普通小麥 TaCAT 9基因的克隆與表達(dá)分析

褚瑩瑩,王晨陽,2，陳雨露，康 娟，馬 耕，劉衛(wèi)星,胡陽陽，李莎莎

(1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，河南鄭州 450002； 2.國家小麥工程技術(shù)研究中心，河南鄭州 450002)

氨基酸是植物體內(nèi)氮素存在的主要形式，能夠作為含氮通貨參與到各種代謝途徑中，而這個(gè)過程有賴于氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的運(yùn)輸功能，因此研究氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的功能對(duì)于植物氮代謝的研究具有重要意義[1-2]。植物中的氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白可分為五大超家族，但研究較多的主要有兩個(gè)超家族：一個(gè)是氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白超家族(ATFs)，約有46個(gè)成員，至少又可分為5個(gè)亞家族；另一個(gè)是氨基酸-多胺-膽堿轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白超家族(APCs)，有14個(gè)成員,又分為L型氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(LATs)和陽離子氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(CATs)兩個(gè)亞家族[3-5]。研究表明，除了脯氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，所有的氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白都表現(xiàn)出顯著的底物專一性[6]。許多研究證明氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)具有組織及器官特異性，且受多種因素的影響，如光、線蟲感染、蔗糖、滲透勢、銨鹽、硝酸鹽及谷氨酸等[7-9]。目前對(duì)ATFs超家族的研究較為透徹，而對(duì)APCs超家族的研究相對(duì)較少，本試驗(yàn)的研究對(duì)象CAT9是CATs亞家族中的一員[9]。

對(duì)植物CATs亞家族的研究報(bào)道主要集中在模式植物中，擬南芥CATs亞家族有9個(gè)成員，大都定位于質(zhì)膜或液泡膜上，具有11～14個(gè)推測的跨膜結(jié)構(gòu)域[9-10]。AtCAT1啟動(dòng)子與GUS融合表達(dá)分析顯示，該基因主要高表達(dá)于衰老的葉片，在初生根的根尖及花中也能檢測到少量表達(dá)，猜測該基因可能參與氨基酸向種子的運(yùn)輸[11]。AtCAT2主要定位于液泡膜,可能通過參與氨基酸的跨液泡膜轉(zhuǎn)運(yùn)來調(diào)節(jié)葉片可溶性氨基酸濃度；AtCAT3和AtCAT4分別定位于高爾基體膜和液泡膜，具體功能有待研究[12]。AtCAT5主要在籽粒中表達(dá)，可能在籽粒形成或種子萌發(fā)過程中裝載種柄中的氨基酸，又有研究表明該基因在真葉邊緣部位的表達(dá)量也比較高，可能參與重新吸收葉緣部位滲漏的氨基酸[13-14]。AtCAT6只在根原基、花及種子等作為庫的組織器官中表達(dá)，而且在根部的表達(dá)水平能夠受到根結(jié)線蟲感染的誘導(dǎo)[9]。AtCAT7在正常環(huán)境下的表達(dá)水平非常的低[13]，AtCAT8在根和植株上部的分生組織中有較高的表達(dá)豐度，其功能可能是介導(dǎo)氨基酸特別是谷氨酸和谷氨酰胺向植株幼嫩分生組織分配[14]。研究表明，擬南芥中AtCAT9基因主要定位于囊泡膜上，具有比較廣泛的表達(dá)特性，在大多數(shù)組織器官中都有表達(dá)，可能參與調(diào)控液泡內(nèi)外氨基酸濃度的平衡，過表達(dá)AtCAT9的擬南芥植株在低氮脅迫下具有生長發(fā)育延遲、葉片衰老緩慢的現(xiàn)象[15]。番茄中的研究表明，CAT9可能充當(dāng)膜兩側(cè)GLU/ASP與GABA之間交換的媒介，導(dǎo)致番茄成熟過程中大液泡內(nèi)GLU/ASP增加，GABA減少，從而影響番茄的口感與營養(yǎng)品質(zhì)[16]。

小麥?zhǔn)侨蜃钪匾募Z食作物之一，其產(chǎn)量高低直接關(guān)系著世界糧食安全。研究氮代謝相關(guān)基因的功能對(duì)提高氮素利用率及產(chǎn)量具有重要意義。本實(shí)驗(yàn)室通過前期的蛋白組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)小麥幼苗葉片中的TaCAT9蛋白參與低氮脅迫的應(yīng)答，說明其可能在氮素脅迫條件下起著某種調(diào)控作用(數(shù)據(jù)未發(fā)表)。通過查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，目前有關(guān)小麥TaCAT9基因及CATs基因家族的研究尚未見報(bào)道。鑒于此，本研究采用同源克隆的方法，從普通小麥品種豫麥49-198中克隆TaCAT9兩個(gè)部分同源基因的cDNA序列，對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析，同時(shí)研究了TaCAT9在不同組織器官中及氮素脅迫下的表達(dá)特性，以期為進(jìn)一步探索TaCAT9的生物學(xué)功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料及處理

供試材料為河南省大面積種植的小麥品種豫麥49-198，該品種具有豐產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、抗逆性好的特點(diǎn),由河南平安種業(yè)有限公司惠贈(zèng)。

選取籽粒飽滿的豫麥49-198種子，經(jīng)75%酒精浸泡10 min后,用蒸餾水清洗干凈，置于干凈的濕毛巾上，在黑暗條件下放置48 h，期間保持毛巾濕潤狀態(tài)。待種子露白后，選取發(fā)芽一致的種子置于滅菌培養(yǎng)皿中，在光暗周期16/8 h、光照強(qiáng)度250 μmol·m-2·s-1、晝夜溫度25/15 ℃、晝夜相對(duì)濕度60%和70%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)液為Hoagland全營養(yǎng)液，每天更換一次。待幼苗長至兩葉一心，將幼苗做兩種處理：一種為對(duì)照組，在Hoagland全營養(yǎng)液中生長；另一種為處理組，生長于缺氮的Hoagland營養(yǎng)液(用KCl和CaCl2代替Hoagland營養(yǎng)液中的KNO3和Ca(NO3)2)中。分別在0、0.25、0.5、1和7 d時(shí)取對(duì)照組與處理組的小麥幼苗葉片用于低氮脅迫下目的基因的表達(dá)模式分析。剪取正常處理兩葉一心期的葉片用于目的基因的克隆。所有材料用液氮速凍后保存于-80 ℃冰箱備用。

目的基因組織特異性表達(dá)分析：于2016年10月將豫麥49-198種植于河南農(nóng)業(yè)大學(xué)科教園區(qū)試驗(yàn)田，正常水肥管理，即施純氮240 kg·hm-2、磷肥(P2O5)150 kg·hm-2、鉀肥(K2O)120 kg·hm-2，分別于拔節(jié)期和揚(yáng)花期灌水，水表計(jì)量，每次灌水量750 m3·hm-2。小區(qū)面積為21 m2(7 m×3 m)。由于從2010年起，連續(xù)六年對(duì)該小區(qū)采取了精細(xì)化的栽培管理措施，因此土壤養(yǎng)分等條件基本一致。在小麥開花期選取花期與長勢一致的植株掛牌標(biāo)記，于花后15 d取標(biāo)記植株的根、莖、葉和籽粒，液氮速凍后保存于-80 ℃ 冰箱備用。

1.2 RNA的提取及cDNA第一鏈的合成

小麥根、莖、葉和籽?？俁NA的提取采用Trizol法，具體提取步驟參照Trizol Reagent(北京索萊寶科技有限公司)說明書進(jìn)行。用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測提取總RNA的完整性，并采用ND-1000微量紫外分光光度計(jì)(基因有限公司)測定RNA的濃度和純度。總RNA經(jīng)DNaseⅠ(普洛麥格(北京)生物技術(shù)有限公司)處理后作為模板，參照PrimeScriptTMⅡ 1st Strand cDNA Synthesis Kit(寶生物工程(大連)有限公司)合成cDNA第一條鏈，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 引物設(shè)計(jì)及TaCAT9基因的克隆

以二穗短柄草CAT9(XM_003569968.3)的cDNA序列為探針在Ensembl Plants六倍體小麥數(shù)據(jù)庫(http://plants.ensembl.org/Triticum_aestivum/Info/Index)進(jìn)行比對(duì)，得到三條高度相似且分別定位在6 A、6 B和6 D長臂上的序列，對(duì)應(yīng)的序列號(hào)分別為TRIAE_CS42_6AL_TGACv1_471594_AA1511590.1，RIAE_CS42_6BL_TGACv1_501182_AA1614650.1和TRIAE_CS42_6DL_TGACv1_526398_AA1682300.1；長度分別為2 462、2 572和2 365 bp，均包含一個(gè)長度為1 818 bp的開放閱讀框。比對(duì)這三條序列開放閱讀框的上下游，利用Primer5.0軟件在三條序列相似的部位設(shè)計(jì)兩對(duì)引物TaCAT9-F-1/TaCAT9-R和TaCAT9-F-2/TaCAT9-R用于三個(gè)部分同源基因cDNA序列的擴(kuò)增。由于上游引物5′端第五個(gè)堿基在三條序列的結(jié)合位點(diǎn)上存在一個(gè)由T到C的替換，所以設(shè)計(jì)兩條上游引物TaCAT9-F-1和TaCAT9-F-2，它們只在的5′端第五個(gè)堿基存在差異，分別為T和C。引物由北京奧科鼎盛生物科技有限公司合成，序列信息見表1。以豫麥49-198兩葉一心時(shí)期葉片的cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，所用的酶為2×Phanta Max Master Mix(南京諾唯贊生物科技有限公司)。擴(kuò)增體系與程序參照說明書，其中循環(huán)數(shù)為32，退火溫度為56 ℃，延伸時(shí)間為2 min 30 s。擴(kuò)增結(jié)束后，用1%的瓊脂糖對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測，回收純化目的片段后，將目的片段連接至克隆載體pTOPO-Blunt simple(北京愛德萊生物科技有限公司)，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH10B(北京中美泰和生物技術(shù)有限公司)，從兩對(duì)引物組合的擴(kuò)增產(chǎn)物中挑選經(jīng)PCR鑒定正確的陽性克隆送至北京奧科鼎盛生物科技有限公司進(jìn)行測序。

1.4 TaCAT9基因編碼蛋白的生物信息學(xué)分析

運(yùn)用ExPASy-ProtParam(https://web.expasy.org/protparam/)對(duì)TaCAT9基因編碼蛋白的理化性質(zhì)進(jìn)行預(yù)測；運(yùn)用WOLF PSORT(https:// psort.hgc.jp/)和TMHMM(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)對(duì)編碼蛋白的信號(hào)肽、亞細(xì)胞定位及跨膜區(qū)進(jìn)行預(yù)測；運(yùn)用InterProScan(http://www.ebi.ac.uk/interpro/)對(duì)編碼蛋白保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行預(yù)測。利用SOPMA(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=/NPSA/npsa_sopma.html)預(yù)測TaCAT9蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)，用Phyre 2(http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/Phyre2/html/page.cgi?id=index)預(yù)測蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)。以TaCAT9蛋白序列為探針，在NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)搜索不同物種的同源蛋白，并利用DNAMAN5.2.2進(jìn)行蛋白序列的多重比對(duì)，利用MEGA5.0構(gòu)建基于neigbor-joining(bootstrap值為1 000)的系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.5 TaCAT9基因的表達(dá)分析

由于序列高度相似，未能設(shè)計(jì)出分別針對(duì)TaCAT9-A和TaCAT9-B的特異引物，只設(shè)計(jì)了一對(duì)針對(duì)兩序列的特異性引物。利用NCBI在線引物設(shè)計(jì)工具primer-BLAST(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi?LINK_LOC=BlastHome)在TaCAT9-A和TaCAT9-B序列的保守區(qū)(避開核苷酸突變點(diǎn))設(shè)計(jì)引物對(duì)TaCAT9-qPCR-F/TaCAT9-qPCR-R(表1)，用于檢測TaCAT9基因的相對(duì)表達(dá)量；內(nèi)參基因采用小麥看家基因β-Actin(AB181991)，所用引物Actin-F/Actin-R序列見表1[17]。qRT-PCR體系與程序參照SYBR Premix ExTaqTMⅡ(寶生物工程(大連)有限公司)說明書，其中循環(huán)數(shù)為40，退火溫度為60 ℃，延伸時(shí)間為30 s。所用反應(yīng)平臺(tái)為CFX Connect Real-time Systerm(伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品(上海)有限公司)，每個(gè)樣品設(shè)置3次生物學(xué)重復(fù)。目的基因相對(duì)表達(dá)量的計(jì)算采用2-△△CT法，用SPSS 19.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性分析，用Excel 2003作圖。

表1 本研究中所用引物的基本信息Table 1 Primers used in this study

2 結(jié)果與分析

2.1 小麥TaCAT9基因克隆結(jié)果

利用引物TaCAT9-F1/TaCAT9-R和TaCAT9-F2/TaCAT9-R分別對(duì)豫麥49-198的cDNA進(jìn)行擴(kuò)增，分別得到兩條大小約為2 000 bp的特異性條帶(圖1)。將目的條帶回收純化后，經(jīng)連接、轉(zhuǎn)化，各篩選30個(gè)陽性克隆進(jìn)行測序。測序結(jié)果與中國春的三條序列(見材料方法)進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果表明：TaCAT9-F1/TaCAT9-R擴(kuò)增產(chǎn)物連接轉(zhuǎn)化的30個(gè)陽性單克隆的序列信息都與TRIAE_CS42_6AL_TGACv1_471594_AA1511590.1相同，而TaCAT9-F2/ TaCAT9-R有3個(gè)單克隆的序列與TRIAE_CS42_6BL_TGACv1_501182_AA1614650.1相同，其余都與TRIAE_CS42_6AL_TGACv1_471594_AA1511590.1相同。所以本試驗(yàn)共得到兩個(gè)TaCAT9基因的cDNA序列，因其分別位于小麥A和B亞基因組上，故將其分別命名為TaCAT9-A和TaCAT9-B。對(duì)于TaCAT9-D，可能由于表達(dá)量過低或者沒有表達(dá)，本研究沒能克隆到其cDNA序列。通過比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)，兩序列間存在28個(gè)單核苷酸突變位點(diǎn)，其中8個(gè)為有義突變，導(dǎo)致7個(gè)氨基酸的改變，分別為第116、136、154、652、1 420、1 546、1 547和1 711位堿基，其中第1 546位與第1 547位共同導(dǎo)致一個(gè)氨基酸的改變；其余20個(gè)為沉默突變 ，沒有導(dǎo)致氨基酸的變化(圖2)。

1：引物TaCAT9-F1/TaCAT9-R 的擴(kuò)增產(chǎn)物；2：引物TaCAT9-F2/TaCAT9-R 的擴(kuò)增產(chǎn)物；M：Trans2k Plus DNA marker。

1:Amplified products of primer TaCAT9-F1/TaCAT9-R；2:Amplified products of primer TaCAT9-F2/TaCAT9-R；M：Trans2k Plus DNA marker.

圖1TaCAT9基因的RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物

Fig.1AmplifiedproductsofTaCAT9genebyRT-PCR

圖2 TaCAT9-A和TaCAT9-B的cDNA序列比對(duì)Fig.2 Alignment of cDNA sequences between TaCAT9-A and TaCAT9-B

2.2 TaCAT9基因編碼蛋白的生物信息學(xué)分析

2.2.1TaCAT9基因編碼蛋白的理化性質(zhì)

由于序列相似度極高，protparam在線預(yù)測分析顯示TaCAT9-A和TaCAT9-B兩蛋白基本理化性質(zhì)非常接近，分子式分別為C2959H4619N743O802S19和C2962H4626N746O799S19，分子量分別為64.04和64.08 kDa，理論等電點(diǎn)(pI)分別為8.23和8.27，屬于弱堿性蛋白。脂肪族氨基酸指數(shù)分別為114.91和114.76，負(fù)電荷的氨基酸殘基數(shù)(Asp+Glu)分別為31和30；正電荷的氨基酸殘基數(shù)(Arg+Lys)分別為34和35?？偲骄H水性值(GRAVY)分別為0.745和0.739，不穩(wěn)定系數(shù)分別為35.62和35.68，兩者都屬于疏水穩(wěn)定蛋白。

2.2.2TaCAT9基因編碼蛋白的亞細(xì)胞定位、跨膜區(qū)及保守結(jié)構(gòu)域

WOLF PSORT預(yù)測分析顯示，兩蛋白均定位于細(xì)胞膜上，沒有分泌通路信號(hào)肽，即兩蛋白都不屬于分泌型蛋白。TMHMM在線預(yù)測表明TaCAT9-A和TaCAT9-B蛋白都存在13個(gè)跨膜區(qū)，屬于膜蛋白，這和前人對(duì)CAT亞家族蛋白跨膜區(qū)的描述相吻合。InterProScan保守結(jié)構(gòu)域分析顯示(圖3)，兩蛋白都屬于氨基酸透性酶家族，且都含有一個(gè)典型的陽離子氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的保守C末端。

2.2.3TaCAT9基因編碼蛋白的氨基酸序列比對(duì)及進(jìn)化分析

利用DNAMAN將TaCAT9-A和TaCAT9-B蛋白的氨基酸序列與來自玉米(NP_001168279.1)、水稻(XP_015627412.1)和高粱(XP_002454544.1)的CAT9氨基酸序列進(jìn)行多重比對(duì)。結(jié)果(圖4)表明，4個(gè)物種間的CAT9蛋白氨基酸序列長度差別不大，都約有600個(gè)氨基酸，且同源性較高。TaCAT9-A和TaCAT9-B兩者的同源性達(dá)到98.84%，4個(gè)物種間的同源性達(dá)到91.26% ，氨基酸序列高度保守，都包含13個(gè)跨膜區(qū)和1個(gè)保守的陽離子氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的C末端。

圖3 TaCAT9-A和TaCAT9-B蛋白的保守結(jié)構(gòu)域分析Fig.3 Conserved domains of TaCAT9-A protein and TaCAT9-B protein

方框指示陽離子氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的C末端，橫線指示13個(gè)跨膜區(qū)。

The box indicates the C-terminal of cationic amino acid transporter and the horizontal lines indicate 13 transmembrane regions.

圖4TaCAT9與其他物種同源蛋白的多序列比對(duì)

Fig.4Multi-alignmentofTaCAT9aminoacidsequencewithotherCAT9s

進(jìn)化分析(圖5)表明，所有參比的CAT9蛋白可以被分為兩大類，小麥等單子葉植物為一類，擬南芥等雙子葉植物為一類。其中與TaCAT9-A蛋白親緣關(guān)系最近的為烏拉爾圖小麥的CAT9蛋白，而山羊草CAT9蛋白與前二者聚類在一起，TaCAT9-B蛋白與上述三者聚類在一起。

圖5 小麥與其他物種CAT9蛋白的進(jìn)化分析Fig.5 Phylogene tree of CAT9 proteins from wheat and other species表2 TaCAT9蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測及所占比例Table 2 Prediction proportion of secondary structure of TaCAT9 protein %

2.2.4TaCAT9基因編碼蛋白的二級(jí)及三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果

通過SOPMA在線預(yù)測分析了TaCAT9-A和TACAT9-B的二級(jí)結(jié)構(gòu)組成(表2)，兩者都是由α-螺旋、延伸直鏈、β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲四種二級(jí)結(jié)構(gòu)組成，兩個(gè)蛋白所含的各種二級(jí)結(jié)構(gòu)比例相近，其中α-螺旋所占比例最高，無規(guī)則卷曲次之。通過Phyre 2構(gòu)建了蛋白的3D模型，因TaCAT9-A 與TACAT9-B氨基酸序列高度相似，所以同源建模選用的蛋白模型相同，3D結(jié)構(gòu)圖也相同。該模型中有73%的氨基酸序列結(jié)構(gòu)預(yù)測置信度達(dá)到100%，因此該蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)模型可信度較高。由圖6可知，兩蛋白主要由13個(gè)α-螺旋組成，這與TMHMM預(yù)測的兩個(gè)蛋白都有13個(gè)跨膜區(qū)一致。

2.3 TaCAT9基因的表達(dá)特性分析

在根、莖、葉和籽粒中均可檢測到TaCAT9基因的表達(dá)，但在根和籽粒中的表達(dá)量最低，莖中次之，葉片中的表達(dá)量最高，推測TaCAT9基因主要在葉片中表達(dá)(圖7)。進(jìn)一步的分析顯示，在氮脅迫下，小麥葉片TaCAT9基因的表達(dá)呈上升趨勢，在脅迫初期變化不明顯，隨著脅迫時(shí)間的增加表達(dá)量逐漸上調(diào)。

圖6 TaCAT9蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.6 Prediction of three dimensional structure of TaCAT9 protein

圖柱上的小寫字母不同表示在0.05水平差異顯著。

The different lower-case letters above the bar indicate significant difference at 0.05 level.

圖7TaCAT9基因的組織器官表達(dá)模式(A)和氮脅迫下TaCAT9基因在葉片中的表達(dá)模式(B)

Fig.7ExpressionpatternsofTaCAT9indifferenttissuesofwheatandexpressionpatternsofTaCAT9geneinleavesundernitrogenstress

3 討 論

普通小麥?zhǔn)且粋€(gè)典型的異源六倍體物種，由三個(gè)序列高度同源的亞基因組A、B和D組成[18]。因此，小麥中大部分基因在A、B和D三個(gè)亞基因組上都有一個(gè)基因位點(diǎn)，這三個(gè)基因稱為部分同源基因。研究表明，在六倍體小麥的產(chǎn)生以及進(jìn)化過程中，部分同源基因的表達(dá)可能產(chǎn)生分化[1,19]。如小麥膨脹素基因(TaEXPA1)，它的三個(gè)部分同源基因TaEXPA1-A/B/D在幼苗的根中都是沉默的，但TaEXPA1-A和TaEXPA1-D在幼葉中表達(dá)，而TaEXPA1-B在該組織中則是沉默的[20]。小麥TaWLHSI-A/B/D在不同的組織器官中具有不同的表達(dá)模式：TaWLHSI-B幾乎在所有組織器官中的表達(dá)量都低于另外兩個(gè)基因，TaWLHSI-A在幼穗中表達(dá)量最高，TaWLHSI-D則在稃中高表達(dá)[21]。以上研究表明，三個(gè)部分同源基因可能通過表達(dá)的分化來實(shí)現(xiàn)功能的相互協(xié)調(diào)，從而來調(diào)控小麥的生長發(fā)育。這一調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的復(fù)雜性，大大增加了小麥遺傳和功能分析的難度。在研究小麥的某個(gè)基因時(shí)，研究者需要面對(duì)三個(gè)序列高度同源的基因，由于缺乏小麥基因組信息，使得區(qū)分部分同源基因的難度會(huì)很大，所以很多研究者并沒有對(duì)它們加以區(qū)分。2014年，IWGSC(國際小麥基因組測序組織)采用先分離染色體臂，再對(duì)染色體臂分別測序的方法，發(fā)表了基于染色體測序的六倍體小麥中國春的序列草圖，這為研究小麥部分同源基因的遺傳和功能分析提供了一個(gè)很好的參考[22]。本研究所用的Ensemble plants網(wǎng)站中的小麥數(shù)據(jù)庫是基于中國春基因組信息而形成的，其中很多基因的轉(zhuǎn)錄本信息都是通過分析軟件預(yù)測的，而且不同品種間的序列信息也可能有所不同，比如存在SNP位點(diǎn)，存在不同的剪切體，這些都需要實(shí)驗(yàn)加以驗(yàn)證[23-24]。本研究通過二穗短柄草CAT9基因的 cDNA序列在Ensembl plants小麥數(shù)據(jù)庫中比對(duì)到三條高度同源的轉(zhuǎn)錄本，分別位于小麥6A、6B和6D染色體上，可以初步判定為TaCAT9的三個(gè)部分同源基因。以中國春的這三條轉(zhuǎn)錄本為參考，設(shè)計(jì)引物，從豫麥49-198克隆到位于6A和6B上的兩條序列，分別將其命名為TaCAT9-A和TaCAT9-B。比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)克隆的兩條序列與中國春的序列相似性達(dá)到100%，猜測該基因序列在不同品種間較為保守?？赡苡捎贒基因組上的序列表達(dá)量過低或者沒有表達(dá)，所以本研究沒有克隆到。另一方面從篩選單克隆測序的結(jié)果來看，本研究所采用的組織材料中，A基因組上的序列表達(dá)量最高，其他兩種遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于該序列，推測三個(gè)部分同源基因中TaCAT9-A基因發(fā)揮主要功能。當(dāng)然不排除在其他組織器官或受到內(nèi)外因素的刺激后，三個(gè)基因的表達(dá)量會(huì)發(fā)生變化，這需要進(jìn)一步的研究。

本研究從豫麥49-198中克隆到的兩個(gè)TaCAT9基因的cDNA序列編碼區(qū)長度都為1 818 bp，編碼605個(gè)氨基酸，它們所編碼的蛋白無論從基本理化性質(zhì)還是結(jié)構(gòu)特征上都高度相似。保守結(jié)構(gòu)域分析表明，兩蛋白都有一個(gè)陽離子氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族的C末端，且都有13個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)，這都符合模式作物中CATs亞家族的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)。由于尚未發(fā)現(xiàn)與小麥TaCAT9基因相關(guān)的研究報(bào)道，因此了解該基因的功能只能通過參考其他物種中已有的報(bào)道。擬南芥中的研究表明氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是個(gè)龐大的多基因家族，而CATs作為APCs家族中的一個(gè)亞族，主要參與中性氨基酸的運(yùn)輸[14]。2015年，Christopher等[16]通過定量蛋白組學(xué)的方法分析了番茄由綠變紅過程中果肉細(xì)胞液泡膜蛋白的變化，發(fā)現(xiàn)CAT9蛋白占液泡膜總蛋白的比例由0.02% 升至0.12%，亞細(xì)胞定位分析表明該蛋白不僅存在于液泡膜，而且廣泛存在于細(xì)胞的各種膜結(jié)構(gòu)中；進(jìn)一步研究表明，該蛋白可能在番茄果實(shí)成熟過程中充當(dāng)液泡膜內(nèi)外GLU/ASP與GABA交換的載體。同一年，Yang等[15]在擬南芥中研究發(fā)現(xiàn)，在氮素虧缺的生長條件下，AtCAT9缺失會(huì)造成植株萎黃失綠，早衰死亡，而過表達(dá)AtCAT9則完全相反，植株發(fā)育遲緩，存活率升高，葉片的持綠性明顯增強(qiáng)；進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)相對(duì)于AtCAT9缺失植株，轉(zhuǎn)基因植株葉片的可溶性氨基酸含量顯著降低，這說明過表達(dá)AtCAT9有利于提高氮素利用率，緩解氮素缺失造成的不利影響。本研究中，WOLF PSORT預(yù)測分析顯示TaCAT9-A和TaCAT9-B均定位于細(xì)胞膜，說明TaCAT9為膜蛋白，但軟件預(yù)測的結(jié)果較為模糊，該蛋白也有可能位于細(xì)胞的多種膜結(jié)構(gòu)中，需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)去明確小麥中CAT9的亞細(xì)胞定位。另外，采用同源建模的方法構(gòu)建TaCAT9蛋白的 3D模型時(shí)，Phyre2服務(wù)器預(yù)測該蛋白可能為GLU與GABA的逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，這和番茄中的研究結(jié)果較為相似，所以猜測GLU與GABA這兩種氨基酸可能為TaCAT9轉(zhuǎn)運(yùn)的底物。qRT-PCR結(jié)果顯示，TaCAT9基因主要在小麥葉片中表達(dá)，莖中次之，根和籽粒中最少；與正常供氮的植株相比，缺氮植株葉片TaCAT9基因在脅迫初期無變化，隨著脅迫時(shí)間的延長該基因的表達(dá)量顯著上調(diào)，說明TaCAT9參與低氮脅迫應(yīng)答。而脅迫響應(yīng)表現(xiàn)出一定的滯后可能是因?yàn)闊o機(jī)氮不是氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的直接作用底物，其在根部吸收后，需要同化為氨基酸及經(jīng)過一系列反應(yīng)才能影響到氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)，所以缺氮不會(huì)立即影響到TaCAT9的表達(dá)。

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