冬小麥東農(nóng)冬麥1號miR5049-3p和miR1120a前體與靶基因的克隆及低溫和ABA作用下的表達調(diào)控

彭瞰看，田 宇，楊 寧，呂 巖，趙 虎，宋春華，李海丹，徐慶華，蒼 晶

(東北農(nóng)業(yè)大學生命科學學院植物生理與分子生物學研究室，黑龍江哈爾濱 150030)

糖代謝是整個生物代謝的中心，在植物生長發(fā)育過程中起著重要作用。當植物經(jīng)冷馴化時，可通過可溶性糖的累積提高植物組織的抗寒能力；而可溶性糖累積的途徑之一就是通過糖代謝產(chǎn)生其他物質(zhì)和能源。已有報道認為，糖代謝相關酶響應植物冷脅迫；例如，青檀在低溫脅迫初期，體內(nèi)磷酸果糖激酶活性增強[1]；小麥幼苗受低溫脅迫時，葉綠體果糖-1,6-二磷酸醛縮酶基因表達量上調(diào)[2]；本實驗室前期的研究發(fā)現(xiàn)，冬小麥糖的積累以及糖代謝的關鍵酶基因表達與抗寒能力密切相關[3]。ABA是植物響應各種非生物脅迫的重要因子，低溫下ABA對植物的糖代謝有一定的影響，例如，低溫脅迫下外施ABA的西瓜幼苗葉片可溶性糖含量顯著高于未施ABA的對照植株，并且其抗寒性更強[4]；本實驗室前期的研究也表明，外源 ABA 處理可不同程度地提高冬小麥糖酵解代謝相關酶的活性[5]。而ABA是如何通過調(diào)控糖代謝來應答低溫脅迫的，目前少有報道。

miRNA 是一類在多種真核生物中調(diào)控基因表達的非編碼小RNA。近年來，大量miRNA陸續(xù)在植物中被發(fā)現(xiàn)，并且在非生物脅迫應答過程中起重要作用。研究表明，植物miRNA響應低溫脅迫，如水稻miR319過表達能明顯下調(diào)其靶基因 PCF6和 TCP2的表達量，以此來增強植株對低溫的耐受性[6]；低溫脅迫下擬南芥miR397過表達突變體植株的抗寒性明顯提高，其下游響應冷脅迫的CBF和COR基因的相對表達量顯著高于野生型[7]；本實驗室之前也發(fā)現(xiàn)，在東農(nóng)冬麥1號中有多種miRNA與抗寒性相關[8-9]，且ABA對 miRNA響應低溫脅迫有影響[10]。

東北農(nóng)業(yè)大學培育的冬小麥新品種東農(nóng)冬麥1號是首例能在黑龍江省高寒地區(qū)越冬(返青率85%以上)的強抗寒(可耐-30 ℃低溫)栽培品種[11]。本研究利用生物信息學技術(shù)，從實驗室已有的東農(nóng)冬麥1號的miRNA庫[12]中篩選出有表達差異而且可能與糖代謝相關的miRNAs及其靶基因，并對其表達模式進行分析，以探明miRNA介導糖代謝途徑響應低溫脅迫的可能性，為揭示東農(nóng)冬麥1號強抗寒機制提供新的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

強抗寒性冬小麥品種東農(nóng)冬麥1號，由東北農(nóng)業(yè)大學小麥育種實驗室提供。試驗于2015年9月7日在東北農(nóng)業(yè)大學試驗地進行，完全區(qū)組設計，3次重復，行長2 m，行距0.2 m，10行區(qū)。播種量450?！-2，播深5 cm，常規(guī)管理。

待麥苗長至三葉期，葉面噴施 10 mol·L-1ABA(本實驗室前期試驗所得最適濃度)，噴施量4 m2·L-1，對照組噴施等量蒸餾水。待大田自然降溫，連續(xù)10 d最低溫度平均為5 ℃(對照溫度，2015年10月8日)、0 ℃(2015年10月27日)、-10 ℃(2015年11月23日)和-25 ℃(2016年1月11日)時，隨機選取長勢一致的麥苗，剪取分蘗節(jié)和葉片，液氮速凍，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方 法

1.2.1 miRNAs前體序列的克隆

采用CTAB法提取分蘗節(jié)的基因組DNA，用RNase(康為世紀生物科技有限公司)純化DNA樣品。分別用1120a-T/1120-F和5049-3p-T/5049-3p-F(引物由哈爾濱博士生物技術(shù)有限公司設計合成，見表1)進行PCR，擴增 tae-miR5049-3p和 tae-mi1120a 的前體序列。PCR體系與程序參考2×Taq Plus MasterMix(Dye)(康為世紀生物科技有限公司)說明書，其中循環(huán)數(shù)為30，退火溫度為60 ℃，延伸時間為1 min。凝膠電泳檢測后，在miRNAs上下游引物的5’端分別加入特定序列g(shù)gcttaaU及 ggtttaaU，連接User載體，并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α后篩選陽性克隆，進行測序鑒定。

1.2.2 總RNA的提取與cDNA的合成

采用Trizol(康為世紀生物科技有限公司)法分別提取分蘗節(jié)與葉片的總RNA，利用Mir-X miRNA First Strand Synthesis Kit(寶生物工程(大連)有限公司)及Reverse Transcriptase M-MLV(RNase H-)，進行 cDNA第一鏈的合成。引物設計與合成均由哈爾濱博士生物技術(shù)有限公司完成。

1.2.3 表達模式分析

運用加尾法設計miRNAs成熟體序列的特異引物(即miRNA成熟體序列克隆引物，引物序列見表1)，利用Mir-X miRNA qRT-PCR SYBR Kit(寶生物工程(大連)有限公司)對小麥分蘗節(jié)和葉片中mi5049-3P和miR1120a及其靶基因的表達量進行實時熒光定量反轉(zhuǎn)錄PCR(qRT-PCR)分析，反應體系與程序參考說明書。其中miRNAs的表達量分析選用U6作為內(nèi)參基因，靶基因表達量分析選用Actin作為內(nèi)參基因。每個樣品每次反應重復3次，以3次生物學重復的試驗結(jié)果用2-ΔΔCT法進行分析[13]。

1.2.4 生物信息學分析

利用RNAfold WebSever(http://rna.tbi.univie.ac.at/cgi-bin/RNAfold.cgi) 進行 miRNA前體二級結(jié)構(gòu)的預測。利用WebLOGO(http://weblogo.berkeley.edu/logo.cgi) 對miRNAs成熟體序列的堿基保守性進行分析。下載小麥miR5049-3p和miR1120a前體序列上游2 000 bp作為啟動子區(qū)，利用PlantCARE(http://bioinformatics .psb.ugent.be/webtools/ plantcare/html/) 預測miRNAs前體的順式作用元件。

2 結(jié)果與分析

2.1 miRNAs前體序列與成熟體序列分析

根據(jù)miRbase(http://www.mirbase.org/)及Wheat URGI(https://wheat-urgi.versailles.inra.fr/)得到了miR5049-3p和miR1120a的前體及成熟體序列。以東農(nóng)冬麥1號的基因組DNA為模板，采用引物 5049-3pF/5049-3pR和1120aF/1120aR(表1)進行PCR 擴增，結(jié)果二者均在170 bp左右有一條特異性條帶(圖1A)，測序結(jié)果表明二者均與數(shù)據(jù)庫中小麥 pre-miR5049-3p和 pre-miR1120a前體序列大小(分別為114 bp和120 bp)一致。利用RNAfold WebSever預測miRNA前體的二級結(jié)構(gòu)，表明 pre-miRNA5049-3p和 pre-miRNA1120a均能形成穩(wěn)定的莖環(huán)結(jié)構(gòu)(圖2)。

表1 PCR所用引物序列Table 1 List of PCR primer sequences

圖1 miR5049-3p(A1)和miR1120a(A2)小麥前體及miR5049-3p(B1) 和miR1120a(B2)成熟體的PCR擴增產(chǎn)物Fig.1 PCR products of wheat precursor genes miR5049-3p(A1) and miR1120a(A2) and wheat mature genes miR5049-3p(B1) and miR1120a(B2)

以東農(nóng)冬麥1號的cDNA 為模板，分別用特異性引物5049-3pF1/mRQ 3′ Primer和1120aF1/mRQ 3′ Primer(由Mir-X miRNA qRT-PCR SYBR Kit提供)(表1)對成熟體序列進行擴增，擴增產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測兩條miRNA均在100 bp處有一條特異性條帶(圖1B)，這與預測大小一致，可用于后期的表達量分析。對miR5049-3p和miR1120a的成熟體序列進行堿基保守性分析，結(jié)果表明，其保守性較差，其中，miR5049-3p只在第1、2、11、16、17和18位的堿基保守性相對較高(圖3A)，其他堿基都不保守；miR1120a只在第4、7、11、16、22和23位的堿基保守性相對較高(圖3B)，其他堿基都不保守。比較而言，miR1120a的堿基保守性稍高于miR5049-3p。

圖2 miR5049-3p和miR1120a前體的二級結(jié)構(gòu)Fig.2 Secondary structure of miR5049-3p and miR1120a precursors

圖3 miR5049-3p(A)和miR1120a(B)成熟體序列堿基保守性分析Fig.3 Conservative analysis of nucleotides in mature body of miR5049-3p(A) and miR1120a(B)

圖4 分蘗節(jié)中miR5049-3p、miR1120a 和 6PGL、FBA在不同溫度下的相對表達量Fig.4 Expression of miR5049-3p,miR1120a,6PGL and FBA of tiller node under different temperature

2.2 低溫對miRNAs及其靶基因表達模式的影響

根據(jù)實驗室已有的miRNA及靶基因數(shù)據(jù)庫，分別找到了miR5049-3p和miR1120a的靶基因 6PGL和FBA，采用qRT-PCR 對其表達模式進行了分析，結(jié)果表明，miR5049-3p和miR1120a均能響應低溫脅迫。

從圖4可以看出，在分蘗節(jié)中，隨著溫度降低，miR5049-3p的相對表達量呈先升高后降低的變化規(guī)律，0 ℃時達到峰值，而后持續(xù)降低；而miR1120a的表達量則呈“升-降-升”的變化規(guī)律，在0 ℃時相對表達量最高，-10 ℃、-25 ℃時的表達量也都高于5 ℃(圖4A)。miR5049-3p的靶基因6PGL的相對表達量隨著溫度的降低，先稍有升高，然后降低，-25 ℃時急劇上升；miR1120a的靶基因FBA的相對表達量隨著溫度的降低，在0 ℃時稍有升高，-10 ℃時急劇升高達到峰值，然后又迅速降低，但-25 ℃時仍然明顯高于5 ℃時的相對表達量(圖4B)。

從圖5可知，在葉片中，miR5049-3p的相對表達量呈先升后降的趨勢，-10 ℃時最高，5 ℃時最低；miR1120a則隨著溫度的降低其相對表達量持續(xù)升高。從整體上看 miRNAs的表達量呈現(xiàn)增高的趨勢(圖5A)；靶基因6PGL和FBA的相對表達量正好分別與miR5049-3p和miR1120a呈負向變化，整體呈下降趨勢(圖5B)。這表明miRNAs與其靶基因可能存在負向調(diào)控的關系。

2.3 ABA對miRNAs及其靶基因在低溫下表達模式的影響

在外源ABA處理下，小麥分蘗節(jié)中的miRNAs和其對應的靶基因相對表達量趨勢有明顯的變化。miR5049-3p和miR1120a的相對表達量隨著溫度的降低呈現(xiàn)“升-降-升”的變化規(guī)律，但從整體上看，各溫度下的 miRNAs相對表達量均顯著高于對照(CK，水處理)；而它們靶基因的相對表達量均隨著溫度的降低而降低(6PGL在-25 ℃時稍有增高)，并明顯低于CK(表2)。這說明，ABA可能調(diào)控了miRNAs的表達，從而響應低溫。

圖5 葉片中 miR5049-3p、miR1120a 和 6PGL、FBA不同溫度下的相對表達量Fig.5 Expression of miR5049-3p,miR1120a,6PGL and FBA of leaf under different temperature

2.4 miRNAs前體啟動子區(qū)順式作用元件的預測

miRNAs的表達受啟動子調(diào)控，故運用PlantCARE對小麥miR5049-3p和miR1120a前體啟動子區(qū)的順式作用元件進行預測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)小麥miR5049-3p和miR1120a的前體包含了TATA-box、CAATA-box等基本元件和多種應答元件，它們響應光反應、激素、厭氧和低溫等多種環(huán)境因子，說明這些環(huán)境因子均有可能調(diào)控miR5049-3p和miR1120a的表達(表2)，這與2.2及2.3的結(jié)果相呼應，說明低溫與ABA確實是miR5049-3p和miR1120a表達的影響因子。

3 討 論

近些年，人們對于植物在低溫脅迫下糖代謝的作用有了一定系統(tǒng)的認識[14]。大量研究表明，植物體內(nèi)可溶性糖含量在低溫下會發(fā)生變化[15-18]，抗寒性較強的植物可溶性糖含量會較高，其糖代謝相關酶的活性也會相應變化，然而其具體響應機制卻鮮有報道。本研究從miRNA調(diào)控的角度出發(fā)，初步探究植物糖代謝響應冷脅迫的機制，結(jié)果表明miR5049-3p和miR1120a可能靶向調(diào)控 6PGL和FBA的翻譯或沉默，從而介導小麥的糖代謝來響應低溫脅迫。

6PGL是戊糖磷酸途徑(PPP)中的一種代謝酶，催化水解6-磷酸葡萄酸內(nèi)酯生成6-磷酸葡萄糖酸。已有研究表明，植物幼苗受低溫馴化時PPP途徑效率提高，能增強植物的抗凍性[19]。而該酶在PPP途徑中對應答低溫的作用卻鮮有報道，僅有研究表明6PGL在擬南芥中可影響植株的大小[20]。本研究結(jié)果初步推測，6PGL對東農(nóng)冬麥1號分蘗節(jié)抗寒有著重要作用，5 ℃、0 ℃和-10 ℃時，其分蘗節(jié)中 6PGL基因的表達量變化不大，說明PPP途徑還沒有對寒冷有所響應；-25 ℃時， 6PGL相對表達量急速升高，使PPP途徑增強，一方面通過增加某些中間產(chǎn)物如Ru5P和NADPH等，為植物生物合成提供原料和專一性供體，確保ATP的生成和利用；另一方面，其PPP途徑的代謝終產(chǎn)物6-磷酸葡萄糖的累積也能增強細胞滲透壓，減小寒冷對細胞的傷害。

表2 不同溫度下外源 ABA 處理對小麥分蘗節(jié) miR5049-3p、 miR1120a 及其靶基因 6PGL、 FBA表達量的影響Table 2 Effect of exogenous abscisic acid on the expression of miR5049-3p, miR1120a, 6PGL,and FBA under different temperature

同一列數(shù)據(jù)后的字母不同表示在0.05水平上差異顯著。

Different lower-case letters indicate significant difference at 0.05 level.

表3 miR5049-3p和miR1120a前體啟動子區(qū)游順式作用元件Table 3 Cis-elements upstream in the promoter sequences of miR5049-3p and miR1120a

FBA是生物中非常關鍵的代謝酶，它參與了多個糖代謝途徑。近年的研究表明，植物的FBA與多種非生物脅迫密切相關，低溫、干旱、鹽等多種脅迫都能誘導FBA基因的表達[21-22]。已有報道表明，一些植物中的FBA基因?qū)τ诘蜏孛{迫有響應[23-24]，但小麥FBA基因響應冷脅迫的文獻還很少。本研究的初步結(jié)果表明，5 ℃和0 ℃時FBA的相對表達量變化不大，說明此時FBA還沒有對寒冷作出明顯的應答；-10 ℃時，F(xiàn)BA的相對表達量迅速升高,可能促進多種糖代謝途徑：如糖異生、卡爾文循環(huán)等，一方面利于小麥體內(nèi)糖的累積，另一方面通過糖酵解來加速糖的消耗，糖酵解、PPP等代謝也能產(chǎn)生大量代謝產(chǎn)物和能量以供植株進行次生代謝；而在-25 ℃時，F(xiàn)BA的相對表達量降低，但仍然比5 ℃ 時高，促進果糖-1,6二磷酸裂解的程度減小，減慢糖酵解等消耗糖的代謝，以利于糖持續(xù)積累，增加細胞滲透壓，以減結(jié)冰對東農(nóng)冬麥1號的傷害。本研究表明，F(xiàn)BA在-10 ℃ 開始響應寒脅迫，本實驗室前期的研究結(jié)果也表明-10 ℃是東農(nóng)冬麥1號啟動抗寒機制的關鍵溫度點[25]。

miR5049-3p和miR1120a是小麥的成熟miRNA[26-27]，分別屬于miR5049 和miR1120 基因家族，然而其在小麥中的作用并沒有具體的文獻報道。本研究發(fā)現(xiàn)miR5049-3p和miR1120a是糖代謝的負調(diào)控因子。當東農(nóng)冬麥1號受到低溫脅迫時，分蘗節(jié)中的miR5049-3p和miR1120a因響應環(huán)境低溫而表達降低，從而降低對 6PGL和FBA基因表達的抑制， 6PGL和FBA表達量升高，會增強糖代謝，從而為該品種提供能量及代謝產(chǎn)物，增強其抗寒性。隨著溫度的降低，東農(nóng)冬麥1號葉片中miR5049-3p和miR1120a的相對表達量增高，其靶基因 6PGL和FBA的相對表達量下降，導致糖代謝下降，促使葉片逐漸衰老死亡。

ABA可以作為植物響應冷脅迫的信號分子，外源施加ABA可以通過降低植物呼吸速率，提高糖的累積來增加植物的抗寒性，同時外施ABA也可通過調(diào)控miRNAs的表達(上調(diào)或下調(diào))來調(diào)節(jié)植物的抗寒性。本研究中，外施ABA后，miR5049-3p和miR1120a的相對表達量增高，從而增加了對 6PGL和FBA基因表達的抑制，進而降低東農(nóng)冬麥1號整體糖代謝及呼吸速率，使糖積累，增加滲透壓，從而減小結(jié)冰傷害。本課題組前期的研究表明，不同的miRNA可能調(diào)控同一個靶基因[28]，本研究也發(fā)現(xiàn)外施ABA條件下，-10 ℃時miRNAs的表達量降低，但其靶基因的表達量并沒有上升，這可能是由于ABA引起了其他能夠靶向調(diào)控 6PGL和FBA的 miRNAs的表達。同時，還可以進一步依此研究其他環(huán)境因子條件下miRNAs及其靶基因的表達變化。

綜上，低溫下東農(nóng)冬麥1號的miR5049-3p和miR1120a可能分別負向調(diào)控其靶基因 6PGL和FBA，進而介導糖代謝響應低溫脅迫。ABA可能通過調(diào)控miRNAs而影響其靶基因，進而調(diào)控小麥抗寒性。

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