水稻蛋白酶抑制劑基因OsLTPL164和OsLTPL151的組成型及誘導(dǎo)型表達(dá)模式

何雨娟，鞠迪，王悅，楊雪清，王小奇

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水稻蛋白酶抑制劑基因和的組成型及誘導(dǎo)型表達(dá)模式

何雨娟，鞠迪，王悅，楊雪清，王小奇

（沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院/遼寧省經(jīng)濟(jì)與應(yīng)用昆蟲重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，沈陽 110866）

【目的】蛋白酶抑制劑（protease inhibitor, PI）是一類廣泛存在于植物中的蛋白質(zhì)，具有抵御植食性昆蟲取食危害的功能。然而，水稻（）PI基因在二化螟（）取食過程中的表達(dá)模式尚不清楚。本研究旨在分析水稻蛋白酶抑制劑基因和在二化螟取食及機(jī)械損傷下的表達(dá)模式，為明確和在水稻防御二化螟中的作用及今后利用這兩個(gè)基因構(gòu)建轉(zhuǎn)基因水稻株系打下基礎(chǔ)?！痉椒ā恳詵|北地區(qū)常規(guī)種植的3個(gè)水稻品系遼鹽2號（1654）、遼星17號（1665）和長白17號（1688）為研究對象，在二化螟危害關(guān)鍵時(shí)期（分蘗期）通過機(jī)械損傷和接蟲處理，在處理后不同時(shí)間（0、3、6、12、24、48、72 h）分別對根、莖、葉3個(gè)組織進(jìn)行取樣，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-qPCR）檢測3個(gè)水稻品系中和的表達(dá)模式?！窘Y(jié)果】在3個(gè)品系中的組織表達(dá)模式一致，在葉片和莖中的表達(dá)量均高于根部；在3個(gè)品系中的組織表達(dá)模式不一致，在1654品系中莖和葉片中的表達(dá)量顯著高于根部，但在1688和1665品系中根部的表達(dá)量顯著高于莖和葉片；此外，這兩個(gè)基因在3個(gè)品系間的相同組織中都有不同的表達(dá)模式，在根、莖、葉中均呈現(xiàn)在1665品系中表達(dá)量最高、在1688品系中表達(dá)量次之、在1654品系中表達(dá)量最低的表達(dá)模式，但在不同組織中的表達(dá)模式與不同：在根中，在1665品系中的表達(dá)量明顯高于1688和1654品系；在莖中，在1654和1665品系中的表達(dá)量明顯高于1688品系；在葉中，在1654品系中的表達(dá)量明顯高于1665和1688品系。二化螟取食誘導(dǎo)和在3個(gè)品系的葉片中表達(dá)上調(diào)幅度高于莖和根，且在1665品系中上調(diào)的幅度較1688和1654品系中大。在二化螟取食和機(jī)械損傷處理不同時(shí)間后，兩個(gè)基因均呈現(xiàn)表達(dá)水平先上升后下降再上升的趨勢；和在機(jī)械損傷6 h后才被顯著誘導(dǎo)表達(dá)，而二化螟取食3 h后便可誘導(dǎo)和上調(diào)表達(dá)?！窘Y(jié)論】和在3個(gè)水稻品系中二化螟取食以及機(jī)械損傷均能誘導(dǎo)其表達(dá)，推測這兩個(gè)基因可能與水稻抗二化螟有關(guān)，但這兩個(gè)基因在不同水稻品系中其他具體的功能可能有所不同。

蛋白酶抑制劑；二化螟；防御；誘導(dǎo)表達(dá)；RT-qPCR

0 引言

【研究意義】二化螟（）屬于鱗翅目螟蛾科，是我國水稻上危害最為嚴(yán)重的常發(fā)性害蟲之一，年發(fā)生面積約1 000萬公頃，造成的總經(jīng)濟(jì)損失達(dá)億元[1]。該蟲鉆蛀危害，在分蘗期危害水稻可造成枯鞘、枯心苗；在穗期危害造成蟲傷株和白穗[2]。在我國，二化螟分布較廣，北達(dá)黑龍江南至海南島均有分布[3]。當(dāng)前，防治水稻二化螟仍主要依賴于化學(xué)殺蟲劑，但由于該蟲具鉆蛀危害的特性，難以對其進(jìn)行有效防治。此外，當(dāng)前防治策略的單一性，導(dǎo)致害蟲對新藥產(chǎn)生抗藥性的速度加快，施藥劑量因而逐漸加大[2]。因此，研發(fā)對環(huán)境友好的非化學(xué)防控新技術(shù)成為當(dāng)前更有效、更安全地防治農(nóng)作物害蟲的主要趨勢?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】近年來，利用基因工程技術(shù)進(jìn)行害蟲防治已得到快速發(fā)展，并已被用于二化螟[4-6]、大螟（）[4]、水稻象鼻蟲（）[7]、褐飛虱（）[8]和白背飛虱（）[8]等害蟲的防治。其中，運(yùn)用較多的有蛋白酶抑制劑基因（protease inhibitor，PI）[9-10]。蛋白酶抑制劑是一類低分子量的多肽或蛋白質(zhì)，廣泛存在于生物體內(nèi)[11]。在植物中，PI通過與昆蟲消化道內(nèi)的蛋白消化酶形成復(fù)合物，阻斷或削弱蛋白酶的水解作用，引起昆蟲體內(nèi)蛋白酶的過量產(chǎn)生，造成昆蟲體內(nèi)必需氨基酸的缺失，從而達(dá)到抗蟲效果[12]。PI一般包括絲氨酸蛋白酶抑制劑、半胱氨酸蛋白酶抑制劑、天冬氨酸蛋白酶抑制劑、金屬蛋白酶抑制劑、谷物胰蛋白酶抑制劑/-淀粉酶抑制劑5個(gè)亞族[11,13]。其中，以絲氨酸蛋白酶抑制劑和半胱氨酸蛋白酶抑制劑應(yīng)用較廣泛。絲氨酸蛋白酶抑制劑主要具有抑制鱗翅目昆蟲消化蛋白酶的能力，而半胱氨酸蛋白酶抑制劑則主要具有抑制鞘翅目和半翅目昆蟲消化蛋白酶的能力[13]。在水稻中的研究表明，絲氨酸蛋白酶抑制劑和半胱氨酸蛋白酶抑制劑可以明顯地抑制植食性昆蟲的生長和發(fā)育[14]。自Hilder等[15]首次將豇豆（）絲氨酸蛋白酶抑制劑亞家族的胰蛋白酶抑制劑基因轉(zhuǎn)入煙草并獲得轉(zhuǎn)基因抗蟲植株以來，利用轉(zhuǎn)PI基因進(jìn)行害蟲防治取得了很大的進(jìn)展。轉(zhuǎn)的稻株能增強(qiáng)對鉆蛀性害蟲二化螟及大螟的抗性[4]；將編碼大麥（）胰蛋白酶抑制劑的基因轉(zhuǎn)入水稻種子，水稻象鼻蟲取食后，存活率顯著低于對照[7]。轉(zhuǎn)半胱氨酸蛋白酶抑制劑基因的水稻能顯著抑制南方根結(jié)線蟲（）的產(chǎn)卵量[16]。因此，研究植物PI基因的功能，對利用這些基因進(jìn)行害蟲防治具有重要意義[5]。非特異性脂質(zhì)轉(zhuǎn)移蛋白（non-specific lipid transfer protein，nsLTP）是基因工程防治技術(shù)關(guān)注的另外一類重要的植物防御蛋白。現(xiàn)已證明轉(zhuǎn)大麥的馬鈴薯（）可以抵抗病原菌的侵害[17]。小麥（）已被證實(shí)具有防御病原真菌的作用[18]。在水稻中，在受到病原菌侵染和機(jī)械損傷后，在盾片細(xì)胞中被誘導(dǎo)表達(dá)，表明該基因參與水稻防御功能[19]；水稻仔苗受鹽脅迫6 h后，上調(diào)表達(dá)419倍，表明該基因與鹽脅迫應(yīng)答相關(guān)[20]。由于與nsLTP在結(jié)構(gòu)上的相似性，一些nsLTP基因也被歸在PI家族中[21]。其中一些nsLTP基因同時(shí)具有PI和nsLTP兩個(gè)家族的功能[22-23]。中國水稻數(shù)據(jù)網(wǎng)（http://www.ricedata.cn/gene/）顯示，已知的編碼水稻nsLTP蛋白的基因有52個(gè)；其中，由于結(jié)構(gòu)上與nsLTP明顯不同，已被移出nsLTP家族[21]，現(xiàn)歸為PI家族的谷物胰蛋白酶抑制劑/-淀粉酶抑制劑亞族；編碼type II型LTP（LTP2），也屬于蛋白酶抑制劑基因。不同植物的PI和nsLTP基因具有不同的組織表達(dá)模式，可能與它們的生物學(xué)功能有關(guān)。例如，谷子（）脂質(zhì)轉(zhuǎn)移蛋白僅在莖、葉和穗中表達(dá)[24]。水稻在花藥中表達(dá)水平最高，而在種子和根中不表達(dá)[25]。此外，PI和nsLTP基因經(jīng)常受機(jī)械損傷和有害生物誘導(dǎo)表達(dá)。Green等[26]研究發(fā)現(xiàn)，在遭受機(jī)械損傷或馬鈴薯甲蟲（）危害后，馬鈴薯和番茄（）葉片中蛋白酶抑制劑含量大幅度提高，這是誘導(dǎo)植物產(chǎn)生蛋白酶抑制劑的首次報(bào)道。丹參（）的表達(dá)水平受病原菌和茉莉酸甲酯的誘導(dǎo)，表明該基因在植物防御反應(yīng)中具有一定的作用[27]。在小麥中，小麥癭蚊（）幼蟲危害和機(jī)械損傷均可誘導(dǎo)小麥表達(dá)上調(diào)[9-10]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)顯示水稻蛋白酶抑制劑基因和在二化螟取食24 h后表達(dá)量明顯上調(diào)，推測這兩個(gè)基因可能具有防御二化螟的作用。然而，和在不同組織中的表達(dá)模式以及二化螟取食誘導(dǎo)和受機(jī)械損傷后的表達(dá)模式尚不明確?！緮M解決的關(guān)鍵問題】以東北地區(qū)常規(guī)種植的遼鹽2號（1654）、遼星17號（1665）和長白17號（1688）3個(gè)水稻品系為試材，在分蘗期進(jìn)行人工接種二化螟和機(jī)械損傷處理，研究和在3個(gè)品系間的組織表達(dá)和誘導(dǎo)表達(dá)模式，為今后利用這兩個(gè)基因構(gòu)建轉(zhuǎn)基因水稻株系打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試?yán)ハx：二化螟卵由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所廊坊試驗(yàn)基地饋贈(zèng)。卵在室內(nèi)人工氣候箱（Panasonic品牌，型號MLR-352H-PC）中孵育，條件為溫度（26±2）℃，相對濕度70%±5%，光周期16L﹕8D，光照強(qiáng)度2 000 lx。初孵幼蟲（1 d）用于試驗(yàn)。

供試水稻：1688、1665、1654品系由沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)水稻研究所提供。

1.2 水稻種植與處理

1.2.1 水稻種植 2017年4月14日，對水稻進(jìn)行浸種、催芽，催芽溫度為（26±2）℃；4月21日，對已浸種萌發(fā)的種子進(jìn)行播種育苗；5月20日，在沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)水稻田進(jìn)行插秧。每個(gè)水稻品種栽10行，每行10穴，每穴一株，株行距為16.7 cm×26.6 cm；3個(gè)品種間各設(shè)一行作為保護(hù)行。整個(gè)生育期不施任何殺蟲劑，其他田間管理正常進(jìn)行。在水稻分蘗盛期進(jìn)行二化螟接蟲處理和機(jī)械損傷處理。

1.2.2 二化螟接蟲處理 參照周祖銘[28]和王悅等[2]的接蟲方法，于6月30日對正值分蘗盛期的水稻按照蟲﹕苗=1﹕1的比例進(jìn)行人工接蟲。用小號軟頭毛筆將二化螟初孵幼蟲接于水稻莖稈與第二葉或第三葉葉鞘之間的葉舌處。試驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)，每個(gè)重復(fù)接蟲7株，每株一頭。為確保試蟲不會(huì)轉(zhuǎn)株至相鄰水稻植株上，以及田間其他有害生物的干擾，接蟲后在每株水稻上加蓋一個(gè)40目的網(wǎng)籠。接蟲不同時(shí)間（0、3、6、12、24、48、72 h）后，分別剪取水稻的根、莖和葉，用鋁箔紙包裹，立即浸入液氮速凍后，帶回實(shí)驗(yàn)室于-80℃超低溫冰箱中保存。以不接蟲的健康水稻植株（0 h）相應(yīng)組織為對照。

1.2.3 機(jī)械損傷處理 在靠近水稻莖稈基部2—3 cm處的兩側(cè)，用昆蟲針（直徑0.32 mm）少力均勻地刺200次。試驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)，每個(gè)重復(fù)選取7株。為確保試驗(yàn)的準(zhǔn)確性，機(jī)械損傷后在植株上加蓋一個(gè)40目的網(wǎng)籠。損傷不同時(shí)間（0、3、6、12、24、48、72 h）后，分別剪取水稻的根、莖和葉，用鋁箔紙包裹，立即浸入液氮速凍后，帶回實(shí)驗(yàn)室于-80℃超低溫冰箱中保存。以不針刺的健康水稻植株（0 h）相應(yīng)組織為對照。

1.3 引物設(shè)計(jì)與合成

使用Primer3在線工具（http://bioinfo.ut.ee/ primer3-0.4.0/）設(shè)計(jì)和的實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-qPCR）引物。根據(jù)李冉等[29]篩選的內(nèi)參基因和，結(jié)合本試驗(yàn)的水稻材料，測得的cq值不穩(wěn)定，最終選取較穩(wěn)定的和作為內(nèi)參基因。本試驗(yàn)所用引物由上海生工生物工程股份有限公司合成，引物序列見表1。

表1 RT-qPCR所用基因引物

1.4 總RNA抽提及cDNA第一鏈的合成

根據(jù)Plant RNA Kit（Omega）提取試劑盒的說明書步驟提取RNA。稱取100 mg水稻組織，放入用DEPC水處理過的研缽中研磨，此過程中不斷加入液氮；充分研磨后，將干粉裝入1.5 ml無RNase的離心管中，添加600 μL RB buffer/10 μL-巰基乙醇，充分振蕩混勻后，14 000 r/min（4℃）離心5 min；按照說明書逐步提取，提取完成后使用微量分光光度計(jì)Nano Drop 2000c（Thermo Fisher Scientific）檢測OD260/OD280是否在1.8—2.2范圍內(nèi)，保證所提取的RNA樣品的濃度和純度，然后再利用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)一步檢測其完整性。將檢測合格的總RNA保存于-80℃冰箱備用或立即進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。選用TaKaRa公司的PrimeScriptTMRT regent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成第一條鏈cDNA，試驗(yàn)全程使用RNase離心管，反應(yīng)液的配置均在冰上完成并按照說明書逐步進(jìn)行，合成cDNA保存于-20℃或立即進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

用美國伯樂公司生產(chǎn)的CFX96熒光實(shí)時(shí)定量PCR儀檢測目的基因和的表達(dá)水平。RT-qPCR反應(yīng)體系：在20 μL的反應(yīng)體系中依次加入7.4 μL ddH2O、1.0 μL cDNA模板、上下游引物（10 μmol·L-1）各0.8 μL、10 μL SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ。RT-qPCR反應(yīng)條件：預(yù)變性反應(yīng)：95℃ 30 s；PCR反應(yīng)：95℃ 5 s，60℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)。此外再加上RT-qPCR儀器自帶的熔解步驟，保證熔解曲線為平滑的單峰且峰值單一，無雜峰。每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)重復(fù)，以不加cDNA模板作為陰性對照。目標(biāo)基因表達(dá)量采用2-ΔΔCt方法計(jì)算。

1.6 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS17.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，和在3個(gè)水稻品系中的組成型表達(dá)分析采用One-way ANOVA（＜0.05），二化螟取食和機(jī)械損傷誘導(dǎo)表達(dá)分析采用交叉分組的兩因素有重復(fù)觀察值方差分析（＜0.05，Duncan test）。

2 結(jié)果

2.1 OsLTPL164在3個(gè)水稻品系中的組成型表達(dá)譜分析

1688品系的莖和葉中表達(dá)水平顯著高于根（圖1-a），在1654品系中表達(dá)水平依次為莖＞葉＞根（圖1-b），在1665品系中莖中的表達(dá)水平顯著高于根（圖1-c）。

在根（圖2-a）、莖（圖2-b）和葉（圖2-c）中，在3個(gè)水稻植株之間的表達(dá)差異顯著（＜0.05），該基因在1665品系中表達(dá)量最高，在1688品系中表達(dá)量次之，在1654品系中表達(dá)量最低。

A：1688；B：1654；C：1665。數(shù)據(jù)均代表平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，柱上不同字母代表基因表達(dá)差異顯著（p＜0.05, Duncan test, n=3）。下同

A：根root；B：莖stem；C：葉leaf

2.2 OsLTPL151在3個(gè)水稻品系中的組成型表達(dá)譜分析

在1688品系根和葉中的表達(dá)水平顯著高于莖（圖3-a）；在1654品系莖和葉中的表達(dá)水平顯著高于根（圖3-b）；在1665品系根中的表達(dá)水平顯著高于莖和葉（圖3-c）。

在根中，在1665品系中的表達(dá)量顯著高于1688和1654品系（圖4-a）；在莖中，在1654和1665品系中的表達(dá)量顯著高于1688品系（圖4-b）；在葉中，在1654品系中的表達(dá)量顯著高于1665和1688品系（圖4-c）。

2.3 OsLTPL164在3個(gè)水稻品系中的誘導(dǎo)組織表達(dá)譜分析

2.3.1 二化螟取食誘導(dǎo)組織表達(dá)譜 在根（圖5-a）中，在1688品系中，二化螟危害6 h后的表達(dá)量顯著升高；1665品系在接蟲處理后，表達(dá)顯著上調(diào)，在二化螟危害12 h和72 h后，表達(dá)水平均顯著高于其他時(shí)間點(diǎn)；在1654品系中，的表達(dá)水平受二化螟取食影響較小，表達(dá)量變化不顯著。在莖（圖5-b）中，1688品系中二化螟取食24 h后的表達(dá)量才顯著升高；1665品系中，二化螟取食下表達(dá)顯著上調(diào)，并且在危害6 h后，表達(dá)水平均顯著高于其他時(shí)間點(diǎn)；在1654品系中，的表達(dá)被顯著誘導(dǎo)，并且在3 h的表達(dá)水平顯著高于其他時(shí)間點(diǎn)。在葉（圖5-c）中，1688品系中，二化螟取食24 h后的表達(dá)量才顯著升高；1665品系中，二化螟取食下表達(dá)顯著上調(diào)，并且在危害6 h和72 h后，表達(dá)水平均顯著高于其他時(shí)間點(diǎn)；在1654品系中，的表達(dá)水平受二化螟取食影響較小，表達(dá)量變化不顯著。

A：1688；B：1654；C：1665

A：根root；B：莖stem；C：葉leaf

A：根root；B：莖stem；C：葉leaf

2.3.2 機(jī)械損傷誘導(dǎo)組織表達(dá)譜 在根（圖6-a）中，1688品系中，被機(jī)械損傷誘導(dǎo)表達(dá)幅度較??；1665品系在機(jī)械損傷處理6 h和72 h后，的表達(dá)水平均顯著高于其他時(shí)間點(diǎn)；1654品系中，的表達(dá)水平受機(jī)械損傷處理影響較小，表達(dá)量變化不顯著。在莖（圖6-b）中，1688品系中，被機(jī)械損傷誘導(dǎo)表達(dá)幅度較小；1665品系在機(jī)械損傷處理72 h后，的表達(dá)水平均顯著高于其他時(shí)間點(diǎn)；1654品系中，被機(jī)械損傷誘導(dǎo)表達(dá)幅度較小。在葉（圖6-c）中，1688品系中，機(jī)械損傷處理12 h和72 h后表達(dá)水平急劇升高；1665品系在機(jī)械損傷處理72 h后，的表達(dá)水平均顯著高于其他時(shí)間點(diǎn)；1654品系中，被機(jī)械損傷誘導(dǎo)表達(dá)幅度較小。

2.4 OsLTPL151在3個(gè)水稻品系中的誘導(dǎo)組織表達(dá)譜分析

2.4.1 二化螟取食誘導(dǎo)組織表達(dá)譜 在根（圖7-a）中，1688品系中，被二化螟誘導(dǎo)表達(dá)幅度較??；1665品系在二化螟危害12、48和72 h后，的表達(dá)水平均顯著高于其他時(shí)間點(diǎn)；在1654品系中，的表達(dá)水平受二化螟取食影響較小。在莖（圖7-b）中，在1688品系中，的表達(dá)水平受二化螟危害影響較??；1665品系在二化螟危害6 h和12 h后，的表達(dá)水平均顯著高于其他時(shí)間點(diǎn)；在1654中，在二化螟危害3 h和72 h可以被顯著誘導(dǎo)表達(dá)。在葉（圖7-c）中，在1688品系中，的表達(dá)水平受二化螟危害影響較小；1665品系在二化螟危害12 h和48 h后，的表達(dá)水平均顯著高于其他時(shí)間點(diǎn)；在1654中，在二化螟危害6 h和12 h可以被顯著誘導(dǎo)表達(dá)。

A：根root；B：莖stem；C：葉leaf

A：根root；B：莖stem；C：葉leaf

2.4.2 機(jī)械損傷誘導(dǎo)組織表達(dá)譜 機(jī)械損傷處理后，在3個(gè)水稻品系的不同組織中具有不同的表達(dá)模式（圖8）。在根（圖8-a）中，在1688品系中，的表達(dá)水平在機(jī)械損傷處理48 h和72 h后急劇升高；在1665品系中，機(jī)械損傷處理6 h后，的表達(dá)水平顯著高于其他時(shí)間點(diǎn)；在1654品系中，的表達(dá)水平受機(jī)械損傷處理影響較小。在莖（圖8-b）中，在1668品系中，的表達(dá)水平在機(jī)械損傷處理72 h后急劇升高；在1665品系的莖（圖8-b）中機(jī)械損傷誘導(dǎo)幅度大于根（圖8-a）和葉（圖8-c），在機(jī)械損傷處理6 h和48 h后，的表達(dá)水平顯著高于其他時(shí)間點(diǎn)；在1654品系中，機(jī)械損傷處理6 h和72 h后，的表達(dá)水平顯著上升。在葉（圖8-c）中，在1688品系中，的表達(dá)水平在機(jī)械損傷處理72 h后急劇升高；在1665品系中，在機(jī)械損傷處理6 h和12 h后，的表達(dá)水平顯著高于其他時(shí)間點(diǎn)；在1654品系中，機(jī)械損傷處理48 h和72 h后，的表達(dá)水平顯著上升。

A：根root；B：莖stem；C：葉leaf

3 討論

PI和nsLTP是植物體內(nèi)重要的防御蛋白，利用編碼這些蛋白的基因開發(fā)基于基因工程技術(shù)的害蟲防治方法，可以有效控制農(nóng)業(yè)害蟲的危害。這一方法已得到了廣泛的應(yīng)用[4,9-10,16]。

不同植物的PI和nsLTP基因具有不同的組織表達(dá)模式[30]。丹參在莖中表達(dá)量最高，其次是葉，而在根中幾乎不表達(dá)；谷子也僅在莖、葉和穗中表達(dá)[24]。這些結(jié)果表明該基因可能具有防御病原菌侵染的作用[27]。有研究認(rèn)為，LTP在表皮組織中的表達(dá)與角質(zhì)膜形成有關(guān)，由于根組織不形成像氣生組織一樣的角質(zhì)膜，所以LTP在根中表達(dá)較少或者不表達(dá)[24]。本試驗(yàn)的3個(gè)水稻品系中，屬于PI家族的在莖和葉中的表達(dá)水平均高于根，分析原因?yàn)樗镜那o和葉常受二化螟等害蟲的危害和植物病原菌等的侵染，該基因可能參與水稻植株地上部分的防御，這與前人的研究結(jié)果一致[24]。然而，屬于LTP家族的在1688和 1665兩個(gè)品系的根中表達(dá)水平顯著高于莖和葉，推測該基因可能與根吸收土壤鹽分、營養(yǎng)以及響應(yīng)重金屬等脅迫功能有關(guān)[20]。此外，已有研究結(jié)果證明，LTP基因家族各成員有著不同的組織表達(dá)特異性，在植物不同組織和器官中扮演不同的功能，例如，在菜豆中發(fā)現(xiàn)的一種LTP基因僅在根中專一性表達(dá)[30]。本研究發(fā)現(xiàn)表達(dá)模式與以及前人已報(bào)導(dǎo)的其他LTP基因[24,27]的表達(dá)模式不同，推測是由于不同水稻品系生物學(xué)和生理特性不同，其角質(zhì)膜形成規(guī)律不一致造成的。

在3個(gè)水稻品系相同組織中的表達(dá)水平為在1665中最高，在1688中次之，在1654中最低；在根中的表達(dá)水平為1665品系中的表達(dá)量顯著高于1688和1654品系；在莖和葉中的表達(dá)水平為1654品系的表達(dá)量高于1665和1688品系。和過去被歸屬在nsLTP中，但近年來發(fā)現(xiàn)它們在結(jié)構(gòu)上與PI相似，被重新劃分至PI中[21]。因此和可能同時(shí)具有PI和nsLTP兩個(gè)家族的功能。研究表明，這兩類蛋白在植物體內(nèi)均參與系統(tǒng)防御[7,16-17,19]?？瓜x相關(guān)基因在抗性較高的水稻品系中表達(dá)水平較高，在感蟲品系內(nèi)基因表達(dá)水平較 低[31]。所以，筆者推測1665品系較1654和1688品系對二化螟具有更高水平的抗性。下一步將系統(tǒng)地評價(jià)3個(gè)水稻品系對二化螟的抗性，以明確和與水稻抗蟲性之間是否密切相關(guān)。

LTP基因經(jīng)常受機(jī)械損傷和有害生物誘導(dǎo)表 達(dá)[9-10,19]。在本試驗(yàn)中，和在二化螟取食和機(jī)械損傷脅迫下，在3個(gè)水稻品系不同組織內(nèi)表現(xiàn)出不同的表達(dá)模式。二化螟取食危害下和在3個(gè)水稻品系的莖和葉片中的表達(dá)量顯著高于根，表明這兩個(gè)基因可能參與水稻對二化螟取食的防御功能。此外，這一結(jié)果可能也與二化螟危害水稻時(shí)的取食行為有關(guān)。初孵幼蟲先在葉片上徘徊、取食一段時(shí)間（約30 min），待找到合適的鉆蛀部位后，鉆蛀入水稻莖干。本研究發(fā)現(xiàn)，二化螟對不同PI基因在不同組織中的誘導(dǎo)表達(dá)效應(yīng)也是不同的。在根中，的表達(dá)量在二化螟危害48 h以上才顯著上調(diào)，而在危害3 h或6 h就顯著上調(diào)表達(dá)。但在莖和葉片中，二化螟取食3 h或6 h便顯著地誘導(dǎo)和表達(dá)?；蛟S是這類基因在植物受有害生物脅迫后固有的表達(dá)模式，其特有的生物學(xué)功能有待于進(jìn)一步解析。

與二化螟取食誘導(dǎo)表達(dá)不同的是，機(jī)械損傷對在1665品系中、在1688品系中不同組織間的表達(dá)量與對照相比無顯著差異。原因可能是植物應(yīng)對蟲害和機(jī)械損傷時(shí)的防御機(jī)制不同；蟲害不僅會(huì)造成機(jī)械損傷，害蟲在取食過程中還會(huì)有分泌唾液及其類似物等激發(fā)子，進(jìn)而誘導(dǎo)植物產(chǎn)生防御反應(yīng)[8]。此外，本試驗(yàn)采用針刺的方式對水稻進(jìn)行機(jī)械損傷，這與二化螟（咀嚼式口器害蟲）危害植物的方式有所不同。相關(guān)研究得出，具有刺吸式口器的褐飛虱和白背飛虱取食水稻后，水稻的抗蟲相關(guān)基因被誘導(dǎo)表達(dá)的時(shí)間比二化螟危害較晚，且表達(dá)量較低，與針刺的誘導(dǎo)表達(dá)模式相似[8]。此外，與二化螟危害相比較，和均在機(jī)械損傷6 h后才被誘導(dǎo)表達(dá)，誘導(dǎo)表達(dá)的時(shí)間較晚。在前人的研究中，機(jī)械損傷1 h后，水稻抗蟲基因就可以被快速誘導(dǎo)[8,32]；小麥在機(jī)械損傷0.5—1 h便被快速誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)，從3 h之后開始下降[33]。這可能與機(jī)械損傷的操作方式和不同植物本身LTP基因特性有關(guān)。

4 結(jié)論

和在3個(gè)常規(guī)種植的水稻品系中具有不同的組織表達(dá)模式以及二化螟取食和機(jī)械損傷后誘導(dǎo)模式，推測這兩個(gè)基因與水稻抗二化螟有關(guān)。

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（責(zé)任編輯 岳梅）

Compositive and Inductive Expression Patterns of Protease Inhibitor Genesand)

HE YuJuan, JU Di, WANG Yue, YANG XueQing, WANG XiaoQi

(College of Plant Protection, Shenyang Agricultural University/Key Laboratory of Economic and Applied Entomology of Liaoning Province, Shenyang 110866)

【Objective】Protease inhibitors (PI) is a kind of protein widely existed in plants. It has the function of resisting herbivorous insects feeding. However, the expression patterns of rice () PI genes in the feeding process of theare not clear. The objective of this study is to analyze the expression patterns of rice protease inhibitor genesandunderinfestation and mechanical damage, which will lay a theoretical foundation for confirming the function ofandinfestation and constructing transgenic rice strains using these two genes in the future. 【Method】Three rice lines, Liaoyan 2 (1654), Liaoxing 17 (1665) and Changbai 17 (1688), which were conventionally planted in Northeast China, were selected as the research materials. Artificial infestation and mechanical injury treatments were performed at the tillering stage of rice, which is the key period of.infestation. The root, stem and leaf of three rice lines were sampled after different times (0, 3, 6, 12, 24, 48, 72 h) of treatments, then the expression level ofandof three rice lines was determined by RT-qPCR. 【Result】The tissue expression pattern of thewas consistent in three rice lines. The expression level ofwas not consistent in three rice lines. The expression level ofwas the highest in 1665 line, followed by 1688 line, and the lowest in 1654 line. Theexhibited different expression patterns in different tissues among three rice lines: in the root, the expression level ofand.infestation, and with a higher inducing effect in 1665 line than that in 1688 and 1654 lines. Bothandshowed a rise -decrease-rise expression tendency at different time points after artificial infestation and mechanical injury treatments. The expression level ofandwas significantly induced after 6 h of mechanical damage treatment, while the expression level ofandcould be significantly induced after 3 h ofinfestation. 【Conclusion】The expression ofand.infestation and mechanical damage treatment, suggesting that both the two genes are involved in resistance to.. However, other specific functions of the two genes in different rice lines might be different.

protease inhibitor;; defense; induced expression; RT-qPCR

2018-01-11；

2018-02-27

國家自然科學(xué)基金（31501666）、“青年托舉人才工程”項(xiàng)目（YESS20160085）

何雨娟，E-mail：15940518901m@sina.cn。

楊雪清，E-mail：sling233@hotmail.com。通信作者王小奇，E-mail：wxq1120@sina.com