川陳皮素對非酒精性脂肪肝細胞的保護作用和lncLSTR的調(diào)控機制

汪 嬌，蔣 鵬，周建偉△

(1西南醫(yī)科大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院， 四川 瀘州 646000; 2成都市青羊區(qū)人民醫(yī)院全科， 四川 成都 610031)

非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver di-sease，NAFLD)是指除了酒精和其它明確損傷因素以外的，由于脂肪過量沉積在肝臟時的臨床病理綜合征[1-3]。NAFLD通常由肝臟脂質(zhì)合成和脂質(zhì)氧化紊亂引起，其中游離脂肪酸(free fatty acid，F(xiàn)FA)在肝細胞中的蓄積具有關(guān)鍵作用。近年研究表明，一些傳統(tǒng)中藥中的天然成分具有調(diào)節(jié)血脂和抗氧化等作用，其中川陳皮素(nobiletin)提取自中藥陳皮，對多種慢性疾病有良好的防治作用[4-5]，但其對NAFLD的治療作用報道較少。

長鏈非編碼RNA(long noncoding RNA，lncRNA)是一類轉(zhuǎn)錄本長度超過200 nt的單鏈RNA分子，因為缺乏蛋白質(zhì)編碼功能，以往的研究中被認為是“垃圾基因”，最近研究表明，lncRNA參與了機體多種生物過程[6-8]，其中，lncLSTR(liver-specific triglyceride regulator)參與了肝臟脂質(zhì)代謝調(diào)控[2]。本研究擬采用離體細胞模型來研究川陳皮素對游離脂肪酸棕櫚酸(palmitic acid，PA)[9]誘導(dǎo)的肝細胞脂質(zhì)沉積的作用及l(fā)ncLSTR可能的調(diào)控機制。

材 料 和 方 法

1 材料

肝細胞AML12購自中科院上海細胞所。PA和川陳皮素購自Sigma；反轉(zhuǎn)錄試劑盒和實時熒光定量PCR試劑均購自寶生物工程(大連)有限公司。引物序列通過PrimerBank網(wǎng)站在線獲得，PubMed網(wǎng)站進行BLAST驗證后由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

2 方法

2.1細胞培養(yǎng)與處理 細胞用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)。培養(yǎng)瓶放置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中，細胞生長至鋪滿瓶底80%左右時消化、傳代。

2.2PA脂性培養(yǎng)基配制 根據(jù)文獻[10]，采用0.2 mmol/L的PA誘導(dǎo)肝細胞發(fā)生脂質(zhì)沉積。PA脂性培養(yǎng)基的配制主要步驟為：將PA粉末加入濃度為0.01 mol/L的NaOH溶液中，置70 ℃水浴30 min至PA完全溶解，配制成20 mmol/L的PA溶液；配制30%牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)溶液，置55 ℃水浴30 min；取配置好的PA溶液200 μL與330 μL的BSA溶液混勻，加入20 mL的1640 RPMI-培養(yǎng)基，即配成終濃度為0.2 mmol/L的PA脂性培養(yǎng)基。

2.3油紅O染色檢測肝細胞脂質(zhì)沉積 將細胞接種于6孔板，對照(control)組細胞不做任何干預(yù)；PA組細胞加入0.2 mmol/L的PA培養(yǎng)24 h；預(yù)保護(protection)組分別加入1 mg/L、5 mg/L、15 mg/L和50 mg/L的川陳皮素預(yù)保護細胞2 h后，再加入0.2 mmol/L的PA刺激細胞，共同培養(yǎng)24 h。24 h后吸棄各組細胞培養(yǎng)基，用PBS沖洗2次，10%甲醛固定15 min，油紅O染色30 min，60%異丙醇分化，蘇木素復(fù)染胞核，顯微鏡(×400)觀察及采集圖像。

2.4qPCR檢測基因表達 將細胞接種于6孔板，實驗分為3個組，對照組、PA組和預(yù)保護組(50 mg/L川陳皮素)。每組設(shè)3個復(fù)孔，重復(fù)3次。各組細胞用TRIzol法提取細胞總mRNA，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒轉(zhuǎn)為cDNA。檢測RNA濃度、純度和完整性后逆轉(zhuǎn)錄成cRNA。通過qPCR擴增檢測目的基因的表達，反應(yīng)體系為20 μL。qPCR反應(yīng)條件為:預(yù)變性95 ℃ 3 min;變性95 ℃ 10 s、退火60 ℃ 30 s、返回95 ℃ 10 s，擴增39個循環(huán)；65℃～95 ℃，每0.5 ℃ 5 s梯度遞增；終止反應(yīng)。引物序列見表1。熒光定量PCR系統(tǒng)為Applied Biosystems?7300，數(shù)據(jù)采用StepOne Software v2.3分析。

2.5Western blot檢測蛋白表達量 3組細胞蛋白用裂解緩沖液提取。使用BCA蛋白測定試劑盒定量蛋白濃度。蛋白樣品用5% SDS-PAGE分離，然后電轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜上。將膜與多克隆兔抗鼠 I 抗(1 ∶1 000)在4 ℃下孵育12 h，隨后與辣根過氧化物酶綴合的山羊抗兔II抗在室溫1 h。采用凝膠成像儀采集圖像。使用Quantity One對蛋白質(zhì)條帶強度進行定量，內(nèi)參照選用β-actin。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用軟件SPSS 19.0進行統(tǒng)計分析。數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差(mean±SD)表示。3組數(shù)據(jù)的差異采用單因素方差分析并用Bonferroni校正的t檢驗對各組均數(shù)進行兩兩比較。率或構(gòu)成比比較采用卡方檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 肝細胞脂質(zhì)沉積情況

油紅O染色結(jié)果示，0.2 mmol/L的PA處理肝細胞24 h后，細胞脂質(zhì)沉積明顯；采用1 mg/L、5 mg/L和15 mg/L的川陳皮素預(yù)保護后再用PA處理細胞，細胞脂質(zhì)沉積無明顯變化；采用50 mg/L的川陳皮素預(yù)保護后用PA處理細胞，細胞內(nèi)脂質(zhì)沉積明顯減弱，見圖1。因此后續(xù)實驗采用50 mg/L的川陳皮素預(yù)保護細胞。

表1 qPCR引物序列Table 1. The sequences of the primers for qPCR

Figure 1. The lipid deposition in hepatocytes detected by Oil red O staining (×400).

圖1各組肝細胞油紅O染色情況

2 肝脂質(zhì)代謝相關(guān)因子的mRNA表達

為了確定川陳皮素減弱PA誘導(dǎo)的肝脂質(zhì)沉積的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，本研究檢測了肝臟脂質(zhì)合成和氧化相關(guān)因子的mRNA表達。相對于對照組，PA組的Apoc2表達明顯下調(diào)(P<0.01)，50 mg/L的川陳皮素預(yù)保護對其下調(diào)有抑制作用(P<0.01)，見圖2。

Figure 2. The mRNA expression of lipogenesis-and lipid oxidation-related factors in hepatocytes among groups detected by qPCR. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsPA group.

圖2各組細胞脂質(zhì)合成和脂質(zhì)氧化相關(guān)因子的mRNA表達

3 lncLSTR和Apoc2蛋白的表達

相對于對照組，PA組lncLSTR表達明顯升高(P<0.01)，預(yù)保護組lncLSTR表達比PA組降低(P<0.01)，見圖3A。相對于對照組，PA組Apoc2蛋白表達明顯降低(P<0.01)，預(yù)保護組Apoc2蛋白表達比PA組升高(P<0.01),見圖3B。

Figure 3. The expression of lncLSTR (A) and Apoc2 protein (B) in the hepatocytes among groups. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsPA group.

圖33組細胞lncLSTR和Apoc2蛋白的表達

4 Apoc2蛋白與lncLSTR表達相關(guān)性分析

采用Pearson相關(guān)分析評估Apoc2蛋白與lncLSTR的相關(guān)性，結(jié)果顯示，PA組Apoc2蛋白與lncLSTR的表達呈負相關(guān)，具有統(tǒng)計學(xué)意義(R2=0.717 9，P<0.01),見圖4A；預(yù)保護組Apoc2蛋白與lncLSTR表達呈負相關(guān)，具有統(tǒng)計學(xué)意義(R2=0.525 3，P<0.05),見圖4B。

討 論

NAFLD是影響全球數(shù)百萬人的全球性慢性非傳染性疾病，是慢性肝病的危險因素之一，已成為發(fā)達國家慢性肝病的重要病因。目前廣泛接受“二次打擊”理論來闡述NAFLD發(fā)病和進展的理論：“一次打擊”為細胞內(nèi)脂質(zhì)過度沉積引起的,太多游離脂肪酸經(jīng)β氧化產(chǎn)生能量的同時也會產(chǎn)生多種氧自由基，導(dǎo)致線粒體損傷。脂質(zhì)沉積引起的慢性炎癥反應(yīng)構(gòu)成了“二次打擊”[11-13]。然而肝細胞脂肪沉積發(fā)生的確切機制和治療靶點目前尚缺乏足夠的認識。

祖國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)在NAFLD的治療優(yōu)勢近年來逐漸受到重視，臨床實踐也證實中醫(yī)藥對于NAFLD的治療具有較好的效果。陳皮始見于《神農(nóng)本草經(jīng)》：“橘柚，味辛溫而命名‘橘皮’”?！端幮哉摗酚涊d陳皮具有清痰涎、開胃理氣調(diào)中之功效[14-15]。川陳皮素是從陳皮中提取的一種多甲氧基黃酮類化合物，目前已證實具有抗腫瘤、抗氧化和強心升血壓等藥理學(xué)作用，而且對腸平滑肌有雙向調(diào)節(jié)的作用，并可能對代謝性疾病有一定的防治作用[4-5]，但目前川陳皮素對于NAFLD的治療尚未有報道。本研究通過油紅O染色發(fā)現(xiàn)，50 mg/L的川陳皮素預(yù)處理能顯著降低PA引起的肝細胞脂質(zhì)沉積。肝臟是主要的脂質(zhì)代謝器官，因此本研究檢測了12個肝臟脂質(zhì)合成相關(guān)因子和10個脂質(zhì)氧化相關(guān)因子，結(jié)果顯示PA組Apoc2表達明顯下調(diào)，川陳皮素對其下調(diào)具有明顯抑制作用。Apoc2蛋白屬于載脂蛋白家族[2],能激活脂蛋白脂酶，清除細胞內(nèi)甘油三酯。在本研究中PA誘導(dǎo)Apoc2下調(diào)并導(dǎo)致甘油三酯清除率降低，而川陳皮素預(yù)保護可以抑制這種Apoc2下調(diào)導(dǎo)致的甘油三酯清除率降低。

Figure 4. The correlation analysis of Apoc2 protein and lncLSTR expression in PA group (A) and protection group (B).

圖4Apoc2蛋白與lncLSTR表達量的相關(guān)性分析

lncRNA被定義為長于200 nt的轉(zhuǎn)錄本，但是由于缺乏開放閱讀框而不具備任何編碼蛋白的功能。雖然lncRNA的生理功能在很大程度上是未知的，但是許多l(xiāng)ncRNA在腫瘤、細胞周期和代謝中扮演了重要角色[16-17]。lncRNA可通過影響上游基因啟動子轉(zhuǎn)錄、抑制RNA聚合酶Ⅱ或者介導(dǎo)染色質(zhì)重構(gòu)以及組蛋白修飾、與編碼蛋白基因的轉(zhuǎn)錄本形成互補雙鏈干擾mRNA的剪切等方式調(diào)控生理功能[16]。文獻報道lncLSTR可以調(diào)控Apoc2的表達[2]，本研究lncLSTR發(fā)現(xiàn)PA組的lncLSTR表達上調(diào)，川陳皮素能抑制其上調(diào)。采用Pearson相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)PA組和預(yù)保護組中Apoc2蛋白與lncLSTR的表達均呈負相關(guān)。這些結(jié)果說明lncLSTR的上調(diào)可能直接/間接調(diào)控了Apoc2的表達，而川陳皮素有可能調(diào)節(jié)lncLSTR的表達來抑制PA誘導(dǎo)的肝細胞脂質(zhì)沉積，具體機制將在以后的研究中驗證。

綜上所述，本次研究通過棕櫚酸誘導(dǎo)肝細胞脂質(zhì)沉積建立NAFLD細胞模型，觀察到川陳皮素減輕PA對肝細胞脂質(zhì)沉積的作用。本研究的結(jié)果提示川陳皮素對肝細胞的保護作用主要是通過抑制肝臟中l(wèi)ncLSTR的上調(diào)、進而抑制肝臟Apoc2下調(diào)、增加肝臟甘油三酯清除率來實現(xiàn)的。本研究為探索川陳皮素在治療NAFLD中的應(yīng)用和從中醫(yī)藥的角度尋找NAFLD治療上新的靶點提供了新的實驗證據(jù)。

[參 考 文 獻]

[1] Hwang JT, Shin EJ, Chung MY, et al. Ethanol extract of Allium fistulosum inhibits development of non-alcoholic fatty liver disease[J]. Nutr Res Pract, 2018, 12(2):110-117.

[2] Li P, Ruan X, Yang L, et al. A liver-enriched long non-coding RNA, lncLSTR, regulates systemic lipid metabolism in mice[J]. Cell Metab, 2015, 21(3):455-467.

[3] Agyei-Nkansah A. Mitigating the scourge of non-alcoholic fatty liver disease in Ghana[J]. Ghana Med J, 2017, 51(3):98-100.

[4] 楊 華， 田 萌， 劉喜燕. 川陳皮素對腦梗死大鼠 HIF-1α和VEGF含量及神經(jīng)細胞凋亡的影響與機制[J]. 臨床和實驗醫(yī)學(xué)雜志, 2017, 16(20):1980-1983.

[5] 車 妍， 唐其柱， 張 寧， 等. 川陳皮素對脂毒性心肌病的保護作用機制研究[J]. 中華生物醫(yī)學(xué)工程雜志, 2016, 22(6):439-444.

[6] Chen G, Yu D, Nian X, et al. LncRNA SRA promotes hepatic steatosis through repressing the expression of adipose triglyceride lipase (ATGL)[J]. Sci Rep, 2016, 6:35531.

[7] Zhu X, Wu YB, Zhou J, et al. Upregulation of lncRNA MEG3 promotes hepatic insulin resistance via increasing FoxO1 expression[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2016, 469(2):319-325.

[8] Zhou G, Li C, Feng J, et al. lncRNA UCA1 is a novel regulator in cardiomyocyte hypertrophy through targeting the miR-184/HOXA9 axis[J]. Cardiorenal Med, 2018, 8(2):130-139.

[9] Joshi-Barve S, Barve SS, Amancherla K, et al. Palmitic acid induces production of proinflammatory cytokine interleukin-8 from hepatocytes[J]. Hepatology, 2007, 46(3):823-830.

[10] Akazawa Y, Cazanave S, Mott JL, et al. Palmitoleate attenuates palmitate-induced Bim and PUMA up-regulation and hepatocytes lipoapoptosis[J]. J Hepatol, 2010, 52(4):586-593.

[11] 孫 莉， 宋海燕， 季 光. 非酒精性脂肪肝代謝調(diào)控與炎癥反應(yīng)的共同通路[J]. 中華肝臟病雜志, 2011, 19(5):395-397.

[12] Zhou YY, Zhou XD, Wu SJ, et al. Nonalcoholic fatty liver disease contributes to subclinical atherosclerosis: a systematic review and meta-analysis[J]. Hepatol Commun, 2018, 2(4):376-392.

[13] 楊衛(wèi)利， 王君佩， 崔慶華， 等. 非編碼RNA與肝臟糖脂代謝調(diào)控[J]. 生理科學(xué)進展, 2016, 47(3):194-202.

[14] 李欣然， 王 靜， 余曉燕， 等. 陳皮的研究進展[J]. 中國醫(yī)藥指南, 2016, 14(24):31-32.

[15] 何占坤， 張國梁， 唐 方， 等. 陳皮、藿香不同提取物對胃腸動力障礙大鼠胃腸平滑肌收縮活動及胃腸激素的影響[J]. 天津醫(yī)藥, 2017, 45(11):1175-1179.

[16] Wang YH, Ji J, Wang BC, et al. Tumor-derived exosomal long noncoding RNAs as promising diagnostic biomarkers for prostate cancer[J]. Cell Physiol Biochem, 2018, 46(2):532-545.

[17] 易 紅， 張 政. lncRNA與miRNA相互作用對疾病的影響[J]. 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床, 2016, 36(2):267-271.