糖基化亞硝基牦牛血紅蛋白制備及工藝優(yōu)化研究

貢佳欣，唐善虎，劉星汶，王 柳，范 藝

(西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院成都 610041)

牦牛血是牦牛屠宰加工過(guò)程中主要的副產(chǎn)物之一，可以提供很好的蛋白和色素資源[1－2]，但長(zhǎng)期以來(lái)牦牛血液并未受到重視，大都作為廢棄物排放掉，不僅使資源大量浪費(fèi)還造成嚴(yán)重的環(huán)境污染[3].牦牛血液中血紅蛋白含量高[4]，若能有效利用豐富的牦牛血資源制備亞硝基血紅蛋白，用于替代亞硝酸鹽，降低產(chǎn)品中亞硝酸鹽殘留量，既可增加產(chǎn)品中蛋白質(zhì)、鐵等成分含量，又可使產(chǎn)品擁有誘人的玫瑰色[5].亞硝基血紅蛋白結(jié)構(gòu)并不穩(wěn)定，易發(fā)生降解使產(chǎn)品褪色[6－7]，因此在一定條件下通過(guò)美拉德反應(yīng)讓蛋白與多糖形成糖基化亞硝基血紅蛋白，可提高其溶解性、光照和熱穩(wěn)定性等功能特性[8].楊錫洪[9]研究了糖的濃度、pH、加熱溫度和時(shí)間等條件對(duì)糖基化反應(yīng)的作用效果，發(fā)現(xiàn)pH對(duì)糖基化反應(yīng)的作用最大.李飛等[10]探討了不同光照和貯藏條件對(duì)糖基化亞硝基血紅蛋白穩(wěn)定性的影響，發(fā)現(xiàn)光照后色素的氧化程度下降，并發(fā)現(xiàn)氧化劑H2O2對(duì)蛋白質(zhì)穩(wěn)定性有較大的影響.

目前，采用牦牛血制備糖基化亞硝基血紅蛋白尚未見報(bào)道，也未見研究糖基化亞硝基牦牛血紅蛋白穩(wěn)定性報(bào)道.本研究用牦牛血制備亞硝基牦牛血紅蛋白，優(yōu)化制備工藝、考察不同殼聚糖添加量、pH值、加熱溫度以及加熱時(shí)間對(duì)糖基化反應(yīng)的影響.

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

牦牛血采自紅原牦牛屠宰廠.本研究中所使用的化學(xué)試劑包括亞硝酸鈉、殼聚糖、檸檬酸鈉、氯化鈉、異抗壞血酸、鹽酸萘乙二胺、甲基紅指示劑、溴甲酚綠指示劑、亞甲基藍(lán)指示劑、硫酸銅、硫酸鉀、亞鐵氰化鉀、乙酸鋅、硼砂、對(duì)氨基苯磺酸、氫氧化鈉、鹽酸、硫酸、硼酸、95%乙醇均為化學(xué)分析純.

1.2 主要儀器

Centrifuge 5804離心機(jī)(Eppendorf公司)；電子天平(梅特勒－托利多儀器有限公司)；AOE翱藝分光光度計(jì)(翱藝儀器上海有限公司)；MP511型實(shí)驗(yàn)室pH計(jì)(上海三信儀表廠)；MDF－U4086S超低溫冰箱(三洋電器有限公司)；ALPHA 1－4 LSC冷凍干燥機(jī)(LyoShuttle Drive Martin Christ公司)；JJ－1精密定時(shí)電動(dòng)攪拌器(江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司)；DHG－9240A電熱恒溫鼓風(fēng)恒溫干燥箱(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)；超級(jí)恒溫水浴鍋(國(guó)華HH－6數(shù)顯恒溫水浴鍋)；Kjeltec 2200自動(dòng)凱氏定氮儀(瑞士Foss公司).

1.3 糖基化亞硝基血紅蛋白制備工藝

根據(jù)楊錫洪[9]和李飛[10]報(bào)道的糖基化亞硝基血紅蛋白制備方法，稍作修改制定牦牛血制備糖基化亞硝基血紅蛋白工藝如下:

牦牛血→抗凝→洗滌→溶漲破壁→離心→棄沉淀，取上清液→制備亞硝基血紅蛋白→糖基化→真空冷凍干燥→糖基化亞硝基血紅蛋白成品

1.3.1 制取抗凝牦牛血液

1 000 mL新鮮牦牛血中加入5.0 g檸檬酸鈉并輕輕攪拌，保持低溫條件迅速運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，過(guò)濾除去雜物.

1.3.2 提取牦牛血細(xì)胞

在3 000 r/min離心條件下，離心抗凝血15 min，棄去上清液.生理鹽水(0.9%NaCl水溶液)與血液等體積混勻，以3 000r/min離心15 min，取下部沉淀，重復(fù)2次，得到洗干凈的紅細(xì)胞.

1.3.3 牦牛血細(xì)胞的破壁

采用本實(shí)驗(yàn)室常用的溶脹法，加入4體積蒸餾水對(duì)紅細(xì)胞進(jìn)行破裂處理，磁力攪拌30 min，充分釋放血紅蛋白.60℃水浴加熱血紅蛋白溶液30 min，4 000 r/min離心15 min，棄沉淀，得純度較高血紅蛋白溶液.

1.3.4 牦牛亞硝基血紅蛋白的制備

取100 mL血紅蛋白溶液，加入異抗壞血酸鈉0.360 g，亞硝酸鈉0.080 g，HCl調(diào)節(jié)溶液pH至6.0，60℃反應(yīng)20 min，再于3 000 r/min離心15 min，取上清液，得亞硝基血紅蛋白溶液.

1.4 牦牛糖基化亞硝基血紅蛋白的制備工藝優(yōu)化

1.4.1 單因素試驗(yàn)

單因素試驗(yàn)根據(jù)楊錫洪[9]的試驗(yàn)方法，考察不同殼聚糖添加量、pH值、加熱溫度及加熱時(shí)間對(duì)制備出的亞硝基血紅蛋白糖基化反應(yīng)的影響.

(1)殼聚糖添加量對(duì)糖基化反應(yīng)的影響

取10%的亞硝基血紅蛋白溶液10 mL，分別按照3:1、2.5:1、2:1、1.5:1、1:1 加入 2%濃度的殼聚糖溶液，調(diào)節(jié)混合液pH為5.5，55℃下低速攪拌，加熱20 min后定容至100 mL，3 000 r/min離心15 min，取上清液，以吸光度為評(píng)價(jià)指標(biāo)，于A540nm下比色，確定最佳殼聚糖添加量.

(2)pH值對(duì)糖基化反應(yīng)的影響

取10%的亞硝基血紅蛋白溶液10 mL，加入2%濃度殼聚糖溶液2.5 mL，調(diào)節(jié)混合液pH為5.0、5.5、6.0、6.5和7.0，55℃下低速攪拌，加熱20 min后定容至100 mL，3 000 r/min離心15 min，取上清液，以吸光度為評(píng)價(jià)指標(biāo)，于A540nm下比色，確定最佳pH值.

(3)加熱溫度對(duì)糖基化反應(yīng)的影響

取10%的亞硝基血紅蛋白溶液10 mL，加入2%濃度殼聚糖溶液2.5 mL，調(diào)節(jié)混合液pH為5.5，分別于35、40、45、50、55、60 ℃條件下加熱 20 min，定容至100 mL，3 000 r/min離心15 min，取上清液，以吸光度為評(píng)價(jià)指標(biāo)，于A540nm下比色，確定最佳反應(yīng)溫度.

(4)加熱時(shí)間對(duì)糖基化反應(yīng)的影響

取10%的亞硝基血紅蛋白溶液10 mL，加入2%濃度殼聚糖溶液2.5 mL，調(diào)整為 pH5.5，在 55℃水浴條件下分別加熱 5、10、15、20、25、30、35、40 min，定容至100 mL，3 000 r/min離心15 min，取上清液，以吸光度為評(píng)價(jià)指標(biāo)，于A540nm下比色，確定最佳反應(yīng)時(shí)間.

1.4.2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在殼聚糖添加量、加熱溫度、加熱時(shí)間和pH值單因素試驗(yàn)結(jié)果，經(jīng)過(guò)數(shù)據(jù)分析篩選后，采用L9(34)表設(shè)計(jì)4因素3水平正交試驗(yàn)，優(yōu)化糖基化反應(yīng)工藝條件.

1.4.3 糖基化亞硝基牦牛血紅蛋白理化特性

(1)蛋白質(zhì)含量的測(cè)定

根據(jù)GB 5009.5－2010提供的凱氏定氮法進(jìn)行蛋白質(zhì)含量測(cè)定.

(2)亞硝酸鹽殘留量的測(cè)定

亞硝酸鹽殘留量采用GB 5009.33－2010建議的鹽酸奈乙二胺法測(cè)定.

(3)水分測(cè)定

采用GB 5009.3－2010常溫烘箱干燥法測(cè)定水分.

(4)灰分的測(cè)定

灰分含量根據(jù)GB/T 5505－2008測(cè)定.

1.4.4 統(tǒng)計(jì)分析

所有樣本處理重復(fù)3次，數(shù)據(jù)分析使用SPSS V19.0軟件包，采用ANOVA進(jìn)行方差分析和顯著性檢驗(yàn)，采用Duncan法進(jìn)行多重比較，使用Excel 2010軟件做圖表.

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 殼聚糖添加量對(duì)糖基化的影響

在pH值為6.0，水浴溫度為55℃，加熱時(shí)間為20 min條件下，考察不同濃度殼聚糖溶液對(duì)糖基化反應(yīng)的影響.結(jié)果表明，不同殼聚糖添加量對(duì)糖基化亞硝基血紅蛋白的吸光度有顯著影響(P＜0.05).由圖1可知，反應(yīng)產(chǎn)物的吸光度隨殼聚糖加入量的增加不斷緩慢上升.反應(yīng)在亞硝基血紅蛋白濃度低的情況下更易進(jìn)行，但蛋白濃度過(guò)低使后期干燥處理效果不理想，相反濃度過(guò)高時(shí)，在加熱條件下，肽鏈會(huì)充分伸展聚集，糖基化反應(yīng)不完全[11].牦牛血中血紅蛋白含量高于豬血中血紅蛋白含量，所需的殼聚糖添加量大于豬血糖基化亞硝基血紅蛋白殼聚糖添加量(5:1)[9].綜合糖基化效果和成本兩個(gè)因素，最終選擇糖基化的殼聚糖含量為6.67 mL(1.5:1).

圖1 殼聚糖添加量對(duì)糖基化反應(yīng)的影響Fig.1 Effect of chitosan addition on the glycosylation reaction

2.1.2 pH值對(duì)糖基化的影響

在水浴溫度55℃，2%濃度殼聚糖溶液3.33 mL，加熱時(shí)間為20 min條件下，考察不同pH值對(duì)糖基化反應(yīng)的影響.結(jié)果表明，不同pH值對(duì)糖基化亞硝基血紅蛋白的吸光度有顯著影響(P＜0.05).如圖2所示，當(dāng)pH值為6.0時(shí)，產(chǎn)物的吸光度最大，糖基化效果最佳，pH＞6.0后吸光度開始下降.pH值會(huì)影響蛋白質(zhì)分子的水解和酸堿性質(zhì)，從而影響蛋白質(zhì)－水的相互作用[12].pH值是影響蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的因素之一，蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)時(shí)最穩(wěn)定，這時(shí)，蛋白質(zhì)所帶凈電荷較少，分子內(nèi)部排斥力較小，可結(jié)合少部分的水，蛋白質(zhì)變性的可能性大大增加[13]；在靜電作用影響下，帶凈負(fù)電荷的蛋白質(zhì)和多糖可生成可溶性蛋白質(zhì)－多糖復(fù)合物，此時(shí)，蛋白質(zhì)分子正電荷區(qū)域與陰離子多糖相互吸引[14].pH值為6.0時(shí)，糖基化效果最好，可能是因?yàn)閜H值對(duì)蛋白質(zhì)穩(wěn)定性和大分子間相互作用力有影響.

圖2 pH值對(duì)糖基化反應(yīng)的影響Fig.2 Effect of pH value on the glycosylation reaction

2.1.3 加熱溫度對(duì)糖基化的影響

在pH值為6.0，2%濃度殼聚糖溶液3.33 mL，加熱時(shí)間為20 min條件下，考察不同水浴溫度對(duì)糖基化反應(yīng)的影響.結(jié)果表明，改變加熱溫度對(duì)糖基化亞硝基血紅蛋白的吸光度有顯著的影響(P＜0.05).如圖3所示，在水浴溫度為55℃時(shí)，吸光度達(dá)到最高，糖基化效果最佳，溫度在45℃吸光度下降可能是因?yàn)榈蜏叵滦纬傻亩嗵牵鞍坠矁r(jià)復(fù)合物有更好的穩(wěn)定性[8].溫度在55℃后吸光度下降，可能是因?yàn)殡S著溫度升高，蛋白質(zhì)變性降低了溶液中產(chǎn)物的濃度，而使吸光度降低.因此選擇水浴溫度為55℃.

圖3 加熱溫度對(duì)糖基化反應(yīng)的影響Fig.3 Effect of temperature on the glycosylation reaction

2.1.4 加熱時(shí)間對(duì)糖基化的影響

在pH值為6.0，2%濃度殼聚糖溶液3.33 mL，水浴溫度為55℃條件下，考察不同加熱時(shí)間對(duì)糖基化反應(yīng)的影響.結(jié)果表明，改變加熱時(shí)間對(duì)糖基化亞硝基血紅蛋白的吸光度有顯著的影響(P＜0.05).如圖4所示，加熱時(shí)間為30 min，吸光度最高，糖基化效果最佳，加熱時(shí)間在5 min～20 min時(shí)吸光度基本保持不變，在20 min～30 min之間吸光度上升，在30 min～40 min時(shí)吸光度有所下降.在30 min之前，糖基化反應(yīng)不完全，超過(guò)30 min，未參與反應(yīng)的熱穩(wěn)定性差的亞硝基血紅蛋白可能會(huì)發(fā)生變性，產(chǎn)物濃度降低，測(cè)出的吸光度也偏低[15].由于牦牛血中血紅蛋白含量高于豬血中血紅蛋白含量，糖基化反應(yīng)所需時(shí)間增加，選擇加熱時(shí)間為30 min.

圖4 不同加熱時(shí)間對(duì)糖基化反應(yīng)的影響Fig.4 Effect of heating time on the glycosylation reaction

2.2 正交試驗(yàn)

2.2.1 糖基化條件正交優(yōu)化

由表1極差分析D＞C＞B＞A可知，各因素對(duì)亞硝基血紅蛋白糖基化反應(yīng)的影響順序?yàn)閜H值＞加熱時(shí)間＞加熱溫度＞殼聚糖添加量.單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)結(jié)果表明，制備糖基化亞硝基血紅蛋白工藝的組合為A1B2C3D2，即最佳反應(yīng)條件為pH6.0，加熱溫度55℃，加熱時(shí)間 35 min，殼聚糖溶液添加量為6.67 mL.

表1 L9(34)正交試驗(yàn)結(jié)果Table 1 L9(34)orthogonal test results

2.2.2 正交試驗(yàn)各因素趨勢(shì)圖分析

四種因素對(duì)糖基化亞硝基血紅蛋白的形成影響見圖5.由圖5可知，在殼聚糖溶液添加量為5 mL時(shí)，糖基化亞硝基血紅蛋白的吸光度為最大值0.692，吸光度的整體趨勢(shì)是吸光度不斷下降.所以，試驗(yàn)水平應(yīng)選擇殼聚糖溶液添加量為5 mL，即A1.當(dāng)加熱溫度為55℃時(shí)，糖基化亞硝基血紅蛋白的吸光度達(dá)到最大值0.718，吸光度呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì).試驗(yàn)水平應(yīng)選擇加熱溫度為55℃，即B2.加熱時(shí)間增加，該蛋白的吸光度漸漸上升，當(dāng)加熱時(shí)間為35 min時(shí)吸光度最大，為0.785.所以，僅從此圖分析可得，試驗(yàn)水平因選擇加熱時(shí)間為35 min，即C3.當(dāng)pH值為6.0時(shí)，糖基化亞硝基血紅蛋白的吸光度最大達(dá)到0.827，吸光度的整體趨勢(shì)是吸光度不斷下降.所以，試驗(yàn)水平應(yīng)選擇pH值為6.0，即D2.綜上所述，最優(yōu)水平為A1B2C3D2，各因素最優(yōu)條件分別為殼聚糖溶液添加量5 mL、加熱溫度55℃、加熱時(shí)間35 min、pH值6.0.

圖5 正交各因素趨勢(shì)圖Fig.5 Diagram of orthogonal factor trend

2.3 糖基化亞硝基牦牛血紅蛋白得率

參照楊錫洪[9]的試驗(yàn)方法，選擇真空冷凍干燥法制備粉末狀色素產(chǎn)品，1 750 mL糖基化亞硝基血紅蛋白溶液經(jīng)過(guò)真空冷凍干燥后，產(chǎn)品總質(zhì)量為37.324 g.計(jì)算糖基化亞硝基血紅蛋白得率為0.021 g/mL.

2.4 糖基化亞硝基牦牛血紅蛋白理化特性

經(jīng)過(guò)測(cè)定，糖基化亞硝基牦牛血紅蛋白各項(xiàng)理化指標(biāo)見表2.

表2 糖基化亞硝基牦牛血紅蛋白理化特性Table 2 Physicochemical properties of yak glycosylated nitroso－h(huán)emoglobin

從表2看出，干燥后的產(chǎn)品組成為蛋白質(zhì)54.64%、水分18.36%、灰分18.54%和亞硝酸鈉0.009 mg/kg，蛋白質(zhì)含量高，亞硝酸鈉殘留含量較低低，符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，可作為食用紅色素應(yīng)用于食品加工中.

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)探討殼聚糖溶液添加量、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間以及pH值這4個(gè)因素對(duì)亞硝基血紅蛋白糖基化的影響，影響結(jié)果的各因素主次順序?yàn)閜H值＞加熱時(shí)間＞加熱溫度＞殼聚糖溶液添加量.pH為主要影響因素，其次為反應(yīng)時(shí)間.綜合分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，亞硝基血紅蛋白糖基化的最優(yōu)組合為殼聚糖溶液添加量為5.0 mL，pH 6.0，加熱溫度55℃，加熱時(shí)間35 min.

產(chǎn)品的組成為蛋白質(zhì)含量 54.64%、水分18.36%、灰分 18.54%和亞硝酸鈉 0.009 mg/kg，溶解在水中，可作為食用紅色素用于食品加工.

[1] 于海燕，羅永康.牦牛血理化特性的研究[J].2007(06):33-35.

[2] 朱森陽(yáng)，汪國(guó)和，王志鵬.畜禽血液資源的開發(fā)利用進(jìn)展[J].養(yǎng)殖與飼料，2007(01):67-69.

[3] 王華清，來(lái)進(jìn)君，段培琪，等.青海牦牛血液資源的研究現(xiàn)狀及開發(fā)利用[J].青海畜牧獸醫(yī)雜志，2016(02):43-44.

[4] 盧福山，張才俊.高原型牦牛8項(xiàng)血液指標(biāo)的測(cè)定[J].青海畜牧獸醫(yī)雜志，2006，36(4):3-4.

[5] TICHIVANGANA J Z，MORRISSEY P A，BUCKLEY D J.Acceptability of nitrite－ free bacon[J].Irish Food Sci and Tech，1984(8):99-104.

[6] SHAHIDI F，PEGGR B.Novel synthesis of cooked cured－meat pigment[J].Food Science，1991，56(3):1205-1212.

[7] SHAHIDI F，PEGGR B.Preparation of the cooked cured－meat pigment，dinitrosyl－ ferrohemochrome，from hemin and nitric oxide[J].Food Science，1985，50:272-273.

[8] KATO Y，WATANABE K，SATO Y.Effect of maillard reaction on some physical propertois of oval－ bumin[J].Food Science，1981，46(6):1835-1839.

[9] 楊錫洪.以血紅蛋白制備腌制色素替代亞硝酸鈉發(fā)色的研究[D].無(wú)錫:江南大學(xué)，2005.

[10] 李飛，隋新，劉紅娟，等.糖基化亞硝基血紅蛋白的穩(wěn)定性及其在豬肉脯中的應(yīng)用研究[J].農(nóng)產(chǎn)品加工，2015，(04):9-14.

[11] 齊軍茹，楊曉泉，彭志英.蛋白－多糖共價(jià)復(fù)合作用研究進(jìn)展[J].食品工業(yè)科技，2003(11):85-87＋84.

[12] 夏延斌.食品化學(xué)[M].北京:中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2004.

[13] 劉成國(guó)，陳瑤，王冬冬，等.糖基化亞硝基血紅蛋白制備工藝優(yōu)化[J].食品科學(xué)，2011，32(16):93-97.

[14] 熊拯，郭興鳳，談天.蛋白質(zhì)—陰離子多糖相互作用研究進(jìn)展[J].糧食與油脂，2006(10):15-17.

[15] 陳瑤.糖基化亞硝基血紅蛋白的制取及其應(yīng)用研究[D].長(zhǎng)沙:湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)，2011.