促紅細胞生成素在斑馬魚胚胎發(fā)育中抑制腎臟細胞凋亡*

折劍青，婁博文，吳 岳，袁祖貽

(西安交通大學第一附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科， 陜西 西安 710048)

促紅細胞生成素(erythropoirtin，Epo)是一種糖蛋白復合物，在成人體內(nèi)主要由肝臟及腎臟分泌。既往研究提示，Epo在抑制前成紅細胞凋亡及促進紅細胞生成方面起到至關(guān)重要的作用[1-3]。近年來有研究提示，Epo在造血以外系統(tǒng)，包括腎臟病理、神經(jīng)發(fā)育和氧化應(yīng)激等方面同樣起到重要調(diào)節(jié)作用[3-5]，人類及小鼠腎臟細胞中都可以檢測到Epo的表達，提示Epo可能在腎臟疾病中發(fā)揮作用[6]；進一步研究表明，Epo的單核苷酸多態(tài)性遺傳改變在糖尿病腎病發(fā)生發(fā)展中產(chǎn)生一定影響[7]；此外，在糖尿病腎病小鼠中持續(xù)給予Epo受體(Epo receptor，EpoR)激動劑可明顯減少腎臟細胞凋亡和壞死的數(shù)量[8]，以上研究均提示Epo可能在腎臟病理生理改變中起到作用。然而，Epo在腎臟病理改變中的具體作用和機制仍有待進一步闡明。此外，由于Epo在造血系統(tǒng)具有至關(guān)重要的作用，Epo基因敲除或下調(diào)的動物模型很難在胚胎期以后存活[9]，也限制了對Epo功能的進一步在體觀察。

本研究中，我們采用斑馬魚作為動物模型觀察Epo基因下調(diào)對斑馬魚胚胎腎臟形態(tài)的影響。斑馬魚作為一種新興的動物模型具有易于調(diào)控基因表達、胚胎期透明易于活體觀察及用于觀察的胚胎數(shù)目多等特點[10]。胚胎受精后48～72 h，斑馬魚前腎單位由單一的2個腎小球組成，兩者分別與雙側(cè)腎小管連接，隨著胚胎發(fā)育，2個腎小球在中線融合；而在人體，腎臟發(fā)育較斑馬魚涉及更為復雜的步驟及器官。既往研究提示，斑馬魚腎臟細胞與人類腎臟細胞存在高度同源性，通過對斑馬魚胚胎腎臟的形成、發(fā)展及病理機制的研究，可以為人類腎臟疾病發(fā)生發(fā)展起到指導作用[11]。

本文通過觀察Epo及其受體EpoR基因表達下調(diào)條件下，斑馬魚胚胎腎臟形態(tài)改變，進一步探索可能的機制及信號通路，以期了解Epo在腎臟發(fā)育及病理改變中的可能作用，并為腎臟疾病的診治提供新的靶點。

材 料 和 方 法

1 動物

采用腎臟顯像的Tg(wt1b:EGFP)品系斑馬魚。使用E3標準培養(yǎng)液(5 mmol/L NaCl、0.17 mmol/L KCl、0.33 mmol/L CaCl2和5%～10% 亞甲藍)進行斑馬魚胚胎培育，培育溫度28.5 ℃。使用0.003% 1-phenyl-2-thiourea (PTU； Sigma)抑制斑馬魚胚胎黑色素產(chǎn)生，進而在胚胎受精后48 h (48 hours post-fertilization，48 hpf)進行觀察。

2 主要試劑

Epo[12]和EpoR[13]嗎啉序列由既往研究獲得并由Gene Tools合成。使用ApopTag? Red In Situ Apoptosis Detection Kit (Millipore)進行TUNEL凋亡染色；使用Annexin V-FITC 細胞凋亡檢測試劑盒(BD)進行Annexin V凋亡染色;抗蛋白激酶B(protein kinase B, Akt)和磷酸化Akt(p-Akt)抗體購于Cell Signalling Technology。

3 主要方法

3.1斑馬魚胚胎嗎啉注射 基因下調(diào)注射用Epo及EpoR嗎啉濃度分別為4和6 g/L，使用 0.1 mol/L KCl作為溶質(zhì)進行嗎啉注射液配制。將1 nL相應(yīng)基因的嗎啉注射液在斑馬魚胚胎單細胞或雙細胞期進行注射，從而實現(xiàn)Epo及EpoR基因的下調(diào)。

3.2血紅蛋白染色 斑馬魚胚胎48 hpf分別對Epo及EpoR基因表達下調(diào)及正常對照斑馬魚進行血紅蛋白染色，即鄰聯(lián)茴香胺(o-dianisidine)染色，染色方法見既往報道[12]。

3.3TUNEL染色 斑馬魚胚胎去卵黃囊，在4 ℃新鮮配制的4% PFA/PBS中隔夜固定，其后使用PBST(1×PBS/0.1% Tween-20)清洗，使用25%、50%和75%濃度梯度甲醇溶劑進行脫水后隔夜置于-20 ℃ 100%甲醇中。次日使用75%、50%、25%濃度梯度甲醇進行水化，后在10 mg/L，蛋白酶K(Roche)中浸泡21 min。將處理后斑馬魚胚胎依照既往TUNEL染色步驟進行染色[14]。

3.4Annexin V染色及流式細胞術(shù)分析 斑馬魚胚胎在48 hpf去胚膜，在Ringer試劑(116 mmol/L NaCl、2.9 mmol/L KCl和5 mmol/L HEPES，pH 7.2)，中浸泡15 min，后在PBS中清洗2次，使用0.25%胰蛋白酶反應(yīng)15～20 min，后使用含10% 胎牛血清及2 mmol/L CaCl2的PBS溶液停止反應(yīng)。離心沉淀細胞，使用PBS清洗2次，后溶于Annexin V染色緩沖液中，加入APC熒光標記的Annexin V及7-AAD (Beckman Coulter)。使用BD FACS Canto II流式細胞儀進行流式細胞術(shù)測定。綠色熒光蛋白(green fluorescent protein,GFP)陽性細胞為斑馬魚胚胎腎臟細胞，GFP陰性細胞屬于除腎臟以外的斑馬魚其它組織。定量分析不同染色的細胞：Annexin V染色陽性、7-AAD染色陰性細胞為早期凋亡細胞；Annexin V染色陽性、7-AAD染色陽性細胞為晚期凋亡細胞；Annexin V染色陰性、7-AAD染色陰性細胞為壞死細胞。使用Epo和EpoR基因下調(diào)的斑馬魚胚胎相對對照組胚胎的細胞比進行后續(xù)量化分析。

3.5顯微鏡分析 Tg(wt1b:EGFP)品系斑馬魚胚胎去胚膜，使用0.05 % tricaine (Sigma)麻醉,使用1%低融點瓊脂固定胚胎。使用Leica DFC420 C熒光照相機進行斑馬魚腎臟免疫熒光成像，并使用TCS SP5 system (Leica)進行共聚焦顯微鏡成像。

3.6Western blot實驗 收集48 hpf斑馬魚胚胎進行蛋白提取，使用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度， Western blot實驗方法見既往報道[14]。

3.7RNA提取及real-time PCR驗證 使用RNeasy Mini Kit (Qiagen)提取斑馬魚胚胎mRNA。使用SuperScript II Kit (Invitrogen)合成cDNA。使用Roche Universal Probe Library Assay Design Center 進行實時定量PCR引物設(shè)計(https://lifescience.roche.com/en_cn/brands/universal-probe-library.html)。Epo上游引物序列為5’-TAGGACGCGCAGGTCACAGATG-3’，下游引物序列為5’-AAACCATCTGTGACCTGCGCGT-3’；EpoR上游引物序列為5’-GCAAGCTGCTTAAGCTCCAA-3’，下游引物序列為5’-AAATCAATGAGTCCCAACAGC-3’。使用β-actin作為內(nèi)參照，上游引物序列為5’-ACGGTCAGGTCATCACCATC-3’，下游引物序列為5’-TGGATACCGCAAGATTCCAT-3’。使用Roche LightCycler? 480進行PCR擴增反應(yīng)。反應(yīng)條件為：95 ℃ 2 min； 95 ℃ 1 min，55 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，共40個循環(huán)； 72 ℃ 7 min。

4 統(tǒng)計學處理

使用Leica LAS V4.8軟件進行腎臟形態(tài)量化分析,腎小球長度及頸部長度以μm為單位。用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行分析,數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標準差(mean±SD)表示。兩組間的數(shù)據(jù)比較根據(jù)數(shù)據(jù)方差齊性使用Student’st-test或Mann-WhitneyU-test進行統(tǒng)計分析，3組數(shù)據(jù)間的比較使用方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1 Epo及EpoR基因下調(diào)導致斑馬魚胚胎腎臟細胞發(fā)育異常

首先，我們使用了先前已經(jīng)驗證過的嗎啉(圖1C)，通過剪接阻斷斑馬魚Epo的表達(圖1D)，觀察Epo基因下調(diào)后斑馬魚腎臟形態(tài)改變。為了進一步確認已發(fā)表的Epo嗎啉功能，我們將4 ng的Epo嗎啉在斑馬魚胚胎單細胞期進行注射，并通過48 hpf的血紅蛋白染色證實，Epo基因下調(diào)后斑馬魚中血紅蛋白含量較對照組顯著減少(圖1A)，該實驗進一步明確了所用Epo嗎啉的有效性。接下來，我們分析了Epo基因表達下調(diào)對48 hpf斑馬魚胚胎前腎單位的形態(tài)影響。Tg(wt1b：EGFP)品系斑馬魚胚胎前腎單位可通過熒光顯微鏡對EGFP陽性細胞進行觀察記錄而獲得，在48 hpf，斑馬魚胚胎形成前腎結(jié)構(gòu)，其中包括后期融合的兩側(cè)腎小球及兩側(cè)連接在后面形成管狀結(jié)構(gòu)的頸部。我們發(fā)現(xiàn)注射Epo嗎啉導致48 hpf斑馬魚前腎單位形態(tài)改變，表現(xiàn)為腎小球長度顯著增加和頸部長度減少(P<0.01),見圖1A、B。

我們進一步探索EpoR基因表達下調(diào)是否可以導致腎臟形態(tài)發(fā)生類似改變。使用既往報道過的EpoR嗎啉(圖2C)在Tg(wt1b:EGFP)斑馬魚胚胎單細胞期進行注射，通過血紅蛋白染色證實其有效性，并在48 hpf進行熒光顯微鏡下腎臟形態(tài)觀察。研究結(jié)果提示EpoR基因表達下調(diào)(圖2D)后，48 hpf斑馬魚胚胎血紅蛋白染色較對照組減少(圖2A)，進一步證實EpoR嗎啉有效。與此同時，EpoR基因下調(diào)也導致斑馬魚前腎單位形態(tài)改變，其量化結(jié)果與Epo基因下調(diào)一致，見圖2A、B。上述結(jié)果表明，Epo通過與EpoR結(jié)合，在斑馬魚腎臟發(fā)育及維持正常腎臟形態(tài)中起到重要作用。

Figure 1.Epoknockdown resulted in kidney structure alteration in zebrafish pronephros. A: pronephros alterations and loss of hemoglobin inEpomorphants as compared with control group (white scale bar=200 μm; black scale bar ino-dianisidine staining=500 μm); B: the quantitative analysis of A in three independent experiments; C: morpholino sequence and targets ofEpo; D: the relative mRNA level of Epo inEpomorphants as compared with control group in three independent experiments. Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol group.

圖1Epo基因下調(diào)導致斑馬魚腎臟形態(tài)改變

Figure 2.EpoRknockdown resulted in kidney structure alteration in zebrafish pronephros. A: pronephros alterations and loss of hemoglobin inEpoRmorphants as compared with control group (white scale bar=200 μm; black scale bar ino-dianisidine staining=500 μm); B: the quantitative analysis of A in three independent experiments; C: morpholino sequence and targets ofEpoR; D: the relative mRNA level of EpoR inEpomorphants as compared with control group in three independent experiments. Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol group.

圖2EpoR基因下調(diào)同樣導致斑馬魚腎臟形態(tài)改變

2 Epo及EpoR基因下調(diào)引起斑馬魚腎臟凋亡及壞死細胞增多

目前數(shù)據(jù)結(jié)果提示，Epo與EpoR結(jié)合并發(fā)揮后續(xù)作用，對于斑馬魚腎臟正常形態(tài)發(fā)育起到重要作用。但是Epo和EpoR如何發(fā)揮作用保證腎臟形態(tài)正常發(fā)育尚未明確。結(jié)合既往Epo通過結(jié)合EpoR從而抑制前紅細胞凋亡相關(guān)報道[1, 4]，我們推測，Epo在腎臟細胞中同樣起到抗凋亡的作用。

使用TUNEL染色對Epo及EpoR基因敲減斑馬魚胚胎進行凋亡細胞染色。實驗結(jié)果提示Epo及EpoR基因下調(diào)后48 hpf斑馬魚胚胎體內(nèi)凋亡細胞較對照明顯增多。值得注意的是，腎臟組織的凋亡細胞較對照組亦明顯升高(P<0.01)，以上結(jié)果提示Epo與EpoR基因敲減誘導腎臟細胞凋亡，進而引起腎臟結(jié)構(gòu)形態(tài)改變，見圖3。

為了進一步證實TUNEL凋亡染色的結(jié)果，我們使用Annexin V染色并通過流式細胞術(shù)進一步篩選比較腎臟組織中凋亡細胞的比例，見圖4A。比較早期腎臟凋亡細胞(即GFP陽性、7-AAD陰性和APC-Annexin陽性細胞)比例，可發(fā)現(xiàn)Epo基因下調(diào)后早期凋亡細胞比例顯著升高，而EpoR基因下調(diào)胚胎無明顯變化，見圖4B；與此同時，晚期腎臟凋亡細胞(即GFP陽性、7-AAD陽性和APC-Annexin陽性細胞)比例在Epo和EpoR基因下調(diào)后均較對照組顯著升高，見圖4C；最后，我們進一步比較了壞死腎臟細胞(即GFP陽性、7-AAD陽性和APC-Annexin陰性細胞)比例，發(fā)現(xiàn)僅EpoR基因下調(diào)胚胎腎臟中，壞死細胞較對照組明顯升高，見圖4D。以上結(jié)果提示Epo與EpoR基因敲減均導致48 hpf斑馬魚胚胎腎臟細胞凋亡增多，但Epo基因下調(diào)主要引起早期及晚期凋亡細胞增多，EpoR基因下調(diào)則導致晚期凋亡細胞及壞死細胞增多。

3 Epo及EpoR基因下調(diào)降低Akt磷酸化水平

既往研究提示，Epo通過與EpoR結(jié)合，進而抑制PI3K/Akt信號通路，抑制Akt去磷酸化，保護前紅細胞免于細胞凋亡，從而糾正貧血[15-16]。本研究目前證實，斑馬魚前腎單位中，Epo和EpoR基因下調(diào)，同樣可導致腎臟細胞凋亡，進而引起腎臟細胞形態(tài)改變。于是我們進一步探索，Akt去磷酸化是否在Epo基因表達下調(diào)引起細胞凋亡中同樣起到作用。Western blot結(jié)果提示，Epo及EpoR基因表達下調(diào)后48 hpf斑馬魚胚胎中，p-Akt較對照組明顯減少,見圖5A。這表明Akt去磷酸化在Epo及EpoR基因敲減導致斑馬魚腎臟細胞凋亡中可能起到重要做用。

Figure 3. Knockdown ofEpoandEpoRresulted in increased apoptotic cells within pronephros in 48 hpf zebrafish embryos measured by TUNEL assay (white scale bar=100 μm). Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol group.

圖3TUNEL染色顯示Epo及EpoR基因敲減導致斑馬魚腎臟細胞凋亡

綜上所述，我們的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Epo及EpoR基因下調(diào)可引起Akt去磷酸化，進一步導致腎臟凋亡細胞增多及腎臟結(jié)果形態(tài)改變，Epo在斑馬魚腎臟發(fā)育及形態(tài)結(jié)構(gòu)中起到重要調(diào)節(jié)作用，見圖5B。

討 論

1 Epo在斑馬魚胚胎腎臟發(fā)育中的作用

本研究發(fā)現(xiàn)Epo通過抑制凋亡在斑馬魚腎臟發(fā)育及形態(tài)結(jié)構(gòu)中起到重要調(diào)節(jié)作用。本結(jié)論主要基于以下觀察結(jié)果：(1)Epo和EpoR基因表達下調(diào)引起斑馬魚胚胎的腎臟結(jié)構(gòu)和功能改變；(2)Epo和EpoR基因表達下調(diào)引起斑馬魚胚胎的腎臟凋亡及壞死細胞增多；(3)Epo和EpoR基因表達下調(diào)引起斑馬魚體內(nèi)Akt磷酸化水平降低。

Epo在既往研究中被公認為造血系統(tǒng)重要的調(diào)節(jié)因子，進來研究提示Epo與腎臟病變尤其是糖尿病腎病的發(fā)生相關(guān)，Epo的單核苷酸多態(tài)性遺傳改變在糖尿病腎病發(fā)生發(fā)展中產(chǎn)生一定影響[17]。又有研究指出，糖尿病腎病小鼠中持續(xù)給予EpoR激動劑，可明顯減少腎臟細胞凋亡和壞死的數(shù)量[8]。然而，以上研究僅闡明了補充Epo或刺激Epo受體，可能起到保護腎臟功能的作用，并未進一步闡明Epo與腎臟病變的直接關(guān)系。本研究中，通過下調(diào)Epo及EpoR基因的表達，我們發(fā)現(xiàn)Epo表達下調(diào)可直接引起斑馬魚腎臟形體改變，Epo通過結(jié)合EpoR，誘導Akt去磷酸化，進而導致腎臟細胞凋亡壞死，并直接導致斑馬魚胚胎腎臟形態(tài)改變。其次，由于Epo主要在人類腎間質(zhì)細胞中產(chǎn)生，傳統(tǒng)觀點通常認為Epo濃度降低是終末期腎衰竭的結(jié)果[15]。然而，我們的研究同時表明，低濃度Epo是腎臟結(jié)構(gòu)惡化的直接原因。通過觀察Epo及EpoR基因下調(diào)的斑馬魚腎臟形態(tài)，我們發(fā)現(xiàn)，Epo及EpoR表達下降可直接引起腎臟形態(tài)改變。在機制上，我們證明在斑馬魚整個胚胎以及前腎單位中，均檢測到增加的凋亡細胞。以上結(jié)果提示Epo表達下調(diào)不僅是腎臟病變的結(jié)果，同時也是腎功能受損的原因。在終末期腎衰竭中，腎功能不全引起Epo水平下降，可能進而導致腎臟功能進一步下降，形成雙向調(diào)節(jié)作用。

Figure 4. Knockdown ofEpoandEpoRincreased apoptotic and necrotic cells in different patterns within pronephros in 48 hpf zebrafish embryos analyzed by flow cytometry with Annexin V staining. A: the images of flow cytometry analysis with Annexin V staining forEpoandEpoRmorphants as compared with control group; B: the quantitative analysis of early apoptotic cells in three independent experiments; C: the quantitative analysis of late apoptotic cells in three independent experiments； D: the quantitative analysis of necrotic cells in three independent experiments. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group.

圖4Epo和EpoR基因下調(diào)在斑馬魚腎臟細胞凋亡和壞死中起到不同作用

此外，Annexin V染色結(jié)果提示，Epo及EpoR基因敲減在細胞早期凋亡、晚期凋亡及壞死中起到不同作用：Epo基因敲減主要引起斑馬魚胚胎腎細胞早期及晚期凋亡，而EpoR基因敲減主要引起腎細胞晚期凋亡及壞死。既往研究指出，循環(huán)中Epo與靶細胞表面Epo受體結(jié)合，并發(fā)揮其后續(xù)作用，因此，EpoR基因敲減導致腎臟細胞凋亡壞死，可能早于Epo發(fā)揮作用。

Figure 5. Knockdown ofEpoandEpoRdecreased Akt phosphorylation and overall schematic illustration. A: decreased Akt phosphorylation uponEpoandEpoRknockdown shown by Western blot; B: schematic illustration that Epo and EpoR maintain kidney structure and function through repressing apoptosis.

圖5Epo和EpoR基因下調(diào)減弱斑馬魚Akt磷酸化及機制假設(shè)

2 斑馬魚作為生物模型對胚胎期腎臟形態(tài)進行觀察

本研究成功使用斑馬魚作為生物模型生物，通過對腎臟結(jié)構(gòu)進行胚胎期的形態(tài)觀察，進一步分析腎臟疾病發(fā)病機制。與其它模型生物相比，斑馬魚具有胚胎身體透明可視化程度高、與人類基因組相似度高，以及易于基因表達操縱等特點[10]。胚胎受精后48～72 h，斑馬魚前腎單位由單一的兩個腎小球組成，并與雙側(cè)腎小管連接，形成基本的腎單位。斑馬魚胚胎腎臟的結(jié)構(gòu)簡單，但與人類腎單位具有一致性及同源性，這一特點使得斑馬魚的腎臟研究具有結(jié)構(gòu)簡單、觀察便捷、便于對活體胚胎腎臟進行形態(tài)觀察等特點[11]。此外，本研究通過對斑馬魚的腎小球及腎小管的長度記錄比較，提供了一種斑馬魚腎臟形態(tài)量化分析的新手段。

綜上所述，本研究通過觀察Epo及EpoR基因下調(diào)條件下斑馬魚胚胎腎臟的形態(tài)改變，提出Epo及EpoR可直接引起斑馬魚腎臟結(jié)構(gòu)發(fā)育異常，進一步研究發(fā)現(xiàn)，Akt去磷酸化增強引起腎臟細胞凋亡增多可能起到重要作用。本研究為Epo的造血系統(tǒng)以外作用提供了新的證據(jù)支持，并提示阻止Epo表達下調(diào)可能是治療腎臟疾病的新靶點。

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