MMP-2和RECK蛋白在子宮腺肌病內(nèi)膜組織中的表達及意義

王慧芳，金海紅，王智文

子宮腺肌病(adenomyosis, AM)是婦科的常見疾病，多發(fā)生于育齡期婦女，其基礎(chǔ)的病理改變?yōu)樽訉m內(nèi)膜腺體和間質(zhì)細胞向肌層浸潤并彌漫性生長。近年相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，AM發(fā)病年齡日趨年輕化，雖然該疾病屬于良性子宮病變，且激素藥物、血管介入、病灶挖除及電凝等措施為臨床治療提供多種選擇，但療效并不顯著[1]。尤其對有生育要求的患者，難以接受根治性手術(shù)。關(guān)于AM的發(fā)病機理目前尚未明確，但相關(guān)文獻表明其發(fā)展特性與惡性腫瘤相似，亦可發(fā)生種植、浸潤、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)等病理現(xiàn)象[2-3]。為探究AM的發(fā)病機制，本文研究基質(zhì)金屬蛋白酶-2(matrix metalloproteinase-2, MMP-2)及其抑制物RECK蛋白在AM病理組織中的表達情況，現(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇我院2015年6月—2017年11月收治的30例AM患者作為觀察對象。①納入標準：所有患者均行全子宮切除手術(shù)，并經(jīng)病理科確診。②排除標準：惡性腫瘤及其他子宮疾病患者；3個月內(nèi)接受激素類藥物治療者。年齡34～58(38.9±7.6)歲；增生期15例，分泌期15例。并收集所有患者的肌層異位內(nèi)膜(異位組)和非異位內(nèi)膜(非異位組)。并選取同期25例子宮肌瘤患者的非瘤區(qū)內(nèi)膜作為對照組，年齡35～57(38.2±9.3)歲；增生期12例，分泌期13例。AM患者和對照組的年齡、子宮內(nèi)膜處于增生期和分泌期比例比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2方法

1.2.1主要儀器與試劑：石蠟包埋機(BM型，湖北省醫(yī)用電子儀器廠)，生物組織攤片、烤片機(C9S-Ⅲ型，湖北省醫(yī)用電子儀器廠)，切片機(HM450型/EC350-2型，德國MICROM)，離心機(SIGMA 1-13型，美國)，雙目顯微鏡(CKL型，日本OLYMPUS)，數(shù)碼照相機(NIKON COOLPIX4500型，日本)。鼠抗人MMP-2單克隆抗體(美國NeMarker公司)，兔抗人RECK單克隆抗體(SANTA CRUA公司)，U1traSensitiveTmS-P超敏試劑和DAB顯色試劑盒(福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司)。

1.2.2檢測方法：采用免疫組織化學(xué)SP法對各組標本病理組織切片的MMP-2和RECK進行測定。經(jīng)兩位病理科醫(yī)師確診，顯微鏡下觀察各組染色情況，并記錄MMP-2和RECK染色強度。具體步驟為病理組織經(jīng)10%中性福爾馬林固定、常規(guī)石蠟包埋制成4 μm的連續(xù)切片；60℃恒溫箱內(nèi)烘烤1 h，并逐級脫蠟，水化，PBS液沖洗；RECK采用微波修復(fù)抗原，MMP-2采用高溫高壓修復(fù)抗原；后經(jīng)中和非特異性反應(yīng)，除去多余血清，滴加工作液，滴加鏈霉素抗生物素-過氧化酶溶液，室溫下孵育30 min(RECK)或10 min(MMP-2)，PBS液沖洗5 min，連續(xù)3次，DAB底物顯色，蘇木素復(fù)染切片，梯度乙醇脫水，二甲苯透明2次,各15 min，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察。

1.2.3結(jié)果觀察：設(shè)定陽性對照和陰性對照。RECK與MMP-2均為細胞質(zhì)著色，顯示為淺黃色至棕黃色的顆粒。隨機計數(shù)10個高倍視野，陰性為陽性細胞百分率<10%、弱陽性為10%～50%、陽性為50%～75%、強陽性為>75%。參照H-score組織化學(xué)評分方法進行評分，并以陽性強度和陽性細胞百分比積分乘積計算RECK和MMP-2蛋白表達積分。

2 結(jié)果

2.1MMP-2和RECK陽性表達率情況 異位組MMP-2陽性表達率明顯高于對照組(P<0.05)。非異位組MMP-2陽性表達率與對照組和異位組比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。異位組RECK陽性表達率低于非異位組和對照組(P<0.05)，但非異位組與對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 3組不同子宮內(nèi)膜組織MMP-2和RECK陽性表達率情況[例(%)]

注：異位組為肌層異位內(nèi)膜，非異位組為非異位內(nèi)膜，對照組為子宮肌瘤患者的非瘤區(qū)內(nèi)膜；MMP-2為基質(zhì)金屬蛋白酶-2；與對照組比較，aP<0.05；與非異位組比較，cP<0.05

2.2MMP-2和RECK蛋白表達積分比較 異位組MMP-2蛋白表達積分高于非異位組和對照組，且非異位組高于對照組(P<0.05)。異位組RECK蛋白表達積分低于非異位組和對照組(P<0.05)，但非異位組與對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表2。3組MMP-2和RECK蛋白表達情況，見圖1。

表2 3組不同子宮內(nèi)膜組織MMP-2和RECK蛋白表達積分情況分)

注：異位組為肌層異位內(nèi)膜，非異位組為非異位內(nèi)膜，對照組為子宮肌瘤患者的非瘤區(qū)內(nèi)膜；MMP-2為基質(zhì)金屬蛋白酶-2；與對照組比較，aP<0.05；與非異位組比較，cP<0.05

3 討論

AM主要表現(xiàn)為痛經(jīng)、經(jīng)期延長和不孕等，對婦女的身心健康造成極大損傷[4]。雖然AM發(fā)病機制并不確切，但多數(shù)學(xué)者認為其影響因素包括免疫、血管生成、細胞凋亡、細胞轉(zhuǎn)移及侵襲、激素及遺傳等，其中細胞轉(zhuǎn)移與侵襲過程與細胞外基質(zhì)(ECM)成分在周圍微環(huán)境的降解和重構(gòu)有關(guān)[5-7]。

AM病理特征是子宮內(nèi)膜腺體和間質(zhì)向肌層生長，其生長過程復(fù)雜，研究顯示AM的病理改變與ECM的降解關(guān)系密切，主要體現(xiàn)為含ECM成分平滑肌束組成的子宮肌層能夠阻止子宮內(nèi)膜的侵入作用[8]。MMPs在ECM降解過程中起關(guān)鍵性作用，可以降解ECM的所有成分[9-11]。相關(guān)文獻報道，MMP-2能夠降解子宮肌層中的Ⅳ型膠原[12-14]，其過度表達可增強內(nèi)膜侵襲力，從而降解異位內(nèi)膜周圍的肌層，甚至基底膜的ECM成分，造成AM[15]。本文結(jié)果顯示，與對照組比較，異位組MMP-2陽性表達率以及蛋白表達積分明顯升高，證實上述相關(guān)研究，顯示MMP-2在AM內(nèi)膜組織的異常表達與惡性腫瘤具有相似的生物學(xué)行為。

圖13組不同子宮內(nèi)膜組織MMP-2和RECK蛋白的表達情況(SP ×400)異位組為肌層異位內(nèi)膜，非異位組為非異位內(nèi)膜，對照組為子宮肌瘤患者的非瘤區(qū)內(nèi)膜；MMP-2為基質(zhì)金屬蛋白酶-2

RECK在胚胎發(fā)育分化過程中起重要作用，可影響胚胎毛細血管形成、神經(jīng)肌肉系統(tǒng)的發(fā)育、骨與軟骨系統(tǒng)發(fā)育及神經(jīng)肌肉連接組織的發(fā)育分化等[16-17]。RECK是MMPs抑制劑，能夠抑制多種MMPs表達，如MMP-2、MMP-7及MT1-MMP等。多項研究顯示,RECK與惡性腫瘤的發(fā)生相關(guān)，包括肺癌、肝細胞癌、膀胱移行細胞癌、頭頸部鱗狀細胞癌等，可抑制在惡性腫瘤中高表達的MMPs，從而減弱腫瘤細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力[18-19]。鑒于RECK可抑制MMP-2的表達，本研究檢測不同內(nèi)膜組織中RECK蛋白的表達，結(jié)果顯示異位組RECK陽性表達率及蛋白表達積分低于非異位組和對照組，證明AM異位內(nèi)膜組織中RECK蛋白表達缺失，使得MMPs進一步降解ECM，降低細胞間黏附力，造成子宮內(nèi)膜異位[20]。

綜上所述，MMP-2和RECK蛋白的異常表達可能在AM發(fā)病程中發(fā)揮重要作用。MMP-2的異常表達與RECK蛋白的表達缺失可能與AM患者子宮內(nèi)膜細胞“異位”到肌層有關(guān)，但引起兩者異常表達的具體原因尚需進一步探究。

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