兒童急性白血病骨髓單個(gè)核細(xì)胞中TAp63基因的表達(dá)及意義研究

潘陽瓊，陳豪，宋春蘭，成怡冰*

p63基因作為p53家族成員之一，定位于3號(hào)染色體長(zhǎng)臂2區(qū)7帶（3q27～3q29），分布于皮膚、肌肉、乳腺、食管、肺、脾、淋巴細(xì)胞、神經(jīng)組織、消化系統(tǒng)及泌尿生殖系統(tǒng)。p63基因的表達(dá)受兩種不同啟動(dòng)子的調(diào)節(jié)而產(chǎn)生兩種具有不同活性的蛋白質(zhì)，一種是全長(zhǎng)鏈的活化型p63（TAp63），另一種是顯性失活的截短型p63（ΔNp63）［1］。潘陽瓊等［2］研究顯示，TAp63基因在成年人血液系統(tǒng)惡性腫瘤中表達(dá)增高，而這與TAp63基因在實(shí)體腫瘤中作用不同有關(guān)。為探索TAp63基因在兒童急性白血病發(fā)生、發(fā)展中的作用及其臨床意義，本研究采用半定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）方法，對(duì)兒童急性白血病初發(fā)、復(fù)發(fā)、化療后達(dá)完全緩解的患兒以及對(duì)照組骨髓單個(gè)核細(xì)胞中TAp63基因的表達(dá)進(jìn)行了檢測(cè)。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 收集2015年6月—2016年6月鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院和鄭州兒童醫(yī)院兒科住院的初治或復(fù)發(fā)急性白血病患兒104例為急性白血病組，患兒均符合兒童急性白血病的診斷標(biāo)準(zhǔn)［3］，其中男64例，女40例；年齡1～12歲，中位年齡7歲；急性淋巴細(xì)胞白血病（ALL）80例〔急性B淋巴細(xì)胞白血?。˙-ALL）61例，急性T淋巴細(xì)胞白血?。═-ALL）19例〕，急性非淋巴細(xì)胞白血?。ˋNLL）24例；初發(fā)患兒90例（高危型18例、低危型72例），復(fù)發(fā)患兒14例（均為高危型）。同期選擇鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院和鄭州兒童醫(yī)院住院的非惡性血液病患兒36例作為對(duì)照組，其中男24例，女12例；年齡2～13歲，中位年齡8歲；包括傳染性單核細(xì)胞增多癥16例、免疫性血小板減少癥14例、缺鐵性貧血6例。

1.2 TAp63 mRNA檢測(cè) 所有患兒化療前采集骨髓標(biāo)本2～4 ml，置于肝素抗凝管中，用Ficoll液分離骨髓單個(gè)核細(xì)胞，采用美國(guó)Gibco公司的TRIzol試劑盒，利用一步法提取總RNA。按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書步驟進(jìn)行，該試劑盒及說明書由北京康為世紀(jì)生物科技有限公司提供，反應(yīng)體系20 μl，包括 5×RT Mix 4 μl，PrimerMix 2 μl，RNA Template 5 μl，HiFi-MMLV Mix 1 μl，RNase-free water 8 μl，37 ℃ 60 min，70 ℃ 10 min后終止反應(yīng)。PCR引物由生工生物工程（上海）股份有限公司設(shè)計(jì)合成，TAp63上游引物5'-GGGTGAGCGTGTTATTGATG-3'，下 游 引 物5'-TTAGATGCCAGGTCAGATGTT-3'，擴(kuò)增片段314 bp；內(nèi)參照β-actin上游引物5'-TGAAGTGTGACGTGGACATCCG-3'，下游引物5'-GCTGTCACCTTCACCGTTCCAG-3'， 擴(kuò) 增 片 段449 bp。反應(yīng)體系25 μl，包括cDNA 4 μl，上下游引物各 1 μl，2×Taq MasterMix 12.5 μl，其余以 RNasefree water補(bǔ)足至 25 μl，引物終濃度為 0.4 μmol/L。2×Taq MasterMix由北京康為世紀(jì)生物科技有限公司提供，PCR擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃變性30 s、56 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s，25個(gè)循環(huán)；72 ℃終延伸5 min。取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物5 μl上樣于2%瓊脂糖凝膠中電泳后觀察結(jié)果，以Gene tools from SynGene軟件進(jìn)行掃描并測(cè)定其灰度值，以TAp63與β-actin PCR產(chǎn)物條帶灰度值的比值代表TAp63 mRNA相對(duì)表達(dá)量。TAp63 mRNA相對(duì)表達(dá)量＞0即為TAp63基因陽性表達(dá)。

1.3 治療方案 根據(jù)張之南等［3］主編的《血液病診斷及療效標(biāo)準(zhǔn)》（第3版）對(duì)所有急性白血病患兒行骨髓穿刺做骨髓形態(tài)學(xué)及細(xì)胞遺傳學(xué)檢查，根據(jù)檢查結(jié)果，將所有患兒分為低危型、中危型、高危型，其危險(xiǎn)度分型標(biāo)準(zhǔn)相同?；煼桨讣凑T導(dǎo)緩解方案：ALL患兒采用推薦兒童癌癥和白血病組（CCLG）-ALL 2008方案［4］，即VDLP方案（長(zhǎng)春新堿、柔紅霉素、門冬酰胺酶、潑尼松）；ANLL患兒采用推薦方案［4］，低危型和中危型（除急性早幼粒細(xì)胞性白血?。哼xDAE方案（柔紅霉素、阿糖胞苷、依托泊苷）；高危型：選IA方案（去甲柔紅霉素、阿糖胞苷）。臨床療效按照張之南等［3］主編的《血液病診斷及療效標(biāo)準(zhǔn)》（第3版）判定。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)或Fisher's確切概率法；計(jì)量資料以（±s）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TAp63基因在急性白血病組及對(duì)照組患兒中的表達(dá) 急性白血病組104例患兒中TAp63基因陽性表達(dá)86例，陽性表達(dá)率為82.7%，TAp63 mRNA相對(duì)表達(dá)量為（0.61±0.19）；對(duì)照組患兒TAp63基因陽性表達(dá)0例。

2.2 TAp63基因在ALL與ANLL患兒中的表達(dá) ALL與ANLL患兒TAp63基因陽性表達(dá)率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；ALL患兒TAp63 mRNA相對(duì)表達(dá)量較ANLL患兒升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，見表1）。

2.3 TAp63基因在初發(fā)與復(fù)發(fā)患兒中的表達(dá) 初發(fā)與復(fù)發(fā)患兒TAp63基因陽性表達(dá)率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；復(fù)發(fā)患兒TAp63 mRNA相對(duì)表達(dá)量較初發(fā)患兒升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，見表2）。

2.4 TAp63基因在B-ALL與T-ALL患兒中的表達(dá)B-ALL患兒TAp63基因陽性表達(dá)率、TAp63 mRNA相對(duì)表達(dá)量較T-ALL患兒升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，見表3）。

2.5 TAp63基因在高危型與低危型初發(fā)患兒中的表達(dá)

高危型與低危型初發(fā)患兒TAp63基因陽性表達(dá)率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；高危型初發(fā)患兒TAp63 mRNA相對(duì)表達(dá)量較低危型初發(fā)患兒升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，見表4）。

2.6 TAp63基因在完全緩解與未緩解患兒中的表達(dá)急性白血病組患兒中58例進(jìn)行了系統(tǒng)治療，包括初發(fā)急性白血病患兒40例，復(fù)發(fā)急性白血病患兒18例。初發(fā)40例急性白血病患兒中，經(jīng)誘導(dǎo)化療后達(dá)完全緩解30例（75.0%），未緩解10例（25.0%）；18例復(fù)發(fā)急性白血病患兒中達(dá)完全緩解6例，未緩解12例。完全緩解與未緩解患兒TAp63基因陽性表達(dá)率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；未緩解患兒TAp63 mRNA相對(duì)表達(dá)量較完全緩解患兒升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，見表5）。

3 討論

人類p63基因定位于染色體3q27～3q29，在兩個(gè)不同的啟動(dòng)子控制下，編碼兩類轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物：一類為TAp63，另一類為ΔNp63，二者亞型結(jié)構(gòu)不同，作用也不同，本研究探討的是具有轉(zhuǎn)錄激活區(qū)的TAp63，所設(shè)計(jì)的引物為TAp63α、TAp63β和TAp63γ共有的中間序列，以保證RT-PCR產(chǎn)物的特異性，使RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為具有轉(zhuǎn)錄活性的TAp63，以與ΔNp63區(qū)別開。

表1 ALL與ANLL患兒TAp63基因陽性表達(dá)率及TAp63 mRNA相對(duì)表達(dá)量比較Table 1 Comparison of positive expression rate of TAp63 gene and TAp63 mRNA relative expression between ALL and ANLL children

表2 初發(fā)與復(fù)發(fā)患兒TAp63基因陽性表達(dá)率及TAp63 mRNA相對(duì)表達(dá)量比較Table 2 Comparison of positive expression rate of TAp63 gene and TAp63 mRNA relative expression between incipient and recurrent children

表3 B-ALL與T-ALL患兒TAp63基因陽性表達(dá)率及TAp63 mRNA相對(duì)表達(dá)量比較Table 3 Comparison of positive expression rate of TAp63 gene and TAp63 mRNA relative expression between B-ALL and T-ALL children

表4 高危型與低危型初發(fā)患兒TAp63基因陽性表達(dá)率及TAp63 mRNA相對(duì)表達(dá)量比較Table 4 Comparison of positive expression rate of TAp63 gene and TAp63 mRNA relative expression between high-risk and low-risk incipient children

現(xiàn)階段TAp63基因在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中的作用尚不明確，相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)可能有以下機(jī)制：（1）TAp63基因可影響細(xì)胞因子的水平，從而影響骨髓造血微環(huán)境，骨髓造血微環(huán)境的改變會(huì)影響腫瘤細(xì)胞的生存，如BINSKY等［5］發(fā)現(xiàn)在慢性淋巴細(xì)胞白血?。–LL）中通過自然配體刺激CD74從而上調(diào)TAp63基因的表達(dá)，TAp63基因表達(dá)水平升高可使得整合素極遲反應(yīng)抗原（VLA-4）的表達(dá)水平升高，從而促進(jìn)白血病細(xì)胞歸巢到骨髓，減少白血病細(xì)胞的凋亡，白血病細(xì)胞凋亡減少，又會(huì)促進(jìn)白血病的發(fā)生。GRAZIANO等［6］研究提示TAp63基因在造血及淋巴系統(tǒng)惡性腫瘤中高表達(dá)，而在實(shí)體瘤低表達(dá)。ORZOL等［1］同樣認(rèn)為TAp63基因在血液系統(tǒng)惡性腫瘤中高表達(dá)。HUMPHRIES等［7］研究表明TAp63基因在慢性粒細(xì)胞白血?。–ML）及B細(xì)胞淋巴瘤中均高表達(dá)。TAp63基因同樣在濾泡性淋巴瘤（FL）、彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤（DLBCL）、非霍奇金淋巴瘤（NHL）中高表達(dá)［8-11］。（2）研究發(fā)現(xiàn)在甲狀腺癌的發(fā)病機(jī)制中，TAp63基因可占據(jù)DNA中p53應(yīng)答元件的結(jié)合位點(diǎn)，從而阻止具有更多轉(zhuǎn)錄活性的p53基因家族成員與其結(jié)合，提示在甲狀腺癌中TAp63基因通過抑制p53家族基因的功能而起到致癌基因的作用［12］。

急性白血病作為兒童惡性腫瘤，發(fā)病率較高，病死率更是占兒童惡性腫瘤的第一位，其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜。LANTER等［13］研究發(fā)現(xiàn)：CD74激活核因子（NK）-κB家族，上調(diào)TAp63基因表達(dá)，其通過上調(diào)Bcl-2 mRNA進(jìn)而上調(diào)Bcl-2蛋白質(zhì)的表達(dá)，最終達(dá)到抗凋亡的作用，同時(shí)LANTER等［13］指出CD74/NK-κB/TAp63是一種細(xì)胞抗凋亡途徑。BINSKY等［5］發(fā)現(xiàn)：TAp63基因通過上調(diào)VLA-4基因的表達(dá)，同時(shí)與CD74共同抑制CLL細(xì)胞凋亡，并且促進(jìn)其轉(zhuǎn)移至骨髓中，為白血病細(xì)胞提供生存環(huán)境。

本研究中急性白血病組患兒TAp63基因陽性表達(dá)率為82.7%，TAp63 mRNA相對(duì)表達(dá)量為（0.61±0.19）；對(duì)照組患兒TAp63基因陽性表達(dá)0例，提示TAp63基因可能在細(xì)胞生長(zhǎng)周期中起到抑制凋亡作用，延長(zhǎng)了腫瘤細(xì)胞的生存時(shí)間，使腫瘤細(xì)胞惡性增殖，兒童急性白血病的發(fā)生可能與TAp63基因的高表達(dá)有關(guān)。本研究顯示TAp63基因在ALL及ANLL患兒均有表達(dá)，同時(shí)ALL患兒TAp63 mRNA相對(duì)表達(dá)量較ANLL患兒升高，這與本課題組既往研究結(jié)果［2］一致。同時(shí)，本研究結(jié)果證明TAp63基因陽性表達(dá)率、TAp63 mRNA相對(duì)表達(dá)量尤其在B-ALL患兒中高表達(dá)，可能影響正常細(xì)胞的增殖及凋亡，并且參與了惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，這進(jìn)一步提示TAp63基因在血液系統(tǒng)惡性腫瘤的發(fā)生與發(fā)展中扮演著致癌基因的角色，而不是抑癌基因的角色。

本研究結(jié)果顯示，復(fù)發(fā)患兒TAp63 mRNA相對(duì)表達(dá)量較初發(fā)患兒升高，高危型初發(fā)患兒TAp63 mRNA相對(duì)表達(dá)量較低危型初發(fā)患兒升高，說明TAp63 mRNA高表達(dá)是兒童急性白血病復(fù)發(fā)的高危因素。未緩解患兒TAp63 mRNA相對(duì)表達(dá)量較完全緩解患兒升高，同時(shí)經(jīng)推薦化療方案治療后，復(fù)發(fā)患兒效果欠佳，緩解率低。TAp63 mRNA相對(duì)表達(dá)量高的患兒化療療效更差，在臨床治療前如果對(duì)急性白血病患兒進(jìn)行TAp63 mRNA表達(dá)水平檢測(cè)，可能對(duì)其化療療效有一定的預(yù)測(cè)作用。TAp63基因的表達(dá)還與腫瘤的分化程度及預(yù)后相關(guān)。FUKUSHIMA等［14］發(fā)現(xiàn)，在FL中，TAp63基因陽性表達(dá)率隨著病理分級(jí)的增加而增加。左學(xué)蘭等［15］研究發(fā)現(xiàn)，在B細(xì)胞淋巴瘤中TAp63基因與凋亡指數(shù)（AI）和增殖指數(shù)（PI）呈正相關(guān)。

總之，TAp63基因可能通過促進(jìn)增殖、抑制凋亡等途徑參與兒童急性白血病尤其是兒童B-ALL的發(fā)生、發(fā)展，并與預(yù)后相關(guān)。目前已經(jīng)有一些促進(jìn)凋亡及抑制細(xì)胞增殖的靶向治療藥物在臨床應(yīng)用，對(duì)于兒童急性白血病的控制有一定療效，本研究旨在為兒童急性白血病的治療提供新的、更多的基因治療靶點(diǎn)，TAp63基因就可能作為兒童急性白血病新的治療靶點(diǎn)之一。

作者貢獻(xiàn)：潘陽瓊、陳豪進(jìn)行文章的構(gòu)思與設(shè)計(jì)，研究的實(shí)施與可行性分析，數(shù)據(jù)收集、整理，統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，結(jié)果的分析與解釋，撰寫論文，進(jìn)行論文的修訂；宋春蘭負(fù)責(zé)文章的質(zhì)量控制及審校；成怡冰對(duì)文章整體負(fù)責(zé)，監(jiān)督管理。

本文無利益沖突。

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