一例散發(fā)遺傳性對稱性色素異常癥ADAR1基因新突變

吉 津 郭 琴 章若畫 李 明

遺傳性對稱性色素異常癥(Dyschromatosis symmetrica hereditaria DSH)是一種少見的主要表現(xiàn)為常染色體顯性遺傳的具有高度外顯率色素異常性皮膚病[1]。在日本及中國的人群中發(fā)病的報道明顯多于其他國家，由此可見種族背景似乎是影響其發(fā)病率的主要因素[2]。臨床主要表現(xiàn)為肢端對稱性的色素沉著及色素減退斑疹，手足背部最為明顯，面部可伴有雀斑樣損害，通常于嬰兒期或童年期起病，亦有遲發(fā)患者的報道。一旦這些色素異常性皮損形成，往往可持續(xù)終生。日曬后加重，偶有嚴重者可累及全身，一般無自覺癥狀。少數(shù)DSH患者被報道可伴有一些并發(fā)癥，如：精神衰退、扭轉性肌張力障礙、病毒性腦炎、癲癇、顱內血管瘤、Perry-Romberg綜合征、1型神經(jīng)纖維瘤、多指(趾)、肢端肥大癥、銀屑病等[1]。定位于染色體1q21.3上的ADAR1基因被鑒定為是本病的致病基因，其編碼雙鏈RNA特異性腺苷酸脫氨酶。至今已有超過140個在此基因上的突變被陸續(xù)報道。筆者對一例散發(fā)DSH患者進行調查，并利用PCR和直接測序方法對其致病基因進行突變檢測，以期發(fā)現(xiàn)其中是否存在ADAR1基因突變。

1 資料和方法

1.1 倫理申明 此研究遵從赫爾辛基宣言的原則，由江蘇省中醫(yī)院倫理委員會審查通過?；颊吆推潆p親，以及100名種族相同的的正常對照組個體均在招募和抽血采樣前被告知此研究的目的及簽署知情同意書?；颊咄馕覀兊难芯靠梢怨计渑R床圖片。

1.2 臨床資料 患者，男，30歲。3歲時發(fā)病，雙側手背出現(xiàn)針尖大褐色斑疹，繼之出現(xiàn)色素減退斑疹(圖1)，逐漸增多，增大，至青春期后皮損穩(wěn)定不再增多。雙側足背無類似皮損，面部無雀斑樣損害，訴日曬后皮損可加重，夏重冬輕。除皮膚損害外，無系統(tǒng)病變。足月產(chǎn)，父母非近親結婚。其父母皮膚正常。

圖1 雙側手背部示色素沉著斑間有色素減退斑，足背未見明顯皮損

1.3 方法

1.3.1 外周血基因組DNA提取 采集患者、患者父母外周血3 mL，并采集與本病無關的100名正常人外周血3 mL作為對照，置-70℃冰箱保存。應用QIAamp DNA blood mini kit(QIAGEN公司，德國)提取基因組DNA，標化質量濃度至10 mg/L。

1.3.2 PCR擴增及DNA測序 根據(jù)文獻[4]合成13對引物，不僅包含ADAR1基因的15個外顯子，而且還包括每個外顯子兩端至少10個內含子。本文利用此13對引物全部擴增ADAR1基因的15個外顯子并全部進行測序。其中為擴增部分2號外顯子的引物：上游5’-TCAATG-AGTCTGACTCCTCT-3’。下游5’-GGAAG-GAGG'AAAAGATAGG-3’。PCR反應體系為50 μL，上、下游引物各20 pmol/L，dNTP 20 mmoL/L，MgCl215 mmoL/L，Taq酶2.5U。反應條件：94℃ 45 s，60℃ 45 s，72℃ 45 s，共33個循環(huán)。PCR產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠(溴化己錠染色)電泳分析并從瓊脂糖凝膠中回收、純化后經(jīng)ABl3730型全自動測序儀測序。將所得序列與GenBank(GenBank 編號：NM-001111)中人類ADAR1基因的標準序列進行比對。

2 結果

患者臨床表現(xiàn)符合DSH，由于患者個人因素，未能行皮損病理檢查。將PCR產(chǎn)物測序結果與Genbank中相對應的正常人ADAR1基因序列進行比對，結果發(fā)現(xiàn)患者出現(xiàn)雜合突變，第2號外顯子1162位堿基由G替換成了T(圖2)，造成編碼氨基酸發(fā)生無義突變，最終導致第388位氨基酸形成終止密碼子，即P.E388X，由此產(chǎn)生的蛋白質將缺失839位氨基酸。而臨床表型正常的患者的父母未發(fā)現(xiàn)突變，表明該突變是一個新生突變(de novo mutation)，并且本研究檢測了100名健康對照均未出現(xiàn)上述突變。以上研究結果證明筆者發(fā)現(xiàn)的無義突變(c.1162G>T)是該患者的致病突變而不是單核苷酸多態(tài)性。

圖2 a:正常人ADAR1基因部分序列圖；b:患者雜合無義突變，c．1162G>T，箭頭所示為突變堿基

剪切突變功能預測分析:應用 Mutation taster軟件進行剪切突變蛋白功能預測分析，提示下游氨基酸序列丟失，與野生型相比，蛋白質功能可能缺失。此突變未在ExAC nor 1000G數(shù)據(jù)庫中發(fā)現(xiàn)。

3 討論

遺傳性對稱性色素異常癥的致病基因ADAR1，也稱為DSRAD基因(double-stranded RNA．specific adenosine deaminase)即雙鏈RNA特異性腺苷脫氨酶，該酶選擇性作用于mRNA前體，將相應位點上腺嘌呤核苷(A)脫氨基轉換成次黃嘌呤核苷(I)。近期研究顯示ADAR1是固有免疫滅活病毒的重要調節(jié)因子之一，維持細胞生存的重要因子[6,7]。由于選擇性的剪接，其產(chǎn)生干擾素介導的或長形態(tài)p150(表達于細胞質與細胞核)和固有性表達的或短形態(tài)的p110(主要表達于細胞核)ADAR1蛋白質，據(jù)推測在DSH的致病機制中，P150異構體比p110發(fā)揮更重要的作用[8]。

該基因包含15個外顯子，編碼1226個氨基酸。該基因至少包含6個功能區(qū)域：2個Z-alpha區(qū)、3個dsRNA結合區(qū)(DRBM)和1個酶催化結構域(ADEAMc) 區(qū)；分別位于2號外顯子、外顯子2-7和外顯子9-15[5]。本研究發(fā)現(xiàn)，該家系突變位點位于2號外顯子內，該外顯子突變在目前報道較多，大多數(shù)為無義突變或移碼突變，少數(shù)為錯義突變[1,9,10]。該患者發(fā)生的2號外顯子的無義突變(c.1162G>T)導致形成終止密碼子(P.E388X)，使ADAR1基因所編碼的蛋白提前出現(xiàn)終止，導致截短的蛋白，或者可能引起無義介導的mRNA衰減(NMD)，減少ADAR1蛋白的表達，造成單倍劑量不足，使黑素母細胞功能異常，從而產(chǎn)生相應的臨床癥狀。

本例患者屬于散發(fā)病例，并且僅有雙側手背出現(xiàn)皮損，此在DSH患者中報道較少，值得引起注意。推測此可能是由于p110異構體ADAR1蛋白功能未受影響，彌補了P150異構體ADAR1蛋白功能不足的缺陷，但遺憾未能實驗證實；或此位點突變僅導致患者雙側手背皮損此種特定表現(xiàn)型的出現(xiàn)亦仍待后續(xù)研究報道證實。目前報道的DSH突變位點超過140種，但其基因型與表現(xiàn)型的相互關系及其確切致病機理仍未明確。組織病理和電鏡顯示色素減退區(qū)域黑素細胞及黑素小體數(shù)目均少于周圍正常組織，且存在黑素細胞的空泡化，一個新的發(fā)現(xiàn)是表皮朗格漢斯細胞黏附于淋巴細胞，值得注意的是此種細胞間接觸在活動性的白癜風皮損中也被報道過，此可能與色素脫失的過程有相關性；而色素沉著區(qū)域的黑素細胞擁有更多的樹突和大量的IV期黑素小體[11]。但不能解釋為何皮損總是多發(fā)在面部和肢端的背側，需要更多地研究去探索。

本研究發(fā)現(xiàn)的1個新的新生突變位于2號外顯子區(qū)域，造成提前形成終止密碼子，導致其后大片氨基酸缺失，從而引起RNA腺苷酸脫氨酶功能的障礙，導致本病的發(fā)生。我們報告的c．1162G>T(P．E388X)無義突變，經(jīng)查閱國內外文獻為未報道過的新突變。此次研究所發(fā)現(xiàn)的1個新的無義突變擴大了本病的基因譜，可能對DSH的致病機制及治療研究提供新的視野。

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