孤束核中GABAB受體在電針“足三里”抑制一過性食管下括約肌松弛中的作用

浙江中醫(yī)藥大學附屬第三醫(yī)院 杭州 310005

一過性食管下括約肌松弛(transient lower esophageal sphincter relaxation,TLESR)是指非吞咽情況下食管下括約?。╨ow esophageal sphincter,LES）發(fā)生自發(fā)性松弛，被認為是胃食管反流病的主要病因[1-2]。而胃擴張是引起TLESR的主要誘因之一[3-4]，胃壁拉伸可通過迷走-迷走反射（vago-vagal reflex）誘發(fā)TLESR。孤束核是腦干內接受內臟初級感覺傳人信息的重要核團，對迷走-迷走反射具有重要的調控作用[5]。來自胃賁門部的感覺信號通過迷走神經(jīng)感覺傳入纖維投射到腦，其突觸末端終止于孤束核[6]，因此孤束核在TLESR的發(fā)生機制中扮演著重要的角色。

祖國醫(yī)學認為，“足三里”是足陽明胃經(jīng)的合穴，又為下合穴，善治胃腑病證。針刺“足三里”穴對包括食管在內的整個消化系運動功能具有良性調節(jié)作用[7]，其傳出途徑是迷走神經(jīng)。腦干孤束核作為迷走神經(jīng)中樞接受沖動，進行綜合性調節(jié)活動[8]。γ-氨基丁酸受體(γ-aminobutyric acid receptor,GABA-R)廣泛存在于中樞孤束核神經(jīng)細胞中，與其電活動有著密切關系。筆者推測孤束核在參與電針對 TLESR的干預中發(fā)揮了重要的作用，而GABAB受體的調控作用可能是其主要機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 選用SPF級健康雄性SD大鼠30只，購自上海西普爾-必凱實驗動物有限公司，動物隨機分模型組（胃擴張誘發(fā)造模 6只）、足三里組（造模+電針“足三里”6只）、非經(jīng)非穴組（造模+無效電針6只）、沙克洛芬（Saclofen來源abcam）組（造模+電針“足三里”+GABAB受體阻斷劑6只）和空白注射組（造模+電針“足三里”+無效注射 6只）。

1.2 胃擴張誘發(fā)TLESR模型 參考相關文獻，大鼠禁食10h后，10%水合氯醛(0.35ml/100g體重)腹腔注射麻醉下，輕柔地插一端套有薄膜囊的聚乙烯軟管入胃，深度為下食管括約肌下4cm，向氣囊內注水，給予胃內壓≥5.32 kPa(40mmHg)壓力的時相性胃擴張(注水2min，間歇4min，交替進行，6min為1輪，共10 輪[9-10]。

1.3 孤束核內微量注射針的埋入 大鼠在10%水合氯醛(0.35ml/100g體重)腹腔注射麻醉下，固定于立體定向儀上，切開大鼠頭部皮膚，暴露骨縫，參照LJ.Pellegrine鼠腦定向圖譜，顱骨鉆孔,埋植不銹鋼套管(外徑0.5mm，內置直經(jīng)0.3mm的不銹鋼絲，其下端比套管長0.5mm)，微量注射時，將不銹鋼絲內芯拔出，微量注射針超出外套管1mm，用于局部微量注射。

1.4 測壓流程 將適度麻醉的大鼠仰臥固定于實驗臺上，使用消化道動力檢測系統(tǒng)GAP-08A，經(jīng)口插入測壓管，使遠端3個通道均置于胃內,開始記錄測壓數(shù)據(jù)。采用定點牽拉法勻速牽拉（每15s向外牽拉測壓管10mm)測壓管直至第2或含第3通道，顯示位于LES內時,將測壓管固定于動物口邊。監(jiān)測TLESR及TLESR伴反流的發(fā)生次數(shù)。足三里組及非經(jīng)非穴組在胃擴張的同時電針雙側相關穴位。沙克洛芬（GABAB受體阻斷劑）組和空白注射組，在進行電針“足三里”及食管測壓前30min，微量注射針連接微量注射泵，以1μl/min的速度向孤束核區(qū)注射1μl的沙克洛芬或改良Riger液，注入時程為1min，滯留1min，然后開始測壓。

1.5 電針穴位和電針參數(shù) 按照中國針灸學會學術部提供的大鼠穴位圖譜及比較解剖學取穴“足三里”，采用華佗牌 0.30mm×25mm 針灸針，刺入雙側穴位，連接電子針灸治療儀CMNS6-1型，頻率 2/100Hz連續(xù)波，電流1mA，時間60min。模型組僅給予單純胃擴張，不進行電針。

1.6 TLESR的判定標準 LES從開始松弛到完全松弛的時間≤10s；LES的最低壓力應≤2mmHg。此外，對于壓力≤2mmHg，松弛時間≥10s的LES松弛，且可以除外是由于多次快速吞咽所致，可以被認為是TLESR。

1.7 TLESR伴反流判定標準 至少2個食管測壓導聯(lián)中壓力同時突然持續(xù)增加是氣體或液體從胃中反流到食管中的標志。

TLESR伴反流率=每組發(fā)生反流的總次數(shù)/總TLESR次數(shù)。

1.8 免疫組化法檢測孤束核區(qū)GABAB受體的表達用10%水合氯醛(0.35ml/100g體重)腹麻醉大鼠,完全麻醉后開胸通過左心室灌注生理鹽水，至右心房流出的液體變清，再用 4%多聚甲醛溶液快速灌注固定，之后繼續(xù)緩慢固定30min，斷頭取延髓界溝的外側（孤束核），標本浸泡于4%多聚甲醛溶液6h，然后于4℃用15%蔗糖溶液脫水24h，標本均沉至容器底部，再用30%蔗糖溶液于4℃脫水48h，標本全部沉底，取出標本，用錫箔紙包裹密封，用液氮迅速冷凍。于恒溫冷凍切片機內連續(xù)冠狀位冰凍片，片厚20μm，用于免疫組化染色，陽性反應產(chǎn)物呈黃褐色，在每只大鼠隨機取10張切片，并在200倍光鏡下隨機選擇孤束核區(qū)相應部位的5個視野，進行GABAB受體陽性細胞計數(shù)。

1.9 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 19.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，TLESR頻率應用中位數(shù)表示，其余實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(±s）表示。組內比較采用配對t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較選用LSD檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義的標準。

2 結果

2.1 電針及藥物對TLESR頻率的影響 與模型組［9次/h（范圍：7～11）］相比，足三里組［6次/h（范圍：4～8）］TLESR 頻率較低（P=0.023<0.05，T=3.248），而非經(jīng)非穴組［9次/h（范圍：7～13）］TLESR 頻率差異無統(tǒng)計學意義（P=0.837>0.05，T=0.216）；與空白注射組［9次/h（范圍：7～13）］相比，沙克洛芬組［18次/h（范圍：15～21）］TLESR 的頻率顯著升高（P<0.001，T=10.686）。見圖 1。

圖1 各組發(fā)生TLESR頻率（次/小時）

2.2 電針對TLESR時合并反流的影響 與模型組相比，足三里組可以降低合并返流的比例（P<0.05），而非經(jīng)非穴組與模型組相比差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。與空白注射組相比，GABAB受體阻斷劑沙克洛芬組的TLESR合并返流比例顯著升高（P<0.001）。見表1。

表1 各組發(fā)生TLESR合并反流率

2.3 孤束核區(qū)GABAB受體表達 與模型組相比，足三里組孤束核區(qū)的GABAB受體陽性面積增加（P<0.05）。與足三里組相比，沙克洛芬組孤束核區(qū)的GABAB受體陽性面積減少（P<0.001）。見表2及圖2。

表2 各組大鼠孤束核區(qū)GABAB受體免疫組化陽性面積

3 討論

針刺療法由于其安全有效的優(yōu)勢，在臨床上用于治療胃食管反流病正被越來越多的患者接受?！白闳铩毖ㄗ鳛樽汴柮魑附?jīng)的合穴、下合穴，是針灸治療消化系統(tǒng)疾病的常用穴。目前臨床研究提示[11-12]，針刺“足三里”等穴來治療胃食管反流病，可顯著改善臨床癥狀，降低復發(fā)率。研究顯示，針刺“足三里”穴對食管運動有明顯的雙向調節(jié)作用，它既可以提高食管動力障礙患者的食管運動功能，也能緩解食管下括約肌興奮性增高患者的食管下括約肌痙攣，使吞咽順暢[13]。Zou等[14]發(fā)現(xiàn)電針可通過降低TLESR的頻率來改善反流癥狀。本動物實驗結果證實，電針“足三里”穴可有效降低大鼠胃擴張所誘發(fā)的TLESR頻率，而電針非經(jīng)非穴則沒有上述效果，說明電針“足三里”對食管下括約肌運動功能的調節(jié)具有一定的經(jīng)絡和穴位特異性。同時侯曉華等[15]研究發(fā)現(xiàn)健康人中35%的TLESR伴隨胃食管反流，而胃食管反流病患者則有65%TLESR伴隨反流，所以如何防止過多的胃內容物反流入食管減少其食道黏膜損傷亦十分重要。在本動物試驗中，發(fā)現(xiàn)電針“足三里”在抑制TLESR的同時，能夠有效降低其合并反流的發(fā)生，為胃食管反流病的治療提供了理論依據(jù)及新的思路。

圖2 各組大鼠孤束核區(qū)GABAB受體免疫組化染色（200×）

TLESR被認為是胃食管反流病的根本病因，其發(fā)生與胃底、咽部的迷走神經(jīng)機械感受器受到刺激引起的迷走-迷走反射密切相關。有研究發(fā)現(xiàn)電針大鼠穴位可以誘發(fā)迷走神經(jīng)放電，并且這種作用可以通過脊髓橫斷來逆轉，提示電針“足三里”對迷走神經(jīng)的刺激作用有可能是通過中樞的機制而完成的[16]。牟向東等[17-18]發(fā)現(xiàn)采用電針刺激“足三里”穴，可使健康大鼠食管下段括約肌壓力明顯升高，在阻斷膽堿能M受體后，電針的干預效果被明顯減弱，但電針仍可使LESP恢復至正常水平，說明電針對食管下括約肌的干預效應除迷走神經(jīng)的膽堿能受體外，還有其他途徑。孤束核是腦干內接受內臟初級感覺傳人信息的重要核團，接受由迷走神經(jīng)傳入的胃擴張等引發(fā)的感覺信號，調控食管下括約肌，在引發(fā)TLESR的過程中起重要作用[19]。GABA為抑制性神經(jīng)遞質，而孤束核中存在大量的GABAB受體。對孤束核內GABA能神經(jīng)末梢的超微結構研究顯示GABAB受體和外周傳入末梢有緊密的聯(lián)系[18]，調節(jié)孤束核中GABAB受體可影響迷走神經(jīng)機械感受器，改變迷走神經(jīng)傳出沖動[21]。本研究組猜測電針“足三里”對TLESR的抑制作用可能與孤束核中GABAB受體有關，故本實驗設計了應用微注射GABAB受體阻斷劑沙克洛芬對實驗動物進行預處理，從而觀察孤束核中GABAB受體對電針“足三里”穴抑制TLESR作用的影響。結果發(fā)現(xiàn)：阻斷GABAB受體的沙克洛芬可以逆轉“足三里”對TLESR及其合并反流的抑制作用，使TLESR發(fā)生及其合并反流頻率大幅上升，說明電針“足三里”穴對TLESR的作用與GABAB受體狀態(tài)有關。因此，GABAB受體在經(jīng)迷走神經(jīng)通路調控TLESR的過程中扮演著重要的角色。進一步的免疫組化結果顯示，電針“足三里”組與模型組大鼠相比，孤束核中GABAB受體表達上調，兩組間差異存在顯著性意義，說明電針“足三里”不但可以激動GABAB受體，還能夠上調其表達水平。但GABAB受體需要與GABA神經(jīng)遞質相結合才能發(fā)揮效應，電針“足三里”穴對孤束核內GABA神經(jīng)遞質含量的影響，仍需進一步的研究。

4 結語

綜上所述，本實驗表明電針“足三里”可能通過激動孤束核中GABAB受體，影響迷走神經(jīng)-食管中樞調控機制來恢復LES正常生理功能，減少TLESR發(fā)生及其合并反流頻率。同時仍需結合傳統(tǒng)及現(xiàn)代醫(yī)學，通過進一步的研究來闡明其作用機制。

[1]林三仁,許國銘,胡品津,等.中國胃食管反流病共識意見[J].胃腸病學,2007,12(4):233-239.

[2]侯淵濤,孫曉紅,李曉青,等.胃食管反流病患者食管動力異常及其對食管酸暴露的影響[J].中華內科雜志,2015,54(10):865-869.

[3]楊靜,王馳.電針貓“足三里”穴抑制胃擴張所致的一過性下食管括約肌松弛[J].針刺研究,2011,36(6):423-427.

[4]JBoulant,S Mathieu,M D'Amato,A Abergel,M Dapoigny and G Bommelaer.Cholecystokinin in transient lower oesophageal sphincter relaxation due to gastric distension in humans.Gut,1997,40(5):575-581.

[5]房軍帆,杜俊英,邵曉梅,等.電針“足三里”穴干預孤束核神經(jīng)元興奮性的樣本熵和頻率分析[J].浙江中醫(yī)藥大學報,2016,40(12):865-869.

[6]向娟,陳果,李飛,等.針灸治療胃黏膜損傷中樞調控機制的研究[J].上海針灸雜志,2016,35(12):1484-1487.

[7]Tatewaki M,Harris M,Uemura K,Ueno T,et al.Dual effects of acupuncture on gastricmotility in conscious rats[J].Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol,2003,285(4):R862-872.

[8]王述菊,孫國杰,杜艷軍,等.孤束核在針刺“足三里”調節(jié)胃運動中的作用機制[J].中國中醫(yī)藥信息雜志,2007,14(9):28-30.

[9]Chi Wang,De-Feng Zhou,Xiao-Wei Shuai,et al.Effects and mechanisms of electroacupuncture at PC6 on frequency of transient lower esophageal sphincter relaxation in cats[J].World Journal of Gastroenterology(English Edition),2007(36)13:4873-4880.

[10]彭艷,易受鄉(xiāng),李振海，等.毫針不同刺激強度對胃擴張?zhí)弁创笫蠹顾璞辰荖MDA受體和P物質的影響[J].世界華人消化雜志,2009,17(13):1339-1345.

[11]葛力軍,賈如，李季委.針灸治療肝胃不和型胃食管反流病21例[J].中國中醫(yī)藥科技,2009,16(2):137.

[12]梁波,賀劍波，劉漢平.針刺中脘不同組穴治療胃食管反流病的臨床觀察[J].中華中醫(yī)藥學刊,2010,28(3):564-566

[13]張曉艷,謝鵬雁.足三里穴與食管運動功能的研究進展[J].世界華人消化雜志,2009,17(11):1108-1111.

[14]Zou D,Chen WH,Iwakiri K,et al.Inhibition of transient lower esophageal sphincter relaxations by electrical acupoint stimulation[J].Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol,2005,289(2):197-201.

[15]查慧,謝小平,侯曉華.胃食管返流病患者酸反流與食管運動功能障礙的關系[J].胃腸病學,2006,11(1):41-44.

[16]Li Y Q,Zhu B,Rong P J,et al.Neural mechanism of acupuncture-modulated gastric motility[J].World Journal of Gastroenterology,2007,13(5):709-716.

[17]牟向東,謝鵬雁,劉建湘,等.電針刺大鼠足三里穴對LESP血漿胃泌素和胃動素的影響[J].世界華人消化雜志,2005,13(9):1069-1073.

[18]牟向東,謝鵬雁,王化虹,等.電針大鼠足三里調節(jié)下食管括約肌壓力神經(jīng)通路的探討[J].中國中醫(yī)藥信息雜志,2008,15（5）:31-32.

[19]Kuo P,Bravi I,Marreddy U,et al.Postprandial cardiac vagal tone and transient lower esophageal sphincter relaxation(TLESR)[J].Neurogastroenterology&Motility the Official Journal of the European Gastrointestinal Motility Society,2013,25(10):841-e639.

[20]Fawley J A,Peters J H,Andresen M C.GABA(B)-mediated inhibition of multiple modes of glutamate release in the nucleus of the solitary tract[J].Journal of Neurophysiology,2011,106(4):1833.

[21]Boeckxstaens G E,Beaumont H,Mertens V.Effects of lesogaberan,a novel GABA(B)-receptor agonist,on reflux and lower esophageal sphincter function in patients with gastroesophageal reflux disease[J].Gastroenterology,2010,139:377-379.