不同酶制劑對鹵蟲體長、死亡率和干質(zhì)量的影響

古倩怡， 周天成， 李袁源， 何 凱， 李洪武， 張利平， 李仕平

(1.海南大學(xué)/南海海洋資源利用國家重點實驗室，海南?？?570228； 2.中國科學(xué)院大學(xué)，北京 100049；3.?？诳破飞锟萍加邢薰?，海南?？?570208； 4.海南省?？谑兴a(chǎn)技術(shù)推廣站，海南?？?570125)

酶制劑可分為單一酶制劑和復(fù)合酶制劑，作為一種生物活性物質(zhì)廣泛應(yīng)用于畜牧業(yè)、農(nóng)業(yè)，越來越多的人發(fā)現(xiàn)酶制劑具有發(fā)展?jié)摿Γ瑢⑵鋺?yīng)用于水產(chǎn)動物養(yǎng)殖，取得了良好成效[1-5]。酶制劑不僅能促進營養(yǎng)物質(zhì)的分解和消化，還能提高餌料利用率，最重要的是酶制劑的加入能夠有效改善水產(chǎn)動物的健康狀態(tài)，可以在一定程度上降低水體中N、P等元素的濃度，加速排泄物中不良消化物的分解，起到凈化水體的作用[6-9]。鹵蟲(Artemiasalina)是一種較為低等的甲殼類動物，主要以水中的浮游藻類和細小碎屑為食，最適溫度22～28 ℃，富含蛋白質(zhì)和脂肪酸，是水產(chǎn)養(yǎng)殖產(chǎn)品的優(yōu)質(zhì)活餌料，也是許多水產(chǎn)養(yǎng)殖產(chǎn)品幼體理想的開口餌料，具有廣闊的應(yīng)用前景[10]。在培養(yǎng)鹵蟲時加入酶制劑，雖然一定程度上提高了經(jīng)濟成本，但能夠有效地改善鹵蟲生活水體的環(huán)境，提高鹵蟲的免疫能力，而且利用鹵蟲飼養(yǎng)的魚類及其他水產(chǎn)經(jīng)濟作物的免疫能力和健康情況等也能夠獲得相應(yīng)的提升，既能抑制抗生素濫用的情況，又能實現(xiàn)生態(tài)效益和經(jīng)濟效益的最優(yōu)化，形成良性循環(huán)[11-12]。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 葡萄糖氧化酶制劑母液的制備 稱取10.00 g葡萄糖氧化酶制劑，溶于少量水中，全量移至100 mL容量瓶，稀釋至標(biāo)線，混勻后盛于聚乙烯瓶，得100 g/L葡萄糖氧化酶母液，置于冰箱冷藏備用。

1.1.2 復(fù)合酶制劑母液的制備 稱取10.00 g復(fù)合酶制劑，溶于少量水中，全量移至100 mL容量瓶，稀釋至標(biāo)線，混勻后盛于聚乙烯瓶，得100 g/L復(fù)合酶母液，置于冰箱冷藏備用。

1.1.3 藻類的培養(yǎng) 本試驗飼養(yǎng)鹵蟲投喂的餌料為小球藻，藻類培養(yǎng)液為寧波3號培養(yǎng)液[13]，海水經(jīng)高溫消毒滅菌。

1.1.4 鹵蟲的培養(yǎng) 利用0.005%高錳酸鉀溶液消毒孵化培養(yǎng)容器，再用滅菌海水沖洗浸泡，然后在孵化培養(yǎng)裝置里加入經(jīng)高溫滅菌的天然海水。加入適量鹵蟲卵，孵化溫度為 25 ℃，pH值為7～8，自然光照，曝氣24 h，即可得到孵化出的鹵蟲幼體。迅速將鹵蟲幼體轉(zhuǎn)移至新鮮海水，投喂小球藻[14]。

1.2 試驗方法

在每組試驗中，將2 000 mL天然海水加入3 000 mL燒杯，每個燒杯內(nèi)投放培養(yǎng)的1日齡鹵蟲幼體密度為 0.2 ind./mL(即每個燒杯內(nèi)有400頭鹵蟲幼體)。培養(yǎng)溫度為25 ℃，pH值為7～8，自然光照，每天定時投餌，定期清理燒杯底部沉淀并換水，避免影響水質(zhì)，每次試驗周期為21 d[15]。

1.2.1 不同酶制劑對鹵蟲體長的影響 結(jié)合臺微尺計算目微尺每格所代表的實際長度。每次換水時隨機取10頭鹵蟲，用魯戈氏液染色固定后制片，在帶有目微尺的光學(xué)生物顯微鏡(北京泰克儀器SA 3000)下測量體長，計算各個時期鹵蟲體長，直至形成性成熟(21日齡)[16]。

1.2.2 不同酶制劑對鹵蟲死亡率的影響 每次換水前停止充氣30 min，待死亡鹵蟲尸體和碎屑沉底后將其吸出，記錄死亡鹵蟲數(shù)量，計算鹵蟲的存活率[17]。

1.2.3 不同酶制劑對鹵蟲干質(zhì)量的影響 每次換水時隨機取10頭鹵蟲，用濾紙吸干并烘干，用分析天平[賽多利斯科學(xué)儀器(北京)LA230S型]稱量其質(zhì)量，計算各個時期鹵蟲的增質(zhì)量，直至性成熟(21日齡)[18]。

1.3 試驗時間和地點

2016年2月在海南大學(xué)海洋學(xué)院二樓開展試驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同酶制劑對鹵蟲體長的影響試驗

定期測量鹵蟲體長，直至鹵蟲21日齡，記錄試驗結(jié)果，根據(jù)鹵蟲體長測量結(jié)果繪制體長變化曲線圖(圖1)。與空白組相比，加酶組鹵蟲受酶影響較大，體長大部分有顯著增加，有87.5%鹵蟲的體長有顯著提高，但2.0 g/L復(fù)合酶制劑組呈現(xiàn)出對鹵蟲體長的抑制作用；葡萄糖酶制劑組與復(fù)合酶制劑組相比，復(fù)合酶制劑組的試驗效果較好，1.0 g/L復(fù)合酶制劑組試驗效果最佳，對鹵蟲體長促進效果最優(yōu)，0.5 g/L復(fù)合酶制劑組試驗效果次之。試驗初期(7日齡前)各組對比不明顯，從試驗中期(7日齡后)開始各試驗組間對比明顯，試驗后期(14日齡后)各組對比顯著，并且1.0 g/L復(fù)合酶制劑對鹵蟲體長的促進作用效果最為顯著。

2.2 不同酶制劑對鹵蟲死亡率的影響

定期吸取各組的底部碎屑與死亡鹵蟲尸體，記錄鹵蟲死亡數(shù)量，計算鹵蟲存活率并繪制存活率曲線圖(圖2)?？瞻捉M與各加酶組的死亡率走勢大體相同，呈下降趨勢。但各組受影響差異程度較大，有的試驗組效果顯著，極大降低了鹵蟲死亡率；有的試驗組鹵蟲的死亡率提高近1/2。葡萄糖氧化酶制劑組總體表現(xiàn)較優(yōu)，對鹵蟲死亡率均有不同程度的作用，復(fù)合酶制劑組雖有2組的死亡率遠高于空白組，但另外2組復(fù)合酶制劑的死亡率是各試驗組中最低的，且1.0 g/L復(fù)合酶制劑組死亡率低至17.37%，死亡率減少近1/3，效果顯著。

2.3 不同酶制劑對鹵蟲干質(zhì)量的影響試驗

烘干后稱量鹵蟲的干質(zhì)量并記錄，根據(jù)干質(zhì)量結(jié)果繪制柱形圖(圖3)，對比空白組與各試驗組的21日齡鹵蟲干質(zhì)量。與空白組相比，加酶組鹵蟲干質(zhì)量增加顯著，87.5%鹵蟲干質(zhì)量增長顯著；與空白組對比，各葡萄糖氧化酶制劑組均呈顯著增長，其中1.5 g/L葡萄糖酶制劑組在葡萄糖氧化酶制劑組表現(xiàn)最優(yōu)，干質(zhì)量達14.9 mg；復(fù)合酶制劑組中，1.5 g/L復(fù)合酶制劑組表現(xiàn)最優(yōu)，干質(zhì)量達16.9 mg，但2.0 g/L復(fù)合酶制劑組干質(zhì)量略低于空白組?？傮w而言，葡萄糖氧化酶制劑組整體表現(xiàn)優(yōu)于復(fù)合酶制劑組，但復(fù)合酶制劑組在一定濃度下提高干質(zhì)量效果顯著，1.0 g/L復(fù)合酶制劑組21日齡鹵蟲質(zhì)量達16.9 mg。

3 討論與結(jié)論

3.1 酶制劑中酶含量對試驗效果的影響

酶具有高效性，在低濃度下能夠發(fā)揮較高的催化效率，實現(xiàn)能量的轉(zhuǎn)化[19]。酶制劑為粗酶，酶含量較少，制作過程中為了便于運輸和儲存，摻雜了許多成分如糊精等，降低了酶制劑中的有效成分——酶的含量，從而導(dǎo)致試驗用酶制劑濃度偏高[20-21]。研究發(fā)現(xiàn)，酶制劑濃度從10 mg/L開始，鹵蟲體長、干質(zhì)量和死亡率等均受各組酶制劑的作用產(chǎn)生些許變化，為探究試驗酶制劑最適濃度，在濃度的選擇上也稍高。酶制劑濃度越高，成本越高，但從實際產(chǎn)出的角度出發(fā)，適度地提高酶制劑的濃度，才能夠達到更為理想的生產(chǎn)效果、實現(xiàn)產(chǎn)出的最優(yōu)化。

3.2 酶制劑對鹵蟲的作用機制

酶具有專一性，對特定的底物產(chǎn)生催化作用。復(fù)合酶在促進體長、干質(zhì)量和降低死亡率方面，較葡萄糖氧化酶而言，表現(xiàn)更為理想。復(fù)合酶制劑含有蛋白酶、淀粉酶、纖維素酶、木聚糖酶、β-葡聚糖酶等，葡萄糖氧化酶制劑只含有1種酶，即葡萄糖氧化酶。經(jīng)過觀察發(fā)現(xiàn)，孵化初期的鹵蟲消化道較短小，發(fā)育不夠完善，其體內(nèi)的消化酶較少，對小球藻的轉(zhuǎn)化利用率較低，所以早期各組鹵蟲的體長和干質(zhì)量并無較大差別。自中期開始至試驗結(jié)束，鹵蟲在各濃度酶制劑作用下體長、干質(zhì)量和存活率有顯著差異?？赡苁且驗辂u蟲從中期開始，腸道漸漸發(fā)育完全，小球藻含有大量淀粉、蛋白質(zhì)和纖維素，復(fù)合酶制劑的加入補充解決了多種內(nèi)源性消化酶分泌不足的問題，而復(fù)合酶制劑只能針對性地解決1種，從而最大程度提高營養(yǎng)成分的利用效率，提高復(fù)合酶制劑組鹵蟲的體長和干質(zhì)量[22-24]。2種酶制劑不同程度上都具有提高鹵蟲的免疫力、抗病能力和存活率，實踐應(yīng)用和科學(xué)研究應(yīng)根據(jù)相應(yīng)的需求選擇對應(yīng)的酶制劑以獲得理想的效果。

參考文獻：

[1]柴仙琦，冷向軍，張 民，等. 酶制劑在水產(chǎn)飼料中的應(yīng)用及研究進展[J]. 飼料工業(yè)，2014，2(2)：33-36.

[2]Talpur A D，Ikhwanuddin M，Abdullah M D D，et al. IndigenousLactobacillusplantarumas probiotic for larviculiture of blue swimming crab，Portunuspelagicus(Linnaeus，1758)：effects on survival，digestive enzyme activities and water quality[J]. Aquaculture，2013，416/417(2)：173-178.

[3]鐘國防，韓 斌，華雪銘，等. 暗紋東方鲀對幾種蛋白質(zhì)原料表觀消化率及酶制劑對其消化能力的影響[J]. 上海海洋大學(xué)學(xué)報，2012，21(2)：241-246.

[4]余豐年，王道尊，徐洪杰. 纖維素酶對團頭魴生長及飼料利用的影響[J]. 上海水產(chǎn)大學(xué)學(xué)報，2001，10(1)：90-92.

[5]任鳴春，賈文錦，戈賢平，等. 飼料不同淀粉水平對團頭魴成魚生長性能、消化酶活性及肌肉成分的影響[J]. 水產(chǎn)學(xué)報，2014，38(9)：1494-1502.

[6]周克勇，劉長忠，黃 建. 益生素和酶制劑組合使用對鯉魚生長性能影響的研究[J]. 淡水漁業(yè)，2000(12)：37-40.

[7]劉文斌. 飼料酶在水產(chǎn)動物中的應(yīng)用研究[J]. 中國飼料，2001(13)：18-19.

[8]馮定遠，黃燕華. 水產(chǎn)動物酶制劑特殊性與技術(shù)體系的建立[J]. 飼料工業(yè)，2011，32(8)：1-4.

[9]王仁華，劉曉蘭，王琤韡. 水產(chǎn)動物纖維素酶的應(yīng)用研究[J]. 飼料研究，2011(12)：62-64.

[10]Serdakowski A L，Dordick J S. Enzyme activation for organic solvents made easy[J]. Trends in Biotechnology，2008，26(1)：48-54.

[11]Solorzano Y，Teresa V M，Lopez L M，et al. Response of newly hatched octopus bimaculoides fed enrichedArtemiasalina：growth performance，ontogeny of the digestive enzyme and tissue amino acid content[J]. Aquaculture，2009，289(1/2)：84-90.

[12]羅國芝，姚妙蘭，魯 璐，等. 利用循環(huán)水養(yǎng)殖固體廢棄物進行鹵蟲幼體營養(yǎng)強化的效果研究[J]. 上海海洋大學(xué)學(xué)報，2015，24(3)：350-356.

[13]李洪武，宋培學(xué). 海洋浮游生物學(xué)[M]. 2版.合肥：中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)出版社，2015：168-171.

[14]潘 茜，葉金云，陳建明. 不同飼料對南京豐年蟲生長和生殖的影響[J]. 淡水漁業(yè)，2006(1)：36-38.

[15]公 晗，孔凡洲，王云峰，等. 秦皇島海域“褐潮”海水對鹵蟲、輪蟲存活和攝食的影響研究[J]. 海洋科學(xué)，2015，39(4)：30-36.

[16]Hamza F，Vaidya A，Apte M，et al. Selenium nanoparticle-enriched biomass ofYarrowialipolyticaenhances growth and survival ofArtemiasalina[J]. Enzyme and Microbial Technology，2017，106：48-54.

[17]Marcoval M A，Pan J，Tang Y Z，et al. The ability of the branchiopod，Artemiasalina，to graze upon harmful algal blooms caused byAlexandriumfundyense，Aureococcusanophagefferens，andCochlodiniumpolykrikoides[J]. Estuarine Coastal and Shelf Science，2013，131(11)：235-244.

[18]Katan T，Nash G W，Rise M L，et al. A little goes long way：improved growth in Atlantic cod (Gadusmorhua) fed small amounts of wild zooplankton[J]. Aquaculture，2016，451：271-282.

[19]馮定遠，譚會澤，王修啟，等. 飼用酶制劑作用的分子營養(yǎng)學(xué)機理與加酶日糧ENIV系統(tǒng)的分子生物學(xué)基礎(chǔ)[J]. 飼料工業(yè)，2006(24)：1-6.

[20]禹慧明，林 勇，徐有良，等. 酶制劑的特點與質(zhì)量評價[J]. 中國飼料，2002(14)：14-16.

[21]李 敬，李曉潔，宮 官，等. 如何評價酶制劑在飼料行業(yè)中的應(yīng)用效果[J]. 飼料工業(yè)，2017，38(4)：21-24.

[22]董黎明，汪 蘋，李金穗，等. 異養(yǎng)小球藻主要營養(yǎng)成分及氨基酸組成分析[J]. 食品科學(xué)，2012，33(3)：232-237.

[23]陳 勇，張慧玲. 酶制劑的促生長機理[J]. 中國飼料，1999(21)：21-22.

[24]汪 儆. 飼用酶制劑的作用機制[J]. 飼料工業(yè)，2001(11)：1-3.