miR-135b對(duì)LZST1表達(dá)及肺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移行為的影響

杜芝洋，杜發(fā)旺

目前，肺癌是呼吸系統(tǒng)中最常見的惡性腫瘤，是醫(yī)療保險(xiǎn)人群中排名前五的高花費(fèi)腫瘤，在臨床上主要通過手術(shù)或全身化療和放療進(jìn)行治療[1]。在免疫功能低下的老年肺癌患者中，更容易出現(xiàn)較高的轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)[2]。目前，轉(zhuǎn)移性肺癌的治療效果很不理想，化療效果也差強(qiáng)人意[3]。據(jù)相關(guān)報(bào)道，晚期轉(zhuǎn)移肺癌的5年生存率不超過10%[4]。因此，目前需要研究參與肺癌侵襲和轉(zhuǎn)移的分子靶標(biāo)，以及晚期轉(zhuǎn)移性肺癌新的治療策略。

miRNA是一種小的非編碼RNA分子，可以通過結(jié)合靶mRNA的3'端非翻譯區(qū)來(lái)抑制翻譯或誘導(dǎo)mRNA切割[5-6]。然而，關(guān)于肺癌中miRNA表達(dá)的臨床轉(zhuǎn)化成果較少[7-8]。有相關(guān)肺癌組織的miRNA芯片分析顯示，肺癌組織中有9種miRNA的表達(dá)發(fā)生明顯變化，其中miR-135b的表達(dá)在肺癌組織和配對(duì)正常組織中變化最大(上調(diào)8.5倍)[9]。并且miR-135b與腫瘤的生長(zhǎng)、生存期、運(yùn)動(dòng)性和侵襲性有密切的關(guān)聯(lián)[10]，在多種其他腫瘤(乳腺癌、肺癌、結(jié)腸癌和前列腺)組織中存在明顯表達(dá)差異[11-14]。在不同組織來(lái)源的惡性腫瘤中，miR-135b表現(xiàn)的致癌性或抑癌性，具有一定的組織特異性[15]。在頭頸部，miR-135b通過激活低氧誘導(dǎo)因子-1α來(lái)刺激癌細(xì)胞增殖，集落形成和血管生成，可能發(fā)揮腫瘤啟動(dòng)子的作用[16]。亮氨酸拉鏈腫瘤抑制基因1(LZTS1)被描述為促腫瘤基因[17]。功能研究表明，LZTS1的一個(gè)或兩個(gè)等位基因的過表達(dá)可以導(dǎo)致小鼠自發(fā)性腫瘤發(fā)生，并且重新導(dǎo)入LZTS1抑制因子可以抑制裸鼠體內(nèi)的致瘤性[18]。本研究為了探討miR-135b對(duì)LZTS1在肺癌組織中表達(dá)的影響，及其對(duì)肺癌A549細(xì)胞遷移和侵襲行為的影響，為肺癌發(fā)生和進(jìn)展的機(jī)制研究提供理論參考。

1 材料與方法

1.1組織標(biāo)本、細(xì)胞株和試劑 在本醫(yī)院獲得肺癌患者書面知情同意后，采集肺癌組織和癌旁正常組織樣本，石蠟包埋相關(guān)組織用于免疫組織化學(xué)研究。本研究獲得醫(yī)院審查委員會(huì)的批準(zhǔn)。人類肺癌A549細(xì)胞購(gòu)自復(fù)旦大學(xué)細(xì)胞培養(yǎng)中心，在37℃下5% CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。RPMI 1640細(xì)胞培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，胎牛血清購(gòu)自杭州四季青生物材料研究所，Transwell侵襲小室購(gòu)自美國(guó)Corning，Matrigel基質(zhì)膠購(gòu)自美國(guó)BD公司，脂質(zhì)體Lipofectamine 2000購(gòu)自Santa Cruz公司。LZST1一抗購(gòu)自美國(guó)Abcam公司。HOTAIR+siRNA和miR-135b-mimic購(gòu)自上海吉瑪生物科技有限公司。Trizol購(gòu)自美國(guó)Ambion公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(FSQ-101)購(gòu)自日本TOYOBO公司，PCR試劑盒購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。熒光素酶活性檢測(cè)試劑盒購(gòu)自Promega公司。熒光素酶報(bào)告載體由Promega公司合成。

1.2PCR分析 使用mirVana miRNA分離試劑盒從肺癌組織和癌旁正常組織中分離總RNA。使用Nano-2000分光光度計(jì)測(cè)定RNA濃度和純度。miR-135b引物序列：正向5'-GGCGTGAGGCTTGAGGGCT-3'，反向5'-GGCGTAGGCGATTGGGGATCG-3'。LZST1引物序列：正向5'-ATTTAAGGAGCGGATTTAGC-3'，反向5'-TTTTCGAGTCGAAACACACT-3'。以總RNA為模板，逆轉(zhuǎn)錄cDNA，反應(yīng)條件按照cDNA合成試劑盒使用說(shuō)明進(jìn)行設(shè)置，反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性10 min、95℃變性15 s、60℃退火32 s，循環(huán)50次后檢測(cè)其溶解曲線，檢測(cè)完成后，通過計(jì)算機(jī)系統(tǒng)自動(dòng)分析各樣本Ct值，采用RQ=2-ΔΔCt計(jì)算miRNA的相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3慢病毒轉(zhuǎn)染 根據(jù)慢病毒轉(zhuǎn)染說(shuō)明的方案，使用10 nmol的miR-135b-inhibitor和miR-135b-mimic模擬物轉(zhuǎn)染肺癌A549細(xì)胞，分為miR-135b-inhibitor組和miR-135b-mimic組；使用相應(yīng)的NC模擬物進(jìn)行陰性對(duì)照。使用高容量RNA-to-cDNA試劑盒和Power SYBR GreenMasterMix對(duì)轉(zhuǎn)染細(xì)胞中的miR-135b mRNA表達(dá)進(jìn)行qRT-PCR分析。用于miR-135b基因的PCR擴(kuò)增的引物如下：正向5'-ACCTCTAGAAACCCAGAACTCA-3'，反向5'-TCCAGAAGAGCCCATATCACTA-3'。使用U6作為內(nèi)參照：正向5'-GCGCCCAATACGACCAA-3'，反向5'-CTCTCTGCTCCTCCTGTTC-3'。使用熱循環(huán)儀通過qRT-PCR擴(kuò)增基因轉(zhuǎn)錄物。條件如下：在50℃下UNG溫育2 min和95℃下聚合酶活化10 min，然后95℃ 15 s和60℃ 1 min，進(jìn)行45個(gè)循環(huán)。通過計(jì)算機(jī)系統(tǒng)自動(dòng)分析各樣本Ct值，采用RQ=2-ΔΔCt計(jì)算miRNA的相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4Western blotting蛋白質(zhì)印跡分析 用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離細(xì)胞總蛋白，并將其轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜。使用5%脫脂牛奶充分封閉膜，并與一抗(LZST1濃度1∶1500)，內(nèi)參GAPDH(濃度1∶2000)，4℃下孵育過夜。次日，TBST充分沖洗過后，使用二抗辣根過氧化物酶標(biāo)記物(濃度1∶2000)孵育2 h，TBST充分沖洗過后，使用化學(xué)發(fā)光試劑ECL顯影液檢測(cè)目標(biāo)蛋白的表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5劃痕愈合實(shí)驗(yàn) 將轉(zhuǎn)染細(xì)胞和對(duì)照組細(xì)胞培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。使用200 μl無(wú)菌移液器尖端以標(biāo)準(zhǔn)方式將單層細(xì)胞劃傷創(chuàng)建無(wú)細(xì)胞區(qū)域。將培養(yǎng)基吸出并用新鮮的完全培養(yǎng)基代替，然后將細(xì)胞在37℃孵育48 h。48 h后記錄并拍照細(xì)胞的遷移情況。在每個(gè)實(shí)驗(yàn)條件下以5個(gè)隨機(jī)間隔測(cè)量遷移角化細(xì)胞之間的遷移殘余間隙，以實(shí)際遷移距離與原始擦傷寬度的百分比作為比較數(shù)據(jù)。

1.6Transwell侵襲實(shí)驗(yàn) 使用24孔板進(jìn)行細(xì)胞侵襲測(cè)定。將轉(zhuǎn)染細(xì)胞和對(duì)照組細(xì)胞培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，重新懸浮在無(wú)血清培養(yǎng)基中并以每孔1×104個(gè)細(xì)胞的密度加入到上室中，底室含有10%胎牛血清和正常濃度生長(zhǎng)因子的培養(yǎng)基。培養(yǎng)24 h后，通過抽吸基質(zhì)膠去除上部孔中的細(xì)胞并用棉簽擦拭膜的頂部。使用差異快速染色試劑將膜下側(cè)的細(xì)胞固定，進(jìn)行染色。在光學(xué)顯微鏡下計(jì)數(shù)細(xì)胞侵襲數(shù)目，每個(gè)膜觀察5個(gè)顯微鏡視野。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7免疫組織化學(xué)檢測(cè) 將6 μm厚組織切片在10%中性福爾馬林中固定10 min，然后用PBS洗滌2次。在室溫下用1%牛血清白蛋白封閉載玻片1 h，然后用1∶200稀釋度的LZTS1兔多克隆抗體在室溫下孵育1 h。以相同稀釋度的正常兔IgG作為陰性對(duì)照。吸出一抗并在PBS中洗滌2次后，用親和純化的驢抗兔IgG以1∶1000的稀釋度孵育LZTS1 30 min。然后洗滌載玻片并用DAPI以1∶1000的稀釋度染色1 min。使用95%乙醇固定細(xì)胞2 min后在顯微鏡下分析LZTS1染色強(qiáng)度。

2 結(jié)果

2.1miR-135b和LZST1的表達(dá)情況 肺癌組織和癌旁正常組織中miR-135b表達(dá)水平分別為4.15±0.76和1.28±0.29，LZST1表達(dá)水平分別為6.58±0.89和1.93±0.21。肺癌組織中miR-135b和LZST1表達(dá)水平明顯高于癌旁正常組織(P<0.05)。免疫組化結(jié)果顯示，LZST1蛋白在肺癌組織中表達(dá)陽(yáng)性，在癌旁正常組織中表達(dá)陰性。表明miR-135b和LZST1在肺癌中扮演一定的促癌作用。

2.2miR-135b對(duì)肺癌A549細(xì)胞LZST1蛋白表達(dá)的影響 miR-135b-inhibitor組、miR-135b-mimic組和陰性對(duì)照組的LZST1蛋白表達(dá)水平分別為1.03±0.29、4.03±1.02和1.86±0.76。miR-135b-mimic組的LZST1蛋白表達(dá)水平高于miR-135b-inhibitor組和陰性對(duì)照組，且陰性對(duì)照組高于miR-135b-inhibitor組(P<0.05)。結(jié)果表明過表達(dá)miR-135b后LZST1蛋白的表達(dá)上調(diào)，抑制miR-135b表達(dá)后LZST1蛋白的表達(dá)下調(diào)。見圖1。

圖1miR-135b對(duì)肺癌A549細(xì)胞LZST1蛋白表達(dá)的影響

A.miR-135b-mimic組和陰性對(duì)照組；B.miR-135b-inhibitor組和陰性對(duì)照組；LZST1為亮氨酸拉鏈腫瘤抑制基因1

2.3miR-135b對(duì)肺癌A549細(xì)胞遷移能力的影響 miR-135b-inhibitor組、miR-135b-mimic組和陰性對(duì)照組的實(shí)際遷移距離百分比分別為(9.8±1.9)%、(82.8±9.3)%和(33.6±4.2)%。miR-135b-mimic組的實(shí)際遷移距離百分比高于miR-135b-inhibitor組和陰性對(duì)照組，且陰性對(duì)照組高于miR-135b-inhibitor組(P<0.05)。結(jié)果表明過表達(dá)miR-135b后肺癌A549細(xì)胞的遷移能力增強(qiáng)，抑制miR-135b表達(dá)后肺癌A549細(xì)胞的遷移能力減弱。見圖2。

圖2miR-135b對(duì)肺癌A549細(xì)胞遷移能力的影響

2.4miR-135b對(duì)肺癌A549細(xì)胞侵襲能力的影響 miR-135b-inhibitor組、miR-135b-mimic組和陰性對(duì)照組侵襲至膜下的細(xì)胞數(shù)目分別為42.6±5.1、342.1±21.9和101.3±7.6。miR-135b-mimic組侵襲至膜下的細(xì)胞數(shù)目高于miR-135b-inhibitor組和陰性對(duì)照組，且陰性對(duì)照組高于miR-135b-inhibitor組(P<0.05)。結(jié)果表明過表達(dá)miR-135b后肺癌A549細(xì)胞的侵襲能力增強(qiáng)，抑制miR-135b表達(dá)后肺癌A549細(xì)胞的侵襲能力減弱。見圖3。

圖3miR-135b對(duì)肺癌A549細(xì)胞侵襲能力的影響(×40)

A.miR-135b-mimic組和陰性對(duì)照組；B.miR-135b-inhibitor組和陰性對(duì)照組

3 討論

最近的研究表明，部分miRNA不僅對(duì)促進(jìn)實(shí)體器官腫瘤的生成以及轉(zhuǎn)移瘤的發(fā)展具有一定的調(diào)控作用，而且對(duì)腫瘤的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移也可能發(fā)揮重要作用[19]。全基因組測(cè)序研究表明肺癌的基因表達(dá)譜存在巨大差異，從而引起其他的分子發(fā)展機(jī)制，如影響肺癌患者的基因表達(dá)及miRNA改變[20]。

miR-135b與多種類型惡性腫瘤的進(jìn)展有關(guān)[21]。本研究發(fā)現(xiàn)，miR-135b在肺癌組織中表達(dá)水平高于癌旁正常組織，同時(shí)可以調(diào)控下游LZST1蛋白的表達(dá)，過表達(dá)和抑制miR-135b后，LZST1蛋白水平也相應(yīng)上調(diào)和下調(diào)，推測(cè)腫瘤基因LZTS1可能是miR-135b的直接靶基因[22]。進(jìn)而推測(cè)miR-135b可能通過靶向調(diào)控LZTS1表達(dá)水平，而調(diào)控肺癌細(xì)胞的遷移和侵襲行為。有學(xué)者研究指出，miR-135b不直接參與肺癌A549增殖行為的直接調(diào)控，表明miR-135b是通過調(diào)控LZTS1腫瘤基因發(fā)揮功能的啟動(dòng)子。miR-135b表達(dá)從正常到息肉再到惡性組織的遞增表明miR-135b失調(diào)是一種早期癌變因素，隨著細(xì)胞分化異常逐漸表達(dá)增強(qiáng)[23]。因此，本實(shí)驗(yàn)研究的數(shù)據(jù)表明miR-135b可能通過調(diào)節(jié)腫瘤因子(如LZTS1等)干擾肺癌的進(jìn)展過程。

最近研究證明，LZTS1為miR-135b的靶基因，并且影響多種腫瘤的生長(zhǎng)，運(yùn)動(dòng)性和侵襲性[24]。然而，LZTS1在肺癌進(jìn)展過程中的作用以及與miR-135b表達(dá)的關(guān)系未被明確探討。LZTS1是miR-135b在肺癌中的腫瘤調(diào)控基因之一，但miR-135b/LZTS1軸在肺癌中的關(guān)系及其功能尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在癌旁正常肺組織中LZTS1表達(dá)普遍較低，而在肺癌組織中LZTS1表達(dá)明顯上調(diào)。這與先前報(bào)道的其他多種腫瘤類型(如乳腺癌和腎癌)中LZTS1表達(dá)降低相符合[25]。進(jìn)而本研究還在蛋白水平上發(fā)現(xiàn)LZTS1蛋白表達(dá)水平與miR-135b表達(dá)成正相關(guān)。證明過表達(dá)miR-135b可以增加LZTS1蛋白的表達(dá)，導(dǎo)致肺癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力增強(qiáng)。

還有研究顯示，人類腫瘤基因通常作為細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)劑起作用，通過上調(diào)miR-135b直接影響LZTS1蛋白的表達(dá)可導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞M期細(xì)胞周期機(jī)制的阻斷，導(dǎo)致遺傳變化的積累，引起遺傳不穩(wěn)定性和細(xì)胞非整倍性的出現(xiàn)[26]。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，通過敲除小鼠體內(nèi)的LZTS1基因會(huì)發(fā)展出各種腫瘤，表明非整倍體表型可以驅(qū)動(dòng)體內(nèi)細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化[27]。馬瑞宏等[28]研究表明，抑制miR-135b不影響體外肺癌細(xì)胞的增殖能力，說(shuō)明在影響惡性細(xì)胞遷移和侵襲功能的同時(shí)miR-135b的丟失不會(huì)直接干擾腫瘤生長(zhǎng)。

綜上所述，miR-135b/LZTS1信號(hào)軸在肺癌進(jìn)展中起重要調(diào)控作用，并且miR-135b可能作為臨床肺癌生物治療的有效靶點(diǎn)，后續(xù)實(shí)驗(yàn)需要進(jìn)一步研究miR-135b的作用機(jī)制，以逐步開發(fā)肺癌及肺癌轉(zhuǎn)移瘤的新治療方式。

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