丁苯酞通過激活VEGF/VEGFR2-Notch1/Dll4信號促進HUVECs形成血管*

楊 毅，官俏兵，郭 麗，張曉玲，韓晨陽

(嘉興市第二醫(yī)院， 浙江 嘉興 314001)

缺血性腦卒中是一種急性腦缺血缺氧性疾病，可在短時間造成腦組織中血管閉塞，神經(jīng)細胞大量死亡，且預后較差，致死致殘率較高[1]。目前臨床中對于急性缺血性卒中的治療主要有急性期的溶栓治療和保守藥物治療。丁苯酞(DL-3-n-butylphthalidle，NBP)是從芹菜中提取的一種單體藥物?；A實驗證明丁苯酞可以有效抑制急性缺血性卒中腦損傷的多個病理環(huán)節(jié)，在缺血性腦病中有著廣泛的應用。近年來的研究發(fā)現(xiàn)丁苯酞還可以縮小梗死的病灶，其作用和微循環(huán)的改善有關[2-3]。對于卒中患者而言，側(cè)支血管的形成與開通無疑是有利于預后的，所以本研究著重研究丁苯酞在缺血缺氧(hypoxia and ischemia，H/I)條件下誘導人臍靜脈內(nèi)皮細胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)形成血管的體外實驗，并探索其機制。

材 料 和 方 法

1 細胞和試劑

丁苯酞標準品購于中檢所，批號101035，純度99%；人臍靜脈內(nèi)皮細胞購于武漢普諾賽生物科技有限公司(批號CL0122)；F12K完全培養(yǎng)基與無血清培養(yǎng)基購于武漢普諾賽生物科技有限公司(批號PM150910和PM150910B)；CCK-8試劑盒(批號AR1160)、 血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)的ELISA試劑盒(批號EK0539)和BCA蛋白定量試劑盒(批號0146)購于博士德生物技術有限公司；Matrigel購于BD公司(批號356234)；抗VEGF受體2(VEGF receptor 2, VEGFR2)、Notch1和Delta樣配體4(Delta-like ligand 4,Dll4)的I抗及HRP標記的II抗購于Abcam(批號5473、65297和7280)；cDNA試劑盒購于凱基生物技術有限公司(批號KGA1311)；實時定量PCR試劑盒/SYBR Green Real-time PCR Master Mix購于SinoBio(批號E090);總RNA提取試劑盒購于BioTek(批號RP2041)。

2 方法

2.1細胞模型的構建及分組 HUVECs使用含10% 胎牛血清的F12K完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，待長至80%融合時消化后分組培養(yǎng)。將HUVECs分為正常對照(control)組、H/I組、NBP高劑量(H/I+NBPhigh)組和NBP低劑量(H/I+NBPlow)組。Control組使用F12K完全培養(yǎng)基進行常規(guī)培養(yǎng)；H/I組和H/I+NBPhigh組和H/I+NBPlow組的3組細胞使用無血清的F12K培養(yǎng)基并置于缺氧罐中，氣體使用氮氣置換后于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；H/I+NBPhigh組使用50 μmol/L終濃度的丁苯酞干預；H/I+NBPlow組使用10 μmol/L終濃度的丁苯酞干預。

2.2CCK-8法檢測各組細胞活力 在培養(yǎng)后6、12、24和48 h 4個時點分別檢測細胞的活力。在每孔中加入10 μL的CCK-8溶液，將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱中孵育1～4 h，用酶標儀測定在450 nm處的吸光度(A)值，同時設置空白對照。細胞活力(%)=(A實驗組-A空白對照)/(A對照組-A空白對照)×100%

2.3細胞劃痕實驗檢測HUVECs的遷移能力 將對數(shù)期的細胞接種在6孔板中，使其成為單層細胞，棄去常規(guī)培養(yǎng)基后用10 μL的移液槍在單層細胞上劃“一”字劃痕，PBS清洗3次，棄去懸浮的細胞后，換上含有丁苯酞的培養(yǎng)基培養(yǎng)。在鏡下觀察細胞遷移的程度，利用ImageJ軟件進行實驗前和實驗后細胞遷移率距離(S)測定和遷移率的計算。遷移率(%)=(1-S實驗后/S實驗前)×100%

2.4HUVECs體外形成血管的能力檢測 實驗前將融化的Matrigel置于冰上，在ibidi血管生成載玻片上每孔加入10 μL的Matrigel，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30 min待膠體凝結(jié)后每孔加入懸浮細胞1×104個左右，鏡下觀察細胞貼壁后，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，鏡下觀察成管情況，使用IPP 6.0圖像軟件測定血管總長度，鏡下的覆蓋面積，成環(huán)數(shù)以及節(jié)點，并統(tǒng)計分析。

2.5ELISA法檢測培養(yǎng)基中VEGF的表達水平 取培養(yǎng)后的培養(yǎng)基，經(jīng)過BCA蛋白定量后，參照ELISA試劑盒說明進行VEGF的測定。

2.6Western blot法檢測VEGFR2、Notch1和Dll4的表達水平 收集細胞后棄去培養(yǎng)基，細胞用PBS洗2～3次后加入細胞裂解液，冰上裂解0.5 h，提取總蛋白，經(jīng)過BCA蛋白定量后，調(diào)整各組蛋白濃度后經(jīng)過SDS-PAGE、轉(zhuǎn)膜、孵育、顯色后在Quantity One軟件下進行灰度統(tǒng)計。

2.7qPCR檢測VEGF、VEGFR2、Notch1和Dll4的mRNA表達水平 按照TRIzol試劑盒操作，提取細胞中總RNA，紫外分光光度法檢測總濃度，定量后按照試劑盒方法進行反轉(zhuǎn)錄，得到的cRNA在-20 ℃保存，最后利用qPCR檢測各個mRNA的表達。每個樣本設置3個復孔，計算平均Ct值，設置陰性對照。采用2-ΔΔCt法計算拷貝數(shù)，并且以β-actin為內(nèi)參照。引物序列見表1。

3 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 17.0進行統(tǒng)計學處理。實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，對組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，并用Bonferoni校正的t檢驗進行組間兩兩比較。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

表1 qPCR實驗的引物序列Table 1. The primer sequences for qPCR

F: forward; R: reverse.

結(jié) 果

1 缺血缺氧條件下丁苯酞對HUVECs活力的影響

H/I條件會導致HUVECs凋亡，隨著培養(yǎng)時間的延長，HUVECs的活力下降，而丁苯酞干預后細胞活力顯著升高，每個時點與H/I組比較差異均有統(tǒng)計學顯著性(P<0.05)，但在24 h和48 h時H/I組以及H/I+NBPhigh組和H/I+NBPlow組的細胞相對活力均低于50%，12 h時3組細胞活力較好，所有選擇干預12 h的實驗時間進行后續(xù)實驗。細胞相對活力見圖1。

Figure 1. The changes of the cell viability. Mean±SD.n=5.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsH/I group.

圖1細胞活力的變化

2 缺血缺氧條件下丁苯酞對HUVECs遷移能力的影響

培養(yǎng)12 h，H/I組和control組的遷移能力無顯著差異，而丁苯酞干預后HUVECs的遷移能力顯著提高，與H/I組和control組相比差異均有統(tǒng)計學顯著性(P<0.05)，見圖2。

Figure 2. The results of cell migration capacity. A: control group; B: H/I group; C: H/I+NBPlowgroup; D: H/I+NBPhighgroup. Mean±SD.n=5.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsH/I group.

圖2細胞遷移能力的變化

3 缺血缺氧條件下HUVECs體外血管形成能力的比較

培養(yǎng)12 h，鏡下觀察發(fā)現(xiàn)control組和H/I組細胞未見血管形成但是有成管趨勢，說明缺血缺氧的培養(yǎng)條件可以促進HUVECs形成管腔，但是作用微弱;丁苯酞干預后，H/I+NBPlow和H/I+NBPhigh的管腔長度、鏡下成環(huán)數(shù)、成環(huán)節(jié)點和鏡下面積均高于control組和H/I組(P<0.05)，見圖3。

Figure 3. The results ofinvitroangiogenesis assay. A: control group; B: H/I group; C: H/I+NBPlowgroup; D: H/I+NBPhighgroup. Mean±SD.n=5.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsH/I group.

圖3細胞體外成管能力結(jié)果

4 缺血缺氧條件下HUVECs分泌VEGF水平的比較

H/I條件 VEGF的表達顯著高于control組(P<0.05)，說明缺血缺氧環(huán)境可以誘導VEGF的產(chǎn)生;而丁苯酞干預后，VEGF的表達顯著上調(diào)，與control組和H/I組相比差異具有統(tǒng)計學顯著性(P<0.05)，見圖4。

Figure 4. The expression of VEGF in the HUVECs under the conditions of H/I. Mean±SD.n=5.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsH/I group.

圖4缺血缺氧條件下VEGF的表達水平

5 缺血缺氧條件下丁苯酞對VEGFR2、Notch1及Dll4蛋白表達的影響

H/I條件下VEGF2和Dll4蛋白的表達相比對照組顯著增高(P<0.05)，而Notch1蛋白表達低于對照組，但差異無統(tǒng)計學顯著性，說明缺血缺氧可以誘導該信號通路的激活；而丁苯酞干預后，VEGFR2、Notch1和Dll4的表達水平顯著高于模型組和對照組(P<0.05)，見圖5。

6 缺血缺氧條件下丁苯酞對VEGF、VEGFR2、Notch1和Dll4 mRNA表達水平的影響

H/I條件下模型組的VEGF、VEGFR2、Notch1和Dll4的mRNA表達顯著高于對照組(P<0.05)；而丁苯酞干預后，VEGF、VEGFR2、Notch1和Dll4的mRNA表達相比模型組和對照組顯著增高(P<0.05)，見圖6。

討 論

丁苯酞是從芹菜中提取的一種有效成分，可以分為左旋體和右旋體，臨床常用消旋體[4]。研究發(fā)現(xiàn)丁苯酞具有保護神經(jīng)細胞、增加腦缺血區(qū)血流量、改善腦缺血組織的微循環(huán)和全腦缺血后的能量代謝和抑制炎癥反應等作用[5]。同時還可以抗驚厥、抗癲癇，涉及腦缺血病理的多個環(huán)節(jié)和靶點[6]。在改善腦微循環(huán)的研究中提出了腦微循環(huán)的障礙可以造成腦血流量降低，繼發(fā)引起能量代謝失調(diào)，導致腦組織壞死、神經(jīng)功能缺損及炎癥反應發(fā)生。研究還表明，丁苯酞預防及治療性的給藥可以增加MCAO后腦微動脈管徑和血流速度，改善軟腦膜的微循環(huán)[7]。臨床研究發(fā)現(xiàn)丁苯酞可以促進側(cè)支循環(huán)的建立，起到改善微循環(huán)的作用，減少梗死后出血現(xiàn)象。

Figure 5. The effect of NBP on VEGF2-Notch1/Dll4 signal expression under H/I conditions. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsH/I group.

圖5丁苯酞促進缺血缺氧下VEGF2-Notch1/Dll4信號的表達

Figure 6. The mRNA expression of VEGF, VEGFR2, Notch1 and Dll4 in the HUVECs with different treatments. Mean±SD.n=5.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsH/I group.

圖6丁苯酞促進缺血缺氧下VEGF、VEGFR2、Notch1和Dll4的mRNA表達

側(cè)支循環(huán)的開放有賴于側(cè)支血管的形成與開通，而血管形成是一個及其復雜的過程，VEGF是目前公認的在血管再生過程全程發(fā)揮作用的一種生長因子，最早在1983年被提出，總共由8個外顯子和7個內(nèi)含子組成[8]，VEGF主要是通過激動VEGF受體而發(fā)揮作用的。VEGFR有3種亞型，分別是VEGFR1、VEGFR2和VEGFR3，它們均屬于酪氨酸激酶受體家族，在細胞膜外大約有750個氨基酸殘基[9]。在血管新生的過程中，VEGF與VEGFR2結(jié)合后激活下游信號，促進血管內(nèi)皮細胞上的整合素與配體分離，在局部血管基底膜分解后，內(nèi)皮細胞在局部可以增殖并向外遷移[10]，此時VEGF可以介導Notch1/Dll4信號促進內(nèi)皮細胞分化為頂端細胞逐漸形成血管芽[11-12]，頂端細胞在VEGF的作用下產(chǎn)生偽足結(jié)構，有利于遷移，黏附及微血管網(wǎng)絡的生成。可以說VEGF/VEGFR2-Notch1在血管的新生中扮演著十分重要的角色。一般的血管新生需要通過此通路。

本研究著重研究丁苯酞對于VEGF/VEGFR2-Notch1/Dll4信號激活與血管新生的作用。缺血性腦卒中中由于缺血缺氧的發(fā)生會導致神經(jīng)細胞以及血管內(nèi)皮細胞的凋亡，造成不可逆的損傷，所以臨床治療中常常在短時間中開通閉塞血管，挽救神經(jīng)細胞和內(nèi)皮細胞。本研究中發(fā)現(xiàn)，模擬缺血缺氧的條件下，丁苯酞可以促進HUVECs存活。雖然缺血缺氧條件可以促進HUVECs體外形成血管但是此種趨勢不明顯，而丁苯酞可以在此環(huán)境中顯著促進HUVECs體外成管，從血管形成中管腔長度、節(jié)點、管腔面積等均顯著優(yōu)于對照組和H/I組，由于VEGF是VEGFR2受體激活的關鍵信號因子，是促進血管形成的起始關鍵細胞因子，從實驗結(jié)果來看，丁苯酞在缺血缺氧環(huán)境中誘導VEGF的分泌，激活下游的VEGFR2受體，啟動血管生成的信號通路，同時VEGF還可以誘導Notch/Dll4信號的激活，由于Notch/Dll4信號與HUVECs的遷移和血管芽形成相關，這與細胞遷移實驗結(jié)果相一致。缺血性腦卒中的預后與側(cè)支循環(huán)的開放是密切相關的，而側(cè)支循環(huán)的開放依賴于微血管的形成和延伸，一般微血管的形成主要經(jīng)過血管內(nèi)皮細胞的募集、管腔的形成以及基底細胞的連接而成，在這整個過程中都需要VEGF的參與，而本研究也發(fā)現(xiàn)，體外管腔形成過程中，丁苯酞可以提高VEGF表達來同時激活VEGFR2和Notch信號，這樣的作用無疑是血管形成的關鍵，過往研究發(fā)現(xiàn)[13]，胚胎發(fā)育中VEGF的缺失可以造成血管形成障礙，使用Notch信號激活劑可以部分恢復動脈內(nèi)皮的細胞標記，這提示Notch是VEGF的下游信號，也和本文的研究結(jié)果基本一致。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)缺血缺氧條件下，丁苯酞可以通過激活VEGF/VEGFR2-Notch1/Dll4信號促進HUVECs的體外成管能力，這為丁苯酞的臨床應用提供了支持，也揭示了丁苯酞治療缺血性腦卒中的機制。

[參 考 文 獻]

[1] 張東圓， 李 明， 王正則， 等. 缺氧誘導因子-1α在缺血性腦卒中模型中介導神經(jīng)干-祖細胞作用機制的研究進展[J]. 中國康復理論與實踐, 2017, 23(3):319-322.

[2] 胡 浩. 丁苯酞軟膠囊對改善血管性癡呆患者認知功能的療效及作用機制分析[J]. 中國實用神經(jīng)疾病雜志, 2017, 20(1):98-99.

[3] 孔起良， 劉 娟， 楊 震， 等. 早期使用丁苯酞注射液治療基底節(jié)區(qū)腦梗死對側(cè)支循環(huán)建立及神經(jīng)功能的影響[J]. 臨床神經(jīng)病學雜志, 2016, 29(4):293-295.

[4] Yin JT, Zhang HL, Yan X. A comparison of neuroprotective effects of DL-NBP on SOD1G93A mice when treatment started at pre-symptoms or late-symptoms[J]. J Apoplexy Nerv Dis, 2012, 29(11):971-973.

[5] Zhao W, Xu S, Peng Y, et al. Potassium 2-(1-hydroxypentyl)-benzoate improves learning and memory deficits in chronic cerebral hypoperfused rats[J]. Neurosci Lett, 2013, 541:155-160.

[6] Wei W, Zhang W, Huang Y, et al. The therapeutic effect of DL-3-n-butylphthalide in rats with chronic cerebral hypoperfusion through downregulation of amyloid precursor protein and matrix metalloproteinase-2[J]. J Int Med Res, 2012, 40(3):967-975.

[7] Chong Z, Feng Y. Effects ofdl-3-n-butylphthalide on arachidonic acid release and phospholipase A2mRNA expression in cerebral cortex after middle cerebral artery occlusion in rats[J]. Acta Pharm Sin, 2000, 35(8):561-565.

[8] Cao D, Hou M, Guan YS, et al. Expression of HIF-1α and VEGF in colorectal cancer: association with clinical outcomes and prognostic implications[J]. BMC Cancer, 2009, 9:432.

[9] Gao DC, Nolan DJ, Mellick AS, et al. Endothelial progenitor cells control the angiogenic switch in mouse lung metastasis[J]. Science, 2008, 319(5860):195-198.

[10] Zhao T, Zhao W, Meng W, et al. VEGF-C/VEGFR-3 pathway promotes myocyte hypertrophy and survival in the infracted myocardium[J]．Am J Transl Res, 2015, 7(4):697-709.

[11] Hayashi H, Kume T. Foxc transcription factors directly regulate Dll4 and Hey2 expression by interacting with the VEGF-Notch signaling pathways in endothelial cells[J]. PLoS One, 2008, 3(6):e2401.

[12] 朱震寒， 齊 潔. 依達拉奉通過microRNA-25抑制高糖誘導的SH-SY5Y細胞凋亡[J]. 中國病理生理雜志, 2017, 33(1):92-97.

[13] Wang SH, Yang WK, Lee JD. Increased expression of the sonic hedgehog and vascular endothelial growth factor with co-localization in varicocele veins[J]. Phlebology, 2017, 32(2):115-119.