• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    加減薯蕷丸對血管性癡呆大鼠海馬突觸再生和可塑性影響的研究

    2018-06-29 06:56:50李紅兵譚子虎
    浙江中醫(yī)藥大學學報 2018年6期
    關鍵詞:樹突海馬蛋白

    李紅兵 譚子虎

    1.湖北中醫(yī)藥大學 武漢 430061 2.貴陽市第一人民醫(yī)院 3.湖北省中醫(yī)院

    目前我國血管性癡呆(vascular dementia,VD)發(fā)病率僅次于阿爾茨海默?。ˋlzheimer disease,AD),VD患者約占癡呆患者總數(shù)的20%[1]。近年來,中醫(yī)藥治療VD取得了較好效果。基于《金匱要略》薯蕷丸原方化裁而來的加減薯蕷丸(Modified Dioscorea Pills,MDP)具有補腎填精、益氣通絡、健脾調(diào)肝之功,臨床上對于非癡呆型血管性認知功能障礙及中風后失語等疾病療效顯著[2-3]。眾所周知,突觸是神經(jīng)信息傳遞與處理過程的中心環(huán)節(jié),因此突觸的數(shù)量及功能狀態(tài)對認知功能具有決定性作用。筆者所在團隊的前期研究證實,MDP可明顯促進VD大鼠海馬區(qū)腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)的mRNA表達[4],而BDNF可促進突觸再生,提高突觸可塑性,從而改善VD大鼠智能[5]。為進一步明確MDP對VD大鼠海馬區(qū)突觸的影響,本研究從突觸相關蛋白的表達和突觸的超微結構的角度進行研究。

    1 材料和方法

    1.1 實驗動物 SPF級雄性SD大鼠40只,8~9周齡,體質(zhì)量約(300±20)g,購自湖北省預防醫(yī)學科學院實驗動物中心[實驗動物生產(chǎn)許可證號:SCXK(鄂)2015-0018]。大鼠喂養(yǎng)于湖北中醫(yī)藥大學動物房,進食及飲水自由,飼料由湖北省預防醫(yī)學科學院提供。光照/黑暗時間 12/12h,溫度(22±2)℃,濕度(60±10)%。

    1.2 主要試劑和儀器 MDP由山藥、熟地黃、何首烏、全當歸、杜仲、川芎、西黨參、茯苓、白術、白芍、枸杞、菖蒲、遠志、五味子共14味中藥組成,均由湖北省中醫(yī)院制劑室提供,經(jīng)提純濃縮制備成含藥材1g·mL-1的濃縮湯劑。小鼠抗大鼠微管相關蛋白-2(microtubule associated protein-2,MAP-2)抗體(anti-MAP-2)、小鼠抗大鼠突觸素(synaptophysin,SYP)抗體(anti-SYP)及小鼠抗大鼠突觸后密度蛋白-95(postsynaptic density protein-95,PSD-95)抗體(anti-PSD-95)均購于武漢三鷹生物技術有限公司(批號分別為:17490-1-AP、17785-1-AP、20665-1-AP)。水迷宮實驗設備及軟件購于成都泰盟科技公司。Hitachi H-7000FA型透射電鏡為日本日立公司產(chǎn)品。

    1.3 動物分組及造模方法 適應性喂養(yǎng)1周后,按照隨機數(shù)字表將大鼠分為手術組28只及假手術組12只。手術組采用改良雙血管阻斷(2-vessels occlusion,2-VO)法建立大鼠VD模型,具體方法為:大鼠采用異氟烷吸入麻醉后先分離右側(cè)頸總動脈并兩端結扎,從結扎中心剪斷頸總動脈,分層縫合并以青霉素40萬U/只局部注射預防感染,1周后以同樣方法處理左側(cè)頸總動脈。假手術組大鼠不結扎及剪斷頸總動脈,其余操作步驟同手術組。VD模型造模成功判定:大鼠清醒后反應遲鈍,行動遲緩,行走不穩(wěn),呈現(xiàn)無目的的旋轉(zhuǎn)運動。2-VO術后1周后進行1次Morris水迷宮定位航行訓練,以假手術組大鼠逃避潛伏期的均值為參考值,逃避潛伏期超過參考值20%的大鼠定義為癡呆大鼠。

    1.4 干預措施 術后假手術組大鼠死亡1只,手術組死亡5只,存活大鼠均造模成功。將手術組存活大鼠按隨機數(shù)字表分為藥物組12只,模型組11只。2-VO術后1周,藥物組以MDP濃縮湯劑灌胃,按黃繼漢等[6]的方法,藥物劑量換算系數(shù)為0.162,藥物組大鼠灌胃1mL/100g,1次/d,即相當于成人劑量1.62g/kg·d,共灌胃45d;模型組及假手術組大鼠采用0.9%氯化鈉溶液灌胃,劑量、療程及方法同藥物組。

    1.5 水迷宮實驗檢測大鼠行為學改變 常規(guī)進行定位航行及空間搜索實驗[7],共進行5d,前4d為定位航行實驗,最后1d為空間搜索實驗。定位航行實驗每天進行2次,從四個不同象限中將大鼠面向池壁放入水中,計算機自動計算每個大鼠的航行距離及逃避潛伏期。如果大鼠在120s內(nèi)找不到水下的平臺,則引導其到平臺并停留2min,使其記憶平臺與周圍環(huán)境的關系,逃避潛伏期記為120s。其余則按照實際時間和距離由計算機測算。最后1d則撤除平臺,計算大鼠在120s搜索過程中,跨越平臺次數(shù)、平臺所在象限(第一象限)游行時間、游行距離以及總游行距離。

    1.6 免疫組化檢測突觸相關蛋白的表達 各組選擇8只大鼠,10%水合氯醛(0.35g·kg-1)腹腔注射麻醉后,固定于解剖板上,剖開腹腔,暴露肝臟和橫膈膜,迅速剪開橫膈膜,打開胸腔,暴露心臟。將灌注針頭從心尖部位經(jīng)左心室插入升主動脈,剪開右心耳,快速灌入0.9%氯化鈉溶液100~150mL,直至體循環(huán)血液沖洗干凈,灌流液轉(zhuǎn)為清亮。待大鼠尾巴伸直,四肢顫抖停止,觀察肝臟逐漸變成白色,再用4%多聚甲醛250mL灌注。40min后斷頭取腦組織,4%多聚甲醛磷酸緩沖液固定12~24h,常規(guī)脫水、浸蠟、包埋,制備海馬石蠟切片,經(jīng)過抗原修復、阻斷內(nèi)源性過氧化物酶后分別添加一抗(anti-MAP-2、anti-SYP及anti-PSD-95),再加入辣根過氧化物酶標記的二抗,DAB顯色及Harris蘇木素復染。采集圖像,每張切片選取3張400倍照片,使用IPP6.0軟件進行光密度分析,以平均光密度表示各蛋白表達水平。

    1.7 突觸超微結構的形態(tài)學觀察 每組選擇3只大鼠,10%水合氯醛(0.35g·kg-1)腹腔注射麻醉后,斷頭處死,立即快速剝離腦組織,沿視交叉前端作冠狀切面,取大鼠左側(cè)大腦海馬CA1區(qū)組織3塊,組織塊約1mm3大小,經(jīng)固定、漂洗、脫水、滲透、包埋后以超薄切片機制作60~80nm切片。鈾鉛雙染色,干燥過夜后透射電鏡下觀察突觸情況。

    1.8 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析。計量資料以±s表示。兩組間比較用t檢驗,多組間比較用單因素方差分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

    2 結果

    2.1 各組大鼠行為學改變比較 水迷宮實驗最初2d,各組大鼠逃避潛伏期及逃避距離沒有統(tǒng)計學差異(P>0.05)。第3天開始,假手術組大鼠逃避距離及逃避潛伏期與模型組相比下降較多,具有統(tǒng)計學差異(P<0.05)。第4天藥物組大鼠逃避距離及逃避潛伏期下降較快,與假手術組接近,二者與模型組相比均有統(tǒng)計學差異(P<0.05,P<0.05)。見表 1、2。在空間搜索實驗中,假手術組及藥物組大鼠跨越平臺次數(shù)均多于模型組(P<0.01,P<0.05),平臺所在象限游行時間及游行距離也多于模型組(P<0.05,P<0.01),但 3組大鼠的總游行距離及速度無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。見表3。

    表1 各組大鼠逃避距離比較(±s,cm)Tab.1 Comparison of escaping latency among different groups(±s,cm)

    表1 各組大鼠逃避距離比較(±s,cm)Tab.1 Comparison of escaping latency among different groups(±s,cm)

    注:與模型組相同時點比較,*P<0.05。Note:Compared with model group at the same time,*P<0.05.

    表2 各組大鼠逃避潛伏期比較(±s,s)Tab.2 Comparison of escaping latency among different groups(±s,s)

    表2 各組大鼠逃避潛伏期比較(±s,s)Tab.2 Comparison of escaping latency among different groups(±s,s)

    注:與模型組相同時點比較,*P<0.05。Note:Compared with model group at the same time,*P<0.05.

    表3 各組大鼠空間搜索實驗結果比較(±s)Tab.3 Comparison of the parameters of probing test among different groups(±s)

    表3 各組大鼠空間搜索實驗結果比較(±s)Tab.3 Comparison of the parameters of probing test among different groups(±s)

    注:與模型組比較,*P<0.05,**P<0.01。Note:Compared with model group,*P<0.05,**P<0.01.

    2.2 各組大鼠海馬突觸相關蛋白表達比較 藥物組及假手術組大鼠MAP-2蛋白表達高于模型組,具有統(tǒng)計學差異(P<0.01,P<0.05),而且藥物組高于假手術組(P<0.01)。藥物組大鼠SYP蛋白表達明顯高于模型組及假手術組(P<0.01,P<0.01),而且藥物組明顯高于假手術組(P<0.01)。藥物組及假手術組大鼠PSD-95 蛋白表達明顯高于模型組(P<0.01,P<0.01),而且藥物組高于假手術組(P<0.01)。見圖1、表4。

    2.3 各組大鼠突觸的超微病理學分析 從電鏡圖像可以看出,假手術組突觸結構完整,突觸間隙清晰可見,突觸前后膜間吻合良好,突觸后膜可見均勻增厚,突觸曲面弧度規(guī)整,突觸小泡豐富,線粒體結構完整;模型組突觸間隙消失,突觸前后膜界限模糊,弧度不規(guī)則,突觸小泡較少,線粒體嵴腫脹甚至消失;藥物組突觸結構疾病正常,突觸間隙清晰可見,突觸后膜均勻增厚,突觸小泡較多,線粒體結構完整、豐富。見圖2。

    圖1 各組大鼠海馬區(qū)MAP-2、SYP、PSD-95的表達(400×)Fig.1 Expression of MAP-2,SYP,PSD-95 in hippocampus among different groups(400×)

    表4 各組大鼠海馬突觸相關蛋白表達比較(±s)Tab.4 Comparison of expression of synaptic associated proteins among different group(±s)

    表4 各組大鼠海馬突觸相關蛋白表達比較(±s)Tab.4 Comparison of expression of synaptic associated proteins among different group(±s)

    注:與模型組比較,*P<0.05,**P<0.01;與假手術組比較,##P<0.01。Note:Compared with model group,*P<0.05,**P<0.01;compared with sham-operated group,##P<0.01.

    3 討論

    VD是最常見的認知功能障礙病因之一,屬中醫(yī)“文癡”“呆病”“善忘”“郁證”等范疇?!夺t(yī)方集解》言:“人之精與志,皆藏于腎。腎精不足則志氣衰,不能上通于心,故迷惑善忘也?!盵8]因此腎虛,腎中精氣不足可影響到心神而導致癡呆。此外,《靈樞·平人絕谷》言“血脈和利,精神乃居”,進一步指出血脈通暢是精神、情智、認知正常的必要條件。因此,治療VD多以補腎填精、健脾益氣、疏通經(jīng)絡等方藥配伍而獲良效。

    圖2 各組大鼠海馬CA1區(qū)突觸結構透射電鏡圖像Fig.2 The synaptic images of three groups observed with TEM

    MDP組方中以山藥為君,重在補腎益氣;以熟地黃、何首烏、全當歸為臣,加強補腎填精、活血通絡、滋陰養(yǎng)血的功效,補而不滯;另以杜仲、川芎為佐,進一步加強補腎通絡功效,再佐以西黨參、茯苓、白術益氣健脾,意為補后天之本以促先天之本功能健旺;以白芍、枸杞、菖蒲、遠志、五味子為使調(diào)肝寧神,同時秉承肝腎同源、精血互化理論,從而達到滋陰潤燥、調(diào)攝精神之功效。諸藥合用,使腎氣健旺、腦絡通順、五臟得調(diào),自當五神各安其位、五體靈活、五官靈敏而反應如常。

    大鼠和人類一樣,具有完整的Willis環(huán),因此本研究采用2-VO法建立大鼠VD模型。雙側(cè)頸總動脈阻斷后可導致大鼠海馬慢性供血不足。海馬CA1區(qū)神經(jīng)元對缺血、缺氧損害極其敏感[7],頸總動脈阻斷導致的缺血缺氧性病變勢必導致神經(jīng)元凋亡及突觸的變性和丟失,使突觸數(shù)量下降,可塑性降低,突觸相關蛋白表達發(fā)生改變,并進一步影響突觸的結構與功能。研究表明,突觸相關蛋白可調(diào)控突觸的生長、發(fā)育、成熟,并與突觸可塑性密切相關,當其表達發(fā)生改變后可使個體產(chǎn)生神經(jīng)精神癥狀,出現(xiàn)焦慮、感覺與認知功能受損、交流缺陷以及社會活動缺陷等[9],因此突觸相關蛋白的表達是突觸數(shù)量及功能狀態(tài)的標志,能夠從微觀層面反映突觸的病理生理變化。

    本研究發(fā)現(xiàn),MDP能明顯改善VD大鼠的學習記憶能力。免疫組化檢測則進一步證實MDP能明顯促進突觸相關蛋白SYP、MAP-2、PSD-95的表達,藥物組明顯高于模型組及假手術組。SYP是一種突觸前囊泡特定蛋白,由313個氨基酸組成,分子量38kDa,對突觸形成和突觸功能的維持意義重大,是突觸重建的重要標志。SYP可作為突觸結構的標記物,在神經(jīng)外科手術中常用來標記突觸終末,避免神經(jīng)損傷[10]。MAP-2主要表達在神經(jīng)元胞體、樹突、樹突棘和突觸后致密區(qū),作為神經(jīng)元樹突生長的標志蛋白,與突觸可塑性與樹突棘的形態(tài)與功能密切相關,在神經(jīng)元突起形成和突觸可塑性調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要的作用[11],與癲癇等疾病密切相關。PSD-95是一種由724個氨基酸構成的突觸后蛋白,與突觸的可塑性、學習記憶等相關,其變異可導致個體智能障礙。PSD-95參與了樹突棘的生長、發(fā)育、分支及成熟,在突觸信號修飾方面也發(fā)揮作用[12]。神經(jīng)元PSD-95的表達增多和突觸興奮性增強相關[13],而AD及輕度認知障礙(minimal cognitive impairment,MCI)患者的神經(jīng)元PSD-95表達則明顯下降。

    本研究中藥物組MAP-2表達增高說明MDP可促進樹突形成,從而促進新突觸形成,改善突觸可塑性,增強大鼠的學習和記憶能力;另一方面,藥物組大鼠SYP與PSD-95也明顯升高,說明MDP能夠保存現(xiàn)有突觸,并促進了突觸重建與再生,從而保護了缺血缺氧損傷的神經(jīng)組織。PSD-95與MAP-2表達增加,也提示神經(jīng)元樹突的生成和樹突棘的增多和成熟,為突觸重建創(chuàng)造了條件。電鏡觀察也證實MDP治療后大鼠突觸結構正常,尺寸增大,突觸囊泡豐富,這些為神經(jīng)信息的高效傳遞和處理創(chuàng)造了物質(zhì)條件。模型組突觸間隙消失,突觸前后膜界限不清,正常曲面消失,突觸囊泡減少或消失,線粒體嵴腫脹及破壞。相應的SYP、MAP-2、PSD-95表達均顯著低于假手術組及藥物組,表明突觸破壞、萎縮乃至消失,與其學習記憶能力降低不無關聯(lián)。

    綜上所述,MDP通過補腎填精、益氣通絡,使腎氣健旺、腦絡通順、五臟得調(diào),從而改善VD患者的認知功能。動物實驗證實該方能促進突觸再生,增強突觸相關蛋白SYP、PSD-95、MAP-2的表達,保證了突觸正常的生理結構和功能,為高效有序地處理神經(jīng)信息提供了物質(zhì)基礎。本研究結果為MDP在臨床上的推廣應用提供了進一步的實驗依據(jù)。

    [1]Chan K Y,Wang W,Wu J J,et al.Epidemiology of Alzheimer’s disease and other forms of dementia in China,1990-2010:a systematic review and analysis[J].Lancet,2013,381(9882):2016-2023.

    [2]譚子虎,蘭漢超,楊瓊,等.加減薯蕷丸對非癡呆血管性認知功能障礙早期干預的臨床研究[J].中國中西醫(yī)結合雜志,2013,33(1):27-30.TAN Zihu,LAN Hanchao,YANG Qiong,et al.Clinical research of early intervention of Modified Shuyu Pill in vascular cognitive impairment no dementia[J].Chinese Journal of Integrated Traditional and Western Medicine,2013,33(1):27-30.

    [3]譚子虎,劉煜,李妮.加減薯蕷丸結合針刺治療中風后失語癥臨床觀察[J].中國中醫(yī)急癥,2013,22(1):34-35.TAN Zihu,LIU Yu,LI Ni.Clinical observation of Modified Shuyu Pill combined with acupuncture on aphasia after stroke[J].Journal of Emergency in Traditional Chinese Medicine,2013,22(1):34-35.

    [4]譚子虎,陳延.加減薯蕷丸對血管性癡呆大鼠海馬BDNF mRNA表達的影響[J].上海中醫(yī)藥大學學報,2016,30(4):69-72.TAN Zihu,CHEN Yan.Effects of Modified Yam Pill on the expression of brain-derived neurotropic factor in the hippocampus of vascular dementia rats[J].Journal of Shanghai University of Traditional Chinese Medicine,2016,30(4):69-72.

    [5]Shang Y,Wang X,Shang X,et al.Repetitive transcranial magnetic stimulation effectively facilitates spatial cognition and synaptic plasticity associated with increasing the levels of BDNF and synaptic proteins in Wistar rats[J].Neurobiol Learn Mem,2016,134(Pt B):369-378.

    [6]黃繼漢,黃曉暉,陳志揚,等.藥理試驗中動物間和動物與人體間的等效劑量換算[J].中國臨床藥理學與治療學,2004,9(9):1069-1072.HUANG Jihan,HUANG Xiaohui,CHEN Zhiyang,et al.Equivalent dose conversion between animal and animal,animal and human body in pharmacological test[J].Chin J Clin Pharm Therap,2004,9(9):1069-1072.

    [7]黃媛媛,張顏波,李美藝,等.低氧預適應對缺血再灌注腦損傷小鼠學習記憶的影響及機制研究[J].中華行為醫(yī)學與腦科學雜志,2016,25(2):108-111.HUANG Yuanyuan,ZHANG Yanbo,LI Meiyi,et al.Effects of hypoxic preconditioning on learning and memory in mice with cerebral sichemia-reperfusion injury and underlying mechanisms[J].Chin J Behave Med Brain Sci,2016,25(2):108-111.

    [8]汪昂.醫(yī)方集解[M].吳少禎,劉洋,編校.北京:中國醫(yī)藥科技出版社,2011:6.WANG Ang.Collected ExegesisofRecipes[M].WU Shaozhen,LIU Yang,edit.Beijing:China Medical Science Press,2011:6.

    [9]Duman R S,Aghajanian G K.Synaptic dysfunction in depression:potential therapeutic targets[J].Science,2012,338(6103):68-72.

    [10]Yadav L,Babu M K,Das K,et al.Role of synaptophysin in the intraoperative assessment of quadrantic innervation of the proximal doughnut in Hirschsprung disease[J].Natl Med J India,2017,30(4):187-192.

    [11]Zeng X,Chen S,Gao Q,et al.The expression of G protein-coupled receptor kinase 5 and its interaction with dendritic marker microtubule associated protein-2 after status epilepticus[J].Epilepsy Res,2017,138:62-70.

    [12]Zhu J,Zhou Q,Shang Y,etal.Synaptic targeting and function of SAPAPs mediated by phosphorylation-dependent binding to PSD-95 MAGUKs[J].Cell Rep,2017,21(13):3781-3793.

    [13]Chugh D,Nilsson P,Afjei S A,et al.Brain inflammation induces post-synaptic changes during early synapse formation in adult-born hippocampal neurons[J].Exp Neurol,2013,250:176-188.

    猜你喜歡
    樹突海馬蛋白
    海馬
    科學家揭示大腦連接的真實結構 解決了樹突棘保存難題
    海外星云(2021年6期)2021-10-14 07:20:40
    海馬
    豬胎盤蛋白的分離鑒定
    中成藥(2017年8期)2017-11-22 03:19:00
    “海馬”自述
    自噬蛋白Beclin-1在膽囊癌中的表達及臨床意義
    siRNA干預樹突狀細胞CD40表達對大鼠炎癥性腸病的治療作用
    SAK -HV 蛋白通過上調(diào) ABCG5/ABCG8的表達降低膽固醇的吸收
    樹突狀細胞疫苗抗腫瘤免疫研究進展
    海馬
    琪琪午夜伦伦电影理论片6080| 看黄色毛片网站| 国产精品一区二区精品视频观看| 久久狼人影院| 一个人观看的视频www高清免费观看 | 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 日韩欧美一区二区三区在线观看| 国产成人精品久久二区二区91| 人人妻人人澡人人看| 天堂影院成人在线观看| 国产视频一区二区在线看| 精品久久久久久,| 亚洲无线在线观看| 国产日本99.免费观看| 中文字幕久久专区| 黄色 视频免费看| 婷婷六月久久综合丁香| 色综合站精品国产| 亚洲成a人片在线一区二区| 免费在线观看日本一区| 天天一区二区日本电影三级| 老汉色∧v一级毛片| 亚洲美女黄片视频| 亚洲久久久国产精品| 老汉色∧v一级毛片| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 动漫黄色视频在线观看| 人成视频在线观看免费观看| 亚洲国产欧美网| 色尼玛亚洲综合影院| 99热6这里只有精品| 久久人妻福利社区极品人妻图片| 欧美黑人精品巨大| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 亚洲成人久久性| 精品福利观看| 欧美乱码精品一区二区三区| 99久久99久久久精品蜜桃| 99精品在免费线老司机午夜| 中文字幕最新亚洲高清| 中文字幕人妻熟女乱码| 国产三级黄色录像| 欧美在线黄色| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 欧美乱色亚洲激情| 久久精品人妻少妇| 天堂动漫精品| 日本 欧美在线| 精品熟女少妇八av免费久了| 精品久久蜜臀av无| 成人18禁在线播放| 国产99久久九九免费精品| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看 | 69av精品久久久久久| 后天国语完整版免费观看| 三级毛片av免费| 午夜成年电影在线免费观看| 国产伦在线观看视频一区| 国产精品一区二区精品视频观看| 91成人精品电影| 90打野战视频偷拍视频| x7x7x7水蜜桃| 十八禁网站免费在线| www.熟女人妻精品国产| 精品无人区乱码1区二区| 亚洲一码二码三码区别大吗| 午夜福利一区二区在线看| 国产精品亚洲一级av第二区| 成人永久免费在线观看视频| 成人18禁在线播放| 国产精品 欧美亚洲| 久久午夜亚洲精品久久| 黄片大片在线免费观看| 日韩视频一区二区在线观看| 亚洲男人天堂网一区| 国产精品久久久久久精品电影 | or卡值多少钱| 18禁国产床啪视频网站| 欧美日本亚洲视频在线播放| 神马国产精品三级电影在线观看 | 欧美又色又爽又黄视频| 色婷婷久久久亚洲欧美| 人妻丰满熟妇av一区二区三区| 欧美国产日韩亚洲一区| 欧美中文日本在线观看视频| 最近在线观看免费完整版| 18禁美女被吸乳视频| 露出奶头的视频| 男女视频在线观看网站免费 | 在线观看日韩欧美| 欧美国产日韩亚洲一区| 操出白浆在线播放| 久久中文看片网| 在线观看66精品国产| 免费在线观看黄色视频的| 91麻豆精品激情在线观看国产| 色婷婷久久久亚洲欧美| 在线看三级毛片| 久久久久久国产a免费观看| 亚洲国产高清在线一区二区三 | 国产v大片淫在线免费观看| 长腿黑丝高跟| 免费无遮挡裸体视频| 很黄的视频免费| 亚洲av美国av| 久久久久国产精品人妻aⅴ院| 国产极品粉嫩免费观看在线| 国产精品免费一区二区三区在线| 欧美精品啪啪一区二区三区| 久久 成人 亚洲| 欧美久久黑人一区二区| 亚洲男人的天堂狠狠| 亚洲一区高清亚洲精品| 国产极品粉嫩免费观看在线| 久久九九热精品免费| a在线观看视频网站| 久久精品国产亚洲av高清一级| 他把我摸到了高潮在线观看| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 国产一级毛片七仙女欲春2 | 午夜亚洲福利在线播放| 亚洲狠狠婷婷综合久久图片| 91麻豆精品激情在线观看国产| 亚洲片人在线观看| 亚洲欧美日韩无卡精品| 免费看a级黄色片| 波多野结衣高清无吗| 久久精品人妻少妇| 久久久久久九九精品二区国产 | 久久久久久国产a免费观看| 欧美激情 高清一区二区三区| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 午夜福利18| 色老头精品视频在线观看| 中文字幕久久专区| 欧美大码av| 国产av一区在线观看免费| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 欧美乱妇无乱码| 亚洲精品粉嫩美女一区| 黄片小视频在线播放| 国产蜜桃级精品一区二区三区| 久久久国产欧美日韩av| 久久久久亚洲av毛片大全| 久久久久久人人人人人| ponron亚洲| 精品一区二区三区视频在线观看免费| 国产精品一区二区精品视频观看| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 手机成人av网站| 超碰成人久久| 又黄又粗又硬又大视频| 亚洲专区字幕在线| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 99国产精品一区二区三区| 国产亚洲精品一区二区www| 99久久99久久久精品蜜桃| 91在线观看av| 国产熟女xx| 成人永久免费在线观看视频| av电影中文网址| 91在线观看av| 久久久久免费精品人妻一区二区 | 少妇粗大呻吟视频| 国产99白浆流出| 亚洲一区二区三区色噜噜| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 欧美成人午夜精品| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲| 成人永久免费在线观看视频| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看 | 俺也久久电影网| a在线观看视频网站| 禁无遮挡网站| 麻豆国产av国片精品| 真人一进一出gif抽搐免费| 99在线视频只有这里精品首页| 青草久久国产| 欧美在线一区亚洲| 桃色一区二区三区在线观看| 一级毛片高清免费大全| 亚洲熟女毛片儿| 黑人巨大精品欧美一区二区mp4| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 无限看片的www在线观看| 久久精品亚洲精品国产色婷小说| 国产伦在线观看视频一区| 久久久久免费精品人妻一区二区 | 成人av一区二区三区在线看| 成人特级黄色片久久久久久久| 亚洲av片天天在线观看| 成人精品一区二区免费| 中文字幕av电影在线播放| 午夜免费鲁丝| 夜夜躁狠狠躁天天躁| 欧美一级a爱片免费观看看 | 欧美中文综合在线视频| 日韩欧美在线二视频| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 少妇 在线观看| 欧美激情久久久久久爽电影| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 中文资源天堂在线| 亚洲专区字幕在线| 一本大道久久a久久精品| 精品国产国语对白av| 精品国产国语对白av| 色综合婷婷激情| 亚洲av成人一区二区三| 9191精品国产免费久久| 国语自产精品视频在线第100页| 久久久久亚洲av毛片大全| 国产精品,欧美在线| 搡老岳熟女国产| 久久狼人影院| 久久久久亚洲av毛片大全| 搞女人的毛片| 伦理电影免费视频| 两性夫妻黄色片| 成人免费观看视频高清| 午夜影院日韩av| 激情在线观看视频在线高清| 国产又黄又爽又无遮挡在线| 十八禁人妻一区二区| АⅤ资源中文在线天堂| 久久99热这里只有精品18| 国产伦一二天堂av在线观看| 久久久久久久久久黄片| 国产精品98久久久久久宅男小说| 天堂影院成人在线观看| 怎么达到女性高潮| 99久久99久久久精品蜜桃| 国产免费男女视频| av免费在线观看网站| 亚洲熟女毛片儿| 久久久久久九九精品二区国产 | 麻豆久久精品国产亚洲av| 男人舔奶头视频| www日本黄色视频网| 欧美午夜高清在线| 天堂动漫精品| 精品久久久久久久毛片微露脸| 免费观看人在逋| 中亚洲国语对白在线视频| 嫁个100分男人电影在线观看| 好男人在线观看高清免费视频 | 国产一区二区三区视频了| 国产精品久久久久久亚洲av鲁大| 成人三级黄色视频| 欧美午夜高清在线| 女生性感内裤真人,穿戴方法视频| 嫩草影院精品99| 男女视频在线观看网站免费 | 欧美成人一区二区免费高清观看 | 国产一级毛片七仙女欲春2 | 久久久国产成人免费| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 精品午夜福利视频在线观看一区| 国产久久久一区二区三区| 我的亚洲天堂| 黑人操中国人逼视频| 亚洲av五月六月丁香网| 免费在线观看影片大全网站| 亚洲精品一区av在线观看| 国内揄拍国产精品人妻在线 | 久久久久久久精品吃奶| 真人一进一出gif抽搐免费| 久久精品国产亚洲av高清一级| 国产av一区在线观看免费| 午夜福利在线观看吧| xxx96com| 1024手机看黄色片| 成人午夜高清在线视频 | 黄片大片在线免费观看| 国产精品自产拍在线观看55亚洲| 男女做爰动态图高潮gif福利片| 久久精品国产亚洲av香蕉五月| 免费高清视频大片| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| a级毛片在线看网站| 好男人在线观看高清免费视频 | 国产高清视频在线播放一区| 村上凉子中文字幕在线| 国产欧美日韩一区二区三| 国产三级黄色录像| 99国产精品一区二区蜜桃av| 真人一进一出gif抽搐免费| 女人被狂操c到高潮| 级片在线观看| 黄色毛片三级朝国网站| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看 | 在线观看免费午夜福利视频| www国产在线视频色| 久久人妻av系列| 亚洲中文日韩欧美视频| 天天一区二区日本电影三级| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 色在线成人网| 亚洲精品色激情综合| 黄频高清免费视频| 国产av又大| 色av中文字幕| 久久青草综合色| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲| 日本黄色视频三级网站网址| 男女午夜视频在线观看| 亚洲第一青青草原| 国产精品自产拍在线观看55亚洲| 又大又爽又粗| 国产97色在线日韩免费| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 国产成人欧美| 日韩欧美一区视频在线观看| 亚洲无线在线观看| 91国产中文字幕| 精品久久久久久成人av| 午夜日韩欧美国产| 精品国产亚洲在线| 两个人免费观看高清视频| 国产伦人伦偷精品视频| 美女 人体艺术 gogo| 男女那种视频在线观看| 午夜激情av网站| 国产成人系列免费观看| 琪琪午夜伦伦电影理论片6080| 国产精华一区二区三区| 狂野欧美激情性xxxx| 热re99久久国产66热| 亚洲精品中文字幕在线视频| 国产真人三级小视频在线观看| 久久香蕉国产精品| 久久九九热精品免费| 日本在线视频免费播放| 99国产精品一区二区三区| 97碰自拍视频| 亚洲熟妇熟女久久| 这个男人来自地球电影免费观看| 久久香蕉激情| xxx96com| 在线观看66精品国产| 搡老岳熟女国产| 黑丝袜美女国产一区| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片 | 在线观看舔阴道视频| 老司机靠b影院| 国产精品免费一区二区三区在线| 国产成人精品久久二区二区91| 亚洲欧美激情综合另类| 国产精品一区二区免费欧美| 国产精品98久久久久久宅男小说| 变态另类丝袜制服| 两人在一起打扑克的视频| av免费在线观看网站| 久久香蕉国产精品| 欧美另类亚洲清纯唯美| 一区二区三区高清视频在线| av视频在线观看入口| 亚洲人成网站高清观看| 男女午夜视频在线观看| 久久精品夜夜夜夜夜久久蜜豆 | 熟女电影av网| 国产欧美日韩一区二区三| 亚洲 欧美 日韩 在线 免费| 国产私拍福利视频在线观看| 色精品久久人妻99蜜桃| 国产久久久一区二区三区| 国产黄片美女视频| 久久亚洲精品不卡| 久久久久久久精品吃奶| 99热这里只有精品一区 | 国产真人三级小视频在线观看| 国产亚洲精品久久久久5区| 成人国语在线视频| 国产伦一二天堂av在线观看| av中文乱码字幕在线| 亚洲精品美女久久av网站| 久久性视频一级片| 精品久久久久久久久久免费视频| 欧美激情久久久久久爽电影| 美女免费视频网站| 国产精品精品国产色婷婷| 日韩一卡2卡3卡4卡2021年| 国产亚洲精品综合一区在线观看 | 男人舔奶头视频| 国产精品自产拍在线观看55亚洲| aaaaa片日本免费| 亚洲av成人一区二区三| 精品人妻1区二区| 国产精品精品国产色婷婷| av片东京热男人的天堂| 亚洲av成人一区二区三| 婷婷精品国产亚洲av在线| 久久久精品欧美日韩精品| 日韩一卡2卡3卡4卡2021年| 久久久久免费精品人妻一区二区 | 国产精品av久久久久免费| aaaaa片日本免费| 韩国av一区二区三区四区| 波多野结衣av一区二区av| 男女之事视频高清在线观看| 成人三级做爰电影| 亚洲专区国产一区二区| 亚洲,欧美精品.| 1024手机看黄色片| 男男h啪啪无遮挡| 村上凉子中文字幕在线| 51午夜福利影视在线观看| 国产激情久久老熟女| 一二三四在线观看免费中文在| 亚洲激情在线av| 免费女性裸体啪啪无遮挡网站| 久久久久九九精品影院| 国产区一区二久久| 亚洲人成网站高清观看| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲| 在线观看www视频免费| 午夜福利在线在线| 免费电影在线观看免费观看| 亚洲无线在线观看| 精品久久久久久久末码| 精品无人区乱码1区二区| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| 国产精品电影一区二区三区| www日本在线高清视频| 精品国产亚洲在线| 美女大奶头视频| 人人妻人人澡欧美一区二区| 一区二区日韩欧美中文字幕| videosex国产| 午夜福利在线观看吧| 成人三级做爰电影| 午夜两性在线视频| 色综合站精品国产| 亚洲欧美精品综合久久99| 在线观看免费视频日本深夜| 99在线人妻在线中文字幕| 欧美丝袜亚洲另类 | 成人亚洲精品av一区二区| 女性被躁到高潮视频| 久久久久久久久久黄片| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| www日本在线高清视频| 欧美激情 高清一区二区三区| 99久久国产精品久久久| 色老头精品视频在线观看| 深夜精品福利| 久久这里只有精品19| 手机成人av网站| 哪里可以看免费的av片| av片东京热男人的天堂| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 天堂√8在线中文| 国产精品亚洲av一区麻豆| 麻豆成人av在线观看| av有码第一页| 亚洲av电影不卡..在线观看| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 成人免费观看视频高清| 99热这里只有精品一区 | 久久香蕉国产精品| 国产精品久久电影中文字幕| 久久婷婷成人综合色麻豆| 免费高清在线观看日韩| 伦理电影免费视频| 欧美一区二区精品小视频在线| 叶爱在线成人免费视频播放| 久久香蕉激情| 国产av一区在线观看免费| 又黄又爽又免费观看的视频| 男人舔女人的私密视频| 久久久久久久久久黄片| 亚洲五月天丁香| 欧美一级毛片孕妇| 香蕉久久夜色| 最好的美女福利视频网| 一个人免费在线观看的高清视频| 国产成人一区二区三区免费视频网站| 欧美激情久久久久久爽电影| 一区福利在线观看| 日韩高清综合在线| 欧美中文综合在线视频| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| a在线观看视频网站| 高清在线国产一区| 亚洲电影在线观看av| 日韩三级视频一区二区三区| 国产av又大| 丁香六月欧美| 婷婷精品国产亚洲av| 一a级毛片在线观看| 色精品久久人妻99蜜桃| 法律面前人人平等表现在哪些方面| 国产乱人伦免费视频| 97碰自拍视频| 国产精品一区二区三区四区久久 | 精品久久久久久久末码| 老司机午夜福利在线观看视频| 久久精品亚洲精品国产色婷小说| 精品国产美女av久久久久小说| 精品无人区乱码1区二区| 美女国产高潮福利片在线看| 老汉色av国产亚洲站长工具| 欧美另类亚洲清纯唯美| 18禁观看日本| 久久久久国内视频| 女人爽到高潮嗷嗷叫在线视频| 久久天堂一区二区三区四区| 国产视频内射| 色哟哟哟哟哟哟| 免费搜索国产男女视频| 久久久久久久久中文| 国产欧美日韩一区二区三| 桃色一区二区三区在线观看| 精品一区二区三区视频在线观看免费| 搡老妇女老女人老熟妇| 亚洲精品av麻豆狂野| 国产精品久久久久久精品电影 | 成人av一区二区三区在线看| 亚洲七黄色美女视频| 黄色毛片三级朝国网站| 亚洲激情在线av| 可以免费在线观看a视频的电影网站| 老司机靠b影院| 久久久国产成人免费| 妹子高潮喷水视频| 久久久国产成人免费| 自线自在国产av| 成人国语在线视频| 中文字幕人成人乱码亚洲影| 欧美中文综合在线视频| 成人三级黄色视频| www国产在线视频色| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 久久这里只有精品19| 欧美亚洲日本最大视频资源| 中亚洲国语对白在线视频| 又黄又粗又硬又大视频| 精品久久久久久久毛片微露脸| 欧美最黄视频在线播放免费| 国产一区二区激情短视频| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区| 中文字幕久久专区| 国产精品九九99| 中文字幕av电影在线播放| 变态另类丝袜制服| 国产激情偷乱视频一区二区| 亚洲无线在线观看| 中文资源天堂在线| 久久人妻福利社区极品人妻图片| 成人永久免费在线观看视频| 欧美激情高清一区二区三区| 岛国在线观看网站| 亚洲国产精品成人综合色| 亚洲色图av天堂| 日本 欧美在线| 变态另类成人亚洲欧美熟女| 中国美女看黄片| 又紧又爽又黄一区二区| 男人的好看免费观看在线视频 | 一级黄色大片毛片| 一级片免费观看大全| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看 | 国产爱豆传媒在线观看 | 嫁个100分男人电影在线观看| 国产一级毛片七仙女欲春2 | 国产精华一区二区三区| 国产成人精品久久二区二区免费| 在线天堂中文资源库| 国产精品电影一区二区三区| 久久久水蜜桃国产精品网| 免费在线观看日本一区| 亚洲国产欧洲综合997久久, | 久久久国产成人免费| 国产精品1区2区在线观看.| 免费人成视频x8x8入口观看| 又黄又爽又免费观看的视频| 亚洲精华国产精华精| 激情在线观看视频在线高清| av超薄肉色丝袜交足视频| 变态另类成人亚洲欧美熟女| 一本久久中文字幕| 亚洲 国产 在线| 两性夫妻黄色片| 动漫黄色视频在线观看| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区| 十分钟在线观看高清视频www| 亚洲成人精品中文字幕电影| 女人被狂操c到高潮| 亚洲国产精品sss在线观看| 色综合欧美亚洲国产小说| 婷婷精品国产亚洲av| 国产高清激情床上av| 国产伦人伦偷精品视频| 欧美一级毛片孕妇| 成年版毛片免费区| or卡值多少钱| 精品久久久久久成人av| 91麻豆精品激情在线观看国产| 久久人妻av系列| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 欧美一级毛片孕妇| 美女午夜性视频免费| 精品欧美一区二区三区在线| 男女做爰动态图高潮gif福利片| 黄色丝袜av网址大全| 在线观看www视频免费| 国产色视频综合| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 黄片小视频在线播放| 久久国产精品人妻蜜桃| 亚洲,欧美精品.| x7x7x7水蜜桃|