泥AOA的amoA基因拷貝數(shù)從中營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)的3.91×106增加到輕度富營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)的1.30×107(P=0.06，T-test)，AOB的amoA基因拷貝數(shù)從3.82×106增加到6.07×106(P=0.372，T-test)。同一營(yíng)養(yǎng)化狀態(tài)的湖泊沉積物AOA的豐度高于AOB的豐度，但二者之間并無顯著差異。

圖3 不同營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)湖區(qū)AOA和AOB豐度箱線圖(相同字母表示P>0.05)

2.3 湖泊水體營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)對(duì)沉積物好氧氨氧化菌群落組成的影響

(a) AOA(b) AOB圖4 湖泊沉積物中AOA和AOB amoA基因的T-RFLP指紋圖譜

如圖4所示，湖泊水體營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)對(duì)AOA和AOB的優(yōu)勢(shì)種屬并未產(chǎn)生影響。用限制性內(nèi)切酶MspⅠ酶切得到AOA 6個(gè)主要片段T-RF56、T-RF74、T-RF90、T-RF94、T-RF99、T-RF434，優(yōu)勢(shì)片段T-RF 56和T-RF 74在中營(yíng)養(yǎng)和輕度富營(yíng)養(yǎng)湖泊沉積物均有檢出；而片段T-RF90、T-RF94和T-RF99主要出現(xiàn)在中營(yíng)養(yǎng)湖泊沉積物中，T-RF434出現(xiàn)在輕度富營(yíng)養(yǎng)湖泊沉積物中。用限制性內(nèi)切酶Hpy8Ⅰ酶切得到AOB 2個(gè)較高相對(duì)豐度的片段(T-RF60和T-RF155)，其在不同營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)湖泊沉積物均有檢出；其他片段僅出現(xiàn)在1～3個(gè)湖區(qū)。

不同湖泊湖區(qū)沉積物中AOA和AOB群落多樣性變化情況見圖5。從圖5可以看出，AOA群落Shannon-Wiener指數(shù)從中營(yíng)養(yǎng)化湖泊的1.57下降到輕度富營(yíng)養(yǎng)湖泊的1.39，AOB群落Shannon-Wiener指數(shù)從0.28上升到0.32，但是，湖泊水體營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)對(duì)沉積物好氧氨氧化微生物群落多樣性影響無顯著性差異，然而在同一營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)下，沉積物中AOA群落的多樣性顯著高于AOB群落。

圖5 不同營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)湖區(qū)沉積物AOA和AOB群落Shannon-Wiener指數(shù)箱線圖

2.4 上覆水理化性質(zhì)對(duì)沉積物氨氧化菌群落結(jié)構(gòu)的影響

表1 AOA和AOB豐度和多樣性與上覆水水質(zhì)的相關(guān)性分析結(jié)果

注： *表示P<0.05;**表示P<0.01。

(a) AOA

(b) AOB圖6 湖泊上覆水理化性質(zhì)與沉積物氨氧化菌的CCA分析

3 討 論

4 結(jié) 論

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