黏膜免疫及其在雞病防控中的應(yīng)用

李天芝，于新友

(1.山東綠都生物科技有限公司，山東 濱州 256600；2.山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，山東 濱州 256600)

約有80%以上病原微生物主要經(jīng)過呼吸道、消化道、生殖道等黏膜途徑侵入動(dòng)物機(jī)體引起感染[1]。黏膜是防御病原微生物的第一道屏障[2]，它可在病原微生物侵入機(jī)體前將其消滅，不會(huì)對(duì)機(jī)體造成損傷，在疾病的發(fā)生和發(fā)展中起著重要的作用。黏膜免疫系統(tǒng)是由廣泛分布于呼吸道、胃腸道、泌尿生殖道黏膜下及一些外分泌腺體 （唾液腺、淚腺、乳腺）處的淋巴組織組成的系統(tǒng)，主要包括3部分：①黏膜相關(guān)淋巴組織，如腸黏膜相關(guān)淋巴組織、支氣管黏膜相關(guān)淋巴組織、泌尿生殖道黏膜相關(guān)淋巴組織、鼻咽黏膜相關(guān)性淋巴組織和眼結(jié)膜相關(guān)淋巴組織等[3]；②致敏淋巴細(xì)胞散布途徑，主要是淋巴循環(huán)及血液循環(huán)；③黏膜免疫效應(yīng)部位，即全身的黏膜組織，包括胃腸道、呼吸道、眼結(jié)膜、生殖道和多種分泌腺如乳腺、唾液腺、淚腺等組織。黏膜免疫是雞體免疫網(wǎng)絡(luò)的重要組成部分[4]，50%以上的淋巴組織和80%的免疫細(xì)胞存在于黏膜，黏膜是雞最大的免疫系統(tǒng)。黏膜免疫自誕生以來就受到國內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注，成為研究的熱點(diǎn)，黏膜免疫系統(tǒng)與傳統(tǒng)意義上的免疫系統(tǒng)不同，不僅能在黏膜局部發(fā)揮免疫功能，產(chǎn)生分泌型抗體，阻止了病原微生物從黏膜的入侵，還能通過“共同黏膜免疫系統(tǒng)”使整個(gè)機(jī)體黏膜系統(tǒng)產(chǎn)生免疫保護(hù)[5]，同時(shí)又能誘發(fā)全身性的體液免疫應(yīng)答[6]。黏膜局部的抗體比血清抗體出現(xiàn)得早、效價(jià)高，且維持的時(shí)間長，其抗體水平更能體現(xiàn)疫苗免疫保護(hù)情況。黏膜免疫產(chǎn)生的抗體主要以分泌型的IgA（sIgA）為主，還有分泌型的IgM（sIgM）、IgG等。隨著集約化、規(guī)?；B(yǎng)殖業(yè)的不斷發(fā)展，傳統(tǒng)的疫苗注射免疫因存在費(fèi)時(shí)費(fèi)力、對(duì)雞的應(yīng)激大、操作繁瑣、容易導(dǎo)致交叉污染等問題，已經(jīng)不能完全適應(yīng)生產(chǎn)的需要。黏膜免疫可通過氣霧、口服等途徑接種，簡單易行、副作用較小，更重要的是可阻止病原在局部黏膜的定植，免疫效果好，不僅誘導(dǎo)局部免疫應(yīng)答，也誘導(dǎo)全身性應(yīng)答等，因此越來越受到關(guān)注。文章主要介紹黏膜免疫及其在雞病防控中的應(yīng)用。

1 黏膜免疫抗體

1.1 黏膜sIgA sIgA抗體是由漿細(xì)胞分化產(chǎn)生的，在黏膜中含量最為豐富，是參與黏膜免疫反應(yīng)的主要抗體。sIgA由兩個(gè)IgA單體、1條J鏈和一條分泌片(secretory component，SC)構(gòu)成[7]，J 鏈?zhǔn)窃跐{細(xì)胞分泌IgA前同IgA聚合的，SC則是由IgA穿過上皮轉(zhuǎn)運(yùn)過程中加上的。SC無免疫活性，但它能促進(jìn)上皮細(xì)胞積極地從組織中吸收sIgA，并將其釋放到消化道、呼吸道和泌尿生殖道的黏膜表面，從而發(fā)揮黏膜免疫效應(yīng)，還能夠保護(hù)抗體免受蛋白酶的降解，增加抗體的穩(wěn)定性，使其在消化道及呼吸道管腔中保持活性的時(shí)間延長。與單體IgA相比，sIgA表面具有大量的抗原結(jié)合位點(diǎn)，結(jié)合抗原的能力強(qiáng)。sIgA沒有活化補(bǔ)體和其它促炎癥因子的功能，當(dāng)發(fā)揮免疫活性時(shí)只是與腸腔中的各種抗原連接，干擾它們的攝入，因此對(duì)黏膜上皮細(xì)胞的損傷較小。sIgA的作用主要是：①能捕捉進(jìn)入黏膜內(nèi)的病原，使病原發(fā)生凝聚，阻斷其病原與黏膜結(jié)合、或與病原微生物結(jié)合形成復(fù)合物，從而阻斷或阻止病原對(duì)黏膜的黏附，發(fā)揮外源病原的免疫排斥作用；②能與溶菌酶、補(bǔ)體共同作用引起細(xì)菌溶解，也能中和相應(yīng)腸毒素的毒性；③能與吞噬細(xì)胞、自然殺傷（NK）細(xì)胞等細(xì)胞表面的Fc受體結(jié)合，發(fā)揮ADCC效應(yīng)，殺傷靶細(xì)胞；④增強(qiáng)乳鐵傳遞蛋白及乳過氧化物酶系統(tǒng)對(duì)幾種黏膜病原體的抗菌作用；⑤可通過黏膜淋巴組織增強(qiáng)抗原依賴性細(xì)胞作用，從而提高對(duì)病原的直接殺傷能力。

1.2 黏膜sIgM sIgM是由5個(gè)IgM單體聚合而成，也是能發(fā)揮黏膜免疫功能的一種高效抗體。同sIgA的功能類似，具有抗菌、抗病毒、中和毒素的免疫活性，尤其對(duì)IgA免疫缺陷的個(gè)體，sIgM的免疫功能更為重要。

1.3 黏膜中的IgG 目前，尚不清楚血清中的IgG是如何進(jìn)入分泌物中的，黏膜表面的IgG抗體在抵抗感染中可發(fā)揮重要作用。分泌到管腔中的IgG同樣具有抗菌、抗病毒及抗毒素等功能。但I(xiàn)gG與抗原結(jié)合發(fā)揮免疫活性時(shí)，能激活補(bǔ)體造成黏膜上皮細(xì)胞的損傷，從而達(dá)到清除病原的作用。IgG抗體對(duì)蛋白酶的水解作用抵抗力弱，容易降解，不穩(wěn)定。IgG同sIgA一樣也能發(fā)揮ADCC效應(yīng)，殺傷靶細(xì)胞。管腔中的IgG可與抗原結(jié)合，形成免疫復(fù)合物，返回到黏膜固有層，經(jīng)樹突狀細(xì)胞處理后，遞呈給CD4+T細(xì)胞，以供機(jī)體免疫系統(tǒng)識(shí)別。

2 黏膜免疫佐劑

經(jīng)黏膜免疫時(shí)大多數(shù)蛋白質(zhì)抗原免疫力降低，經(jīng)反復(fù)大量免疫后，易引起免疫耐受，阻礙了黏膜疫苗的發(fā)展。因此，需要配合相應(yīng)的佐劑，以增強(qiáng)黏膜免疫反應(yīng)的效果，或使抗原物質(zhì)免于被胃腸道消化酶的降解。黏膜免疫相關(guān)佐劑可提高疫苗的免疫原性，延長抗原與黏膜及免疫活性細(xì)胞的作用時(shí)間，減少黏膜免疫耐受，增強(qiáng)疫苗免疫效果[8]，是黏膜疫苗研發(fā)的重點(diǎn)。好的黏膜免疫佐劑需具備以下條件：①能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生強(qiáng)烈的體液和/或細(xì)胞免疫應(yīng)答反應(yīng)；②安全性好，無熱原，無致癌、致畸特性，無毒副作用，不會(huì)引起動(dòng)物體的過敏反應(yīng)；③穩(wěn)定性好，在一定溫度、pH范圍，能長時(shí)間保存，性質(zhì)不發(fā)生改變。目前，人們已開發(fā)出多種黏膜免疫佐劑，并投入到實(shí)際生產(chǎn)中，取得了一定的成果。

2.1 細(xì)菌毒素 主要包括從霍亂弧菌獲得的霍亂毒素(CT)、從大腸桿菌獲得的熱不穩(wěn)定毒素(LT)及從百日咳博德特氏菌獲得的百日咳毒素等。其中，CT和LT是公認(rèn)的有效的黏膜佐劑，均能提高APCs遞呈抗原的能力，具有良好的免疫原性。CT和LT均由A、B兩種亞單位組成的的六聚體蛋白，A亞單位具有催化ADP核糖基化的作用，B亞單位的可與與宿主細(xì)胞表面受體結(jié)合，穿透細(xì)胞，將亞單位A帶入細(xì)胞。CT能誘導(dǎo)CD4+、Th2型細(xì)胞活化，產(chǎn)生 IL-4、IL-5、IL-6 和 IL-10，也能促進(jìn)IgG2b亞類、IgE和黏膜sIgA應(yīng)答的出現(xiàn)。與抗原同時(shí)口服時(shí)可誘導(dǎo)CD4+、Th1細(xì)胞產(chǎn)生血清IgM、IgG1、IgG2a和黏膜sIgA。LT作為佐劑可與多種抗原經(jīng)不同途徑共免疫，均能明顯增強(qiáng)機(jī)體對(duì)共免抗原的黏膜sIgA和IgG應(yīng)答，與CT主要誘導(dǎo)Th2型免疫應(yīng)答不同，LT誘導(dǎo)的應(yīng)答要均衡些，產(chǎn)生IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3 和 黏膜 sIgA， 是 Th1 和Th2型應(yīng)答的混合。CT和LT均具有毒性，LT的毒性較CT低，經(jīng)黏膜免疫時(shí)可產(chǎn)生針對(duì)自身的sIgA和血清抗體，限制了其在人體上的應(yīng)用。

2.2 細(xì)胞因子 細(xì)胞因子通過促進(jìn)免疫活性細(xì)胞的分化增殖或影響細(xì)胞內(nèi)生物活性分子的表達(dá)與分泌而發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用，可直接作為佐劑使用。目前，常用的細(xì)胞因子佐劑有IL-1、IL-2、IFN-γ、IL-12、IL-18及 GM-CSF 等。 IL-1和 IL-12不僅能誘導(dǎo)抗原特異性的免疫應(yīng)答，而且誘導(dǎo)黏膜免疫應(yīng)答。IL-1能顯著增加抗體水平，尤其是IgG2a和IgA的水平，在鼻內(nèi)免疫佐劑中可代替CT或LT，毒性相對(duì)較小。IL-18可誘導(dǎo)Th1細(xì)胞分化發(fā)育和增殖。細(xì)胞因子佐劑的缺點(diǎn)是半衰期短，活性易受內(nèi)環(huán)境如pH、各種水解酶及血漿蛋白的影響，當(dāng)大劑量的時(shí)可導(dǎo)致發(fā)熱、炎癥等副作用。

2.3 CpG基序 通過人工合成的一個(gè)或多個(gè)非甲基化的CpG基序?yàn)楹诵牡墓押塑账?(ODN)，也具有相似的免疫刺激功能，可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生強(qiáng)烈的體液和細(xì)胞介導(dǎo)的全身免疫及黏膜免疫。當(dāng)與蛋白抗原共同使用時(shí)，可誘導(dǎo)機(jī)體細(xì)胞免疫應(yīng)答反應(yīng)。CpG能刺激B細(xì)胞增殖，分泌多克隆抗體、IL-6、IL-12[9]，同時(shí)激活單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞，促使未成熟的樹突狀細(xì)胞(DCs)轉(zhuǎn)變?yōu)槌墒斓腁PCs。CpG作為佐劑與抗原共同免疫動(dòng)物可誘發(fā)強(qiáng)烈的以IgG2a和CTL為主的Th1型免疫應(yīng)答。還能激活T細(xì)胞、B細(xì)胞、NK細(xì)胞等，產(chǎn)生大量的多種細(xì)胞因子，增強(qiáng)機(jī)體的特異性和非特異性免疫效應(yīng)。還可與傳統(tǒng)的黏膜免疫佐劑CT和LT產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)，且無毒副作用，是一種極具應(yīng)用前景的黏膜免疫佐劑。

2.4 甘露聚糖 甘露聚糖可作為黏膜反應(yīng)佐劑，誘導(dǎo)血清、陰道及唾液中sIgA的分泌。

2.5 脂質(zhì)體 脂質(zhì)體是由單層或多層磷脂組成的具有水相內(nèi)核的環(huán)形囊狀結(jié)構(gòu)小體，對(duì)蛋白質(zhì)或多糖抗原都有免疫增強(qiáng)作用。能激發(fā)細(xì)胞免疫活性，提高抗體效價(jià)，而且抗體滴度維持的時(shí)間較長。脂質(zhì)體與抗原結(jié)合后可增加黏膜供給疫苗的有效性，發(fā)揮免疫佐劑效應(yīng)，能誘發(fā)高水平的系統(tǒng)IgG和黏膜sIgA抗體反應(yīng)。作為鼻黏膜免疫佐劑時(shí)，刺激機(jī)體的黏膜和全身免疫應(yīng)答反應(yīng)。在酸性溶液、膽汁和胰液素中非常穩(wěn)定，因此，很適合作為口服疫苗的載體，脂質(zhì)體也可以配合其它黏膜佐劑如CT一起使用，增加口服釋放的效率。

2.6 細(xì)菌載體 應(yīng)用化學(xué)或分子生物學(xué)技術(shù)使上細(xì)菌中的致病基因發(fā)生突變以降低毒性，但仍保留了其對(duì)黏膜的侵襲力或從動(dòng)物體內(nèi)分離的益生菌作為載體，將疫苗抗原運(yùn)載至APCs。目前常用的細(xì)菌載體主要包括李斯特桿菌、鼠傷寒桿菌、志賀菌、乳酸桿菌、酵母菌等。一般通過口服方式進(jìn)行免疫，可保護(hù)抗原免于被體內(nèi)酸性環(huán)境破壞。

3 黏膜免疫的途徑

常見的黏膜免疫途徑包括消化道、呼吸道、直腸黏膜等。由于每一部位的組織結(jié)構(gòu)各不相同，其免疫的分子機(jī)制和效果也不同。疫苗用量較少，又能引起強(qiáng)烈的全身性免疫應(yīng)答反應(yīng)的途徑是最佳的途徑[10]。下面簡單介紹一下各種黏膜免疫途徑的特點(diǎn)。

3.1 消化道 消化道免疫主要是通過口服疫苗的方式免疫，操作方便，能同時(shí)預(yù)防腸道及呼吸道、泌尿生殖道感染。是傳統(tǒng)的黏膜免疫途徑，能產(chǎn)生大量的sIgA發(fā)揮免疫功能，但通過消化道免疫疫苗時(shí)，疫苗容易被強(qiáng)烈的胃酸環(huán)境破壞，免疫時(shí)需要加大劑量，或采用特殊的物質(zhì)包被，以減少胃酸對(duì)疫苗的破壞。除了sIgA發(fā)揮重要作用外，位于小腸黏膜上皮之間的上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞，直接與進(jìn)入腸腔的微生物接觸，也在消化道黏膜免疫中發(fā)揮重要的作用。腸道是誘導(dǎo)黏膜免疫應(yīng)答的有效部位，經(jīng)過腸道免疫可以產(chǎn)生較好的黏膜免疫應(yīng)答，且免疫方法簡單易行。如何使疫苗不受消化液的影響，使用少量的抗原有效地誘導(dǎo)黏膜免疫反應(yīng)，提高黏膜免疫力是目前經(jīng)消化道免疫急需解決的問題。

3.2 呼吸道 所謂呼吸道免疫主要是經(jīng)鼻腔接種疫苗，疫苗也可通過氣管，激發(fā)機(jī)體免疫。鼻黏膜具有豐富的血管，接種的疫苗能吸收進(jìn)入體循環(huán)，一般所需要的劑量少，鼻腔接種后可誘導(dǎo)激活扁桃體處的B淋巴細(xì)胞，在鼻或扁桃體激活的部分B細(xì)胞可進(jìn)入血液循環(huán)遷移到遠(yuǎn)處黏膜組織。因此，鼻腔接種疫苗不僅能預(yù)防呼吸道感染，也能預(yù)防其它部位的感染。鼻腔接種操作簡單，不需要專門器械，并可避免由于注射而帶來的交叉感染。

3.3 直腸 雞直腸黏膜中有大量M細(xì)胞和淋巴細(xì)胞，直腸能夠進(jìn)行局部黏膜免疫。

4 黏膜免疫在雞病防控中的應(yīng)用

4.1 雞新城疫防控 新城疫病毒(NDV)感染的門戶主要是呼吸道和消化道黏膜，黏膜免疫作為雞體免疫的第一道防線，對(duì)防止NDV感染具有重要意義。對(duì)新城疫來說，要抵抗其強(qiáng)毒攻擊，既需要全身免疫，又需要局部免疫，特別是呼吸道的局部免疫，呼吸道的局部免疫只有直接接觸外源性抗原才能引起免疫應(yīng)答。唐思靜等[11]以NDV LaSota株作為共免疫原，與大腸桿菌熱敏性腸毒素突變體蛋白(LTRG)重組蛋白經(jīng)滴鼻、口服及肌肉注射三種途徑接種雛雞，通過血清IgG抗體、HI抗體及粘膜分泌型IgA抗體水平變化，評(píng)價(jià)不同途徑接種LTRG對(duì)NDV疫苗的免疫效果的影響。結(jié)果顯示：①三種途徑接種，LTRG均能顯著增強(qiáng)NDV疫苗的免疫抗體水平，免疫雛雞血清抗體和粘膜抗體水平均高于NDV疫苗單獨(dú)免疫組；②LTRG對(duì)NDV疫苗免疫增強(qiáng)作用，以滴鼻接種最顯著，二、三免后LTRG+NDV滴鼻組與NDV組血清IgG、粘膜 IgA 差異均顯著 (P＜0.01、P＜0.05)，LTRG+NDV口服與NDV組血清IgG差異不顯著 (P＞0.05)、粘膜 IgA差異極顯著 (P＜0.01)，LTRG+NDV肌注與NDV組IgG差異不顯著(P＞0.05)、粘膜IgA差異顯著(P＜0.05)；③三種免疫途徑比較：血清 IgG抗體水平差異均不明顯(P＞0.05)，滴鼻、口服免疫可誘導(dǎo)雛雞產(chǎn)生較高的粘膜IgA抗體、血清HI抗體。徐培軍等[12]采用新城疫LaSota弱毒株經(jīng)不同接種途徑免疫雛雞，然后采集氣管液、血清，對(duì)新城疫抗體進(jìn)行檢測。結(jié)果表明：經(jīng)飲水、滴鼻等免疫途徑比肌肉注射免疫更好地激活黏膜免疫部位產(chǎn)生更高水平的抗體。黏膜免疫途徑氣管液中的抗體在一免后比血清中抗體效價(jià)高 (P＜0.05或 P＜0.01)，而二免后其抗體水平要低于非黏膜免疫反應(yīng)血清中抗體水平(P＜0.05)。馬金萍等[13]采用新城疫La Sota弱毒株疫苗經(jīng)滴鼻、點(diǎn)眼途徑免疫不同日齡雛雞，然后采集血清、淚液和鼻洗脫液，應(yīng)用血凝抑制試驗(yàn) (HI)和間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)對(duì)抗原特異性IgM、IgG和IgA或SIgA抗體水平的消長規(guī)律進(jìn)行檢測。結(jié)果顯示，血清中IgG抗體水平最高，IgA和IgM抗體水平相對(duì)較低。免疫組血清HI效價(jià)明顯高于空白對(duì)照組血清HI效價(jià)。淚液和鼻洗脫液中新城疫病毒(NDV)特異性IgM出現(xiàn)的最早，于免疫后第4天可檢測到，并于第7天達(dá)到高峰，而后迅速下降，而NDV特異性IgG、SIgA于免疫后第7天可檢測到，并于第21天達(dá)到較高水平。13日齡免疫組總抗體水平分別高于6日齡免疫組和3日齡免疫組總抗體水平，但是1日齡免疫組不能誘導(dǎo)呼吸道黏膜產(chǎn)生抗體。

4.2 雞傳染性法氏囊病防控 雞傳染性法氏囊病(IBD)是由IBD病毒(IBDV)引起雞的一種急性、高度接觸性傳染病，接種疫苗是防制IBD的主要措施。由于IBDV主要經(jīng)消化道和呼吸道等黏膜途徑感染，良好的局部黏膜免疫是抵抗該病感染的重要防線，所以通過模擬病原體的自然感染途徑，增強(qiáng)病原體最初侵入的呼吸道和消化道黏膜局部產(chǎn)生特異性sIgA，進(jìn)而引起全身性系統(tǒng)免疫應(yīng)答，對(duì)有效防制該病具有重要實(shí)踐意義。鄭世民等[14]研究表明使用免疫增強(qiáng)劑“禽?！焙汀癐mmunair”的1日齡SPF雛雞接種IBD疫苗后，其消化道和呼吸道局部黏膜免疫組織的T細(xì)胞和IgA、IgM和IgG生成細(xì)胞數(shù)量指標(biāo)均不同程度地高于IBD疫苗單獨(dú)免疫的雛雞，表明免疫增強(qiáng)劑能明顯提高雛雞消化道和呼吸道局部黏膜免疫組織對(duì)IBD疫苗的免疫應(yīng)答，增強(qiáng)IBD免疫雛雞對(duì)vvIBDV攻擊的保護(hù)力。許信剛等[15]構(gòu)建了能表達(dá)IBDV VP2基因的重組減毒鼠傷寒沙門菌疫苗株X4550(pYA3341-VP2)，進(jìn)行重組菌VP2蛋白表達(dá)的鑒定，測定重組菌的穩(wěn)定性、生長曲線、安全性以及小鼠免疫試驗(yàn)。結(jié)果表明，酶切鑒定證實(shí)重組質(zhì)粒構(gòu)建成功，SDS-PAGE和Western blot證實(shí)重組菌表達(dá)的VP2蛋白能與雞抗IBDV陽性血清特異性結(jié)合，重組菌株在體外營養(yǎng)選擇壓力下，可穩(wěn)定地?cái)y帶重組質(zhì)粒傳代繁殖，在體內(nèi)可穩(wěn)定地定居于腸系膜淋巴結(jié)和脾臟，小鼠口服試驗(yàn)證實(shí)重組菌無毒性作用，口服重組菌免疫小鼠，ELISA檢測產(chǎn)生了抗IBDV抗體，中和試驗(yàn)表明產(chǎn)生的抗體具有中和活性。林紅麗等[16]構(gòu)建了能表達(dá)IBDVVP2基因的重組干酪乳桿菌，分別口服、滴鼻/點(diǎn)眼pLAVP2/L.casei，口服、肌注商品活苗及口服pLA/L.casei和PBS為對(duì)照，監(jiān)測IgG和sIgA抗體水平，末免后7d檢測脾淋巴細(xì)胞增殖情況并攻毒，7d后剖檢，觀察法氏囊損傷程度并記錄病變得分和保護(hù)率。結(jié)果表明，各組的特異性sIgA、IgG抗體水平顯著高于對(duì)照組 (P＜0.01)，口服 pLA-VP2/L.casei組的淋巴細(xì)胞刺激指數(shù)顯著高于其他組 (P＜0.01)，保護(hù)率高達(dá)83.3%，免疫保護(hù)效果優(yōu)于滴鼻/點(diǎn)眼組。

4.3 禽流感防控 禽流感是由禽流感病毒(AIV)引起的一種禽類傳染性疾病。AIV主要通過消化道和呼吸道感染雞，而后在腸道黏膜復(fù)制。如果增強(qiáng)咽和小腸黏膜免疫力，阻止病毒經(jīng)消化道和呼吸道途徑進(jìn)入體內(nèi)，控制病毒在腸道定殖復(fù)制將會(huì)直接切斷病毒的傳播。目前控制和預(yù)防禽流感主要依靠注射禽流感全病毒滅活疫苗(油乳劑滅活苗)，但肌肉注射滅活疫苗不能對(duì)黏膜局部產(chǎn)生有效刺激，也就不能誘導(dǎo)局部免疫應(yīng)答。焦鳳超等[17]構(gòu)建了含H5亞型禽流感病毒HA基因的重組沙門菌SL7207(pVAX1-HA)和 X4550(asd-pVAX1-HA)，以2×109CFU的劑量兩次口服免疫1日齡商品代伊莎褐蛋雞，同時(shí)，將重組菌分別與pVAX1-IFN-γ或 pVAX1-IL2(200μg/只)聯(lián)合免疫，通過測定小腸粘膜抗體效價(jià)，結(jié)果顯示，重組菌單獨(dú)免疫組和聯(lián)合免疫組能激發(fā)機(jī)體產(chǎn)生粘膜免疫應(yīng)答，且與空載體組、空白對(duì)照組以及油苗組之間存在顯著性差異 (P＜0.05)。攻毒后，兩組重組菌免疫組雞對(duì)AIVH5亞型強(qiáng)毒攻擊均具有良好的免疫保護(hù)作用。劉麗平等[18]構(gòu)建了含H9N2亞型AIVHA基因的重組沙門菌SL7207(pVAX1-HA)和X4550(asdpVAX1-HA)。以5×109cfu/只的劑量兩次口服接種1日齡的商品代伊莎褐蛋雞，免疫雞既能檢測到HA特異性的血清抗體應(yīng)答，又能檢測到黏膜免疫應(yīng)答，采用A/Chicken/Shanghai/3/2002(H9N2)AIV毒株經(jīng)滴鼻和口服同時(shí)攻毒免疫雞后，這兩種疫苗抑制免疫雞排毒的效果與滅活疫苗有顯著差異。

4.4 雞傳染性支氣管炎防控 雞傳染性支氣管炎病毒(IBV)引起的雞傳染性支氣管炎(IB)是一種具有高度傳染性的病毒性呼吸道疾病，主要侵害雞的呼吸系統(tǒng)、泌尿生殖系統(tǒng)和消化系統(tǒng)，不同日齡均能感染，雛雞最易感。IBV是典型的嗜黏膜病原，主要通過呼吸道黏膜途徑感染機(jī)體，因此黏膜免疫研究是IBV致病機(jī)制研究的重中之重。房慧伶等[19]采用傳染性支氣管炎弱毒苗對(duì)1日齡雛雞分別進(jìn)行點(diǎn)眼和滴鼻免疫。取氣管和哈德氏腺做石蠟切片，免疫組化染色，對(duì)氣管和哈德氏腺中SIgA細(xì)胞的分布、數(shù)量變化進(jìn)行了觀察。結(jié)果表明：SIgA陽性細(xì)胞分布在哈德氏腺的間質(zhì)中，氣管中的SIgA細(xì)胞主要分布在黏膜上皮細(xì)胞之間和固有層中，局部黏膜上皮形成的隱窩內(nèi)也分布有SIgA細(xì)胞。數(shù)量統(tǒng)計(jì)分析表明：免疫組的哈德氏腺和氣管中SIgA細(xì)胞數(shù)量顯著高于對(duì)照組，點(diǎn)眼免疫的SIgA細(xì)胞數(shù)量比滴鼻免疫的高，加強(qiáng)免疫則使SIgA細(xì)胞數(shù)量進(jìn)一步增多。

4.5 雞毒支原體防控 雞毒支原體(MG)引起的慢性呼吸道疾病已成為我國養(yǎng)雞業(yè)中一種重要的疾病，雞群平均感染率高達(dá)80%。現(xiàn)有雞毒支原體滅活疫苗的肌注免疫途徑只能激活機(jī)體的體液免疫，滅活疫苗雖然能激發(fā)集體的細(xì)胞免疫，但存在毒力返強(qiáng)的風(fēng)險(xiǎn)。研究表明體液免疫并不能有效抵抗MG感染，而黏膜抗體(IgA)和細(xì)胞免疫可能更重要，胡思順等[20]將表達(dá)的雞毒支原體(MG)HS株pMGA1.2重組蛋白(rpMGA1.2)經(jīng)滴鼻點(diǎn)眼途徑免疫SPF雞，并進(jìn)行攻毒試驗(yàn)，結(jié)果顯示，免疫的SPF雞能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生特異性體液免疫和呼吸道粘膜免疫，對(duì)2×109ccu MG-HS攻擊的保護(hù)率為67%。

5 小結(jié)與展望

黏膜免疫尤其對(duì)于一些經(jīng)黏膜途徑侵入動(dòng)物機(jī)體的病原防控效果更好，與傳統(tǒng)的免疫方式相比，黏膜免疫具有很多優(yōu)點(diǎn)，對(duì)動(dòng)物應(yīng)激小，安全性好，即能產(chǎn)生局部黏膜免疫，形成黏膜抗體防護(hù)網(wǎng)，又能及全身免疫應(yīng)答反應(yīng)，操作簡便，省時(shí)、省力，可發(fā)揮占位效應(yīng)，適合規(guī)?；B(yǎng)殖場應(yīng)用，是雞用疫苗研究的重要方向。但在黏膜疫苗的研制過程中也存在一些問題，如在免疫佐劑的選擇，免疫途徑的確定及如何保持抗原的活性且發(fā)揮最佳的免疫效果等方面還有很多工作需要研究。黏膜佐劑的研制也取得了一定的進(jìn)展，開發(fā)安全性、有效性、穩(wěn)定性好的新型黏膜疫苗仍然是生物技術(shù)領(lǐng)域及生命科學(xué)工作者的重大挑戰(zhàn)。相信隨著分子生物學(xué)和免疫學(xué)理論與技術(shù)的發(fā)展，黏膜免疫將在今后雞病的防控中發(fā)揮越來越重要的作用。

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