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    金納米粒子模擬過(guò)氧化物酶的初步研討

    2018-06-28 10:01:30劉競(jìng)文關(guān)樺楠張家成
    農(nóng)產(chǎn)品加工 2018年11期
    關(guān)鍵詞:浸泡液光度粒徑

    劉競(jìng)文,關(guān)樺楠,張家成

    (哈爾濱商業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,黑龍江哈爾濱 150076)

    金納米粒子是目前所發(fā)現(xiàn)的一類(lèi)貴金屬納米材料。帶正電荷或者帶負(fù)電荷的金納米粒子,其金納米粒子表現(xiàn)出類(lèi)似的過(guò)氧化物酶的催化活性[1-2]。Wang S等人[3]研究表明,模仿過(guò)氧化物酶的催化能力是來(lái)自黃金納米粒子的本身。修飾的金納米粒子表面改變修飾劑和底物的結(jié)合能力,最終控制了納米粒子的催化活性。

    金納米粒子在生物醫(yī)學(xué)檢測(cè)等領(lǐng)域有著較為廣泛的應(yīng)用,而且與葡萄糖氧化酶、葡萄糖催化能力極其相似。基于有過(guò)氧化物酶性質(zhì)的雙金屬合金納米粒子Ag@M(M-Pt,Au和Pd),也有一些酶的性質(zhì)[4]。以弱還原劑還原雙金屬離子制備了銀基雙金屬中空-介孔納米材料,其催化活性可以通過(guò)不同比例的2種金屬調(diào)整,這是除了規(guī)定的大小和酶的催化能力外模擬調(diào)節(jié)有效方法。

    天然酶因其催化效率高和反應(yīng)特異性較強(qiáng),在醫(yī)藥、化工、食品和農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。然而,天然酶容易受環(huán)境的影響而失去催化活性。此外,制備、純化和貯藏時(shí)浪費(fèi)時(shí)間比較多。因此,研究和開(kāi)發(fā)具有催化活性的來(lái)源豐富、價(jià)格低廉及穩(wěn)定的仿照酶具有重要意義。納米材料因其表面效應(yīng)和量子尺寸效應(yīng)而在許多領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用[5-6]。氧化物納米材料與碳基納米材料、貴金屬納米材料已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)并摹仿了酶的特性。與天然酶(Natural enzyme) 相比較,仿照酶具有催化活性高、穩(wěn)定性好、可控合成的成本低等優(yōu)點(diǎn)[7-8]。基于此,試驗(yàn)采用的葡萄皮浸泡液進(jìn)行綠色還原法制備金納米粒子,對(duì)其進(jìn)行表征,并窺探金納米粒子的過(guò)氧化物酶仿照酶活性,確定仿照酶催化體系。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    雙氧水、碳酸鉀、硼氫化鈉、乙酸、乙醇,上海振興化工一廠提供;氯金酸,天津市華東試劑廠提供,以上試劑均為分析級(jí)。

    1.2 儀器與設(shè)備

    H-7500型透射電子顯微鏡,日本電子株式會(huì)社產(chǎn)品;LDJ 9600型振動(dòng)磁強(qiáng)計(jì),北京翠海佳誠(chéng)磁電科技有限責(zé)任公司產(chǎn)品;BT-9300H型激光粒度分布儀,美國(guó)麥克儀器公司產(chǎn)品。

    1.3 試驗(yàn)方法

    1.3.1 金納米粒子的制備與表征

    將100 g的葡萄皮浸泡于水溫為80℃的200 mL去離子水中,自然冷卻至室溫。將浸泡液于離心機(jī)中以轉(zhuǎn)速4 000 r/min離心3 min,抽取上清液作為母液(即100%工作液)。用去離子水將母液分別濃縮且獲得質(zhì)量分?jǐn)?shù)為50%,20%,10%,1%的母液葡萄皮工作液200 mL,置冰箱4℃條件下保存(不超過(guò)2 d),在室溫條件下,將提前在4℃預(yù)冷的氯金酸溶液(20 mL,1%,W/V) 置于反應(yīng)皿中,伴隨磁力攪拌器溫和攪動(dòng);2 min后,迅速加入不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)(50%,20%,10%,1%) 的工作液5 mL,立即觀察各個(gè)試管中顏料的變化,即系統(tǒng)溶液顏料由黃色變?yōu)樽仙僮優(yōu)榫萍t色,當(dāng)溶液顏料出現(xiàn)酒紅色時(shí),攪拌速度加快,20 min后結(jié)束反應(yīng),并將反應(yīng)液放在冰箱4℃條件下保存。

    吸取1 mL的金納米粒子溶膠后加入到比色皿中,立即再加入2 mL的去離子水,然后混合均勻,放于紫外-可見(jiàn)光分光光度計(jì)中,掃描金納米粒子的吸收光譜,確定最大吸收峰波長(zhǎng)(520~550 nm),比較不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的浸泡液所制備金納米粒子的可見(jiàn)光吸收光譜,從而初步判別金納米粒子的粒徑與含量。溶液中金納米粒子的粒度分布情況由激光粒度儀來(lái)窺探。觀察金納米粒子的表觀形貌用透射電子顯微鏡。

    1.3.2 單要素優(yōu)化金納米粒子模擬酶催化體系

    (1)H2O2濃度對(duì)催化體系的影響。將1 mL的金納米粒子溶膠加入到盛有5m L的HCl-NaAc緩沖液(pH值5) 的離心管中,再依次加入200 μL的四甲基聯(lián)苯胺溶液(TMB,25 mmol/L))和500 μL的H2O2(0.05,0.10,0.25,0.50,1.00 mol/L),混合均勻后,將反應(yīng)體系放置于40℃的水浴鍋中,水浴10 min后取出(水浴行程中每過(guò)1 min溫和倒轉(zhuǎn)1次),吸取上清液3 mL,以蒸餾水為空缺,測(cè)定于波長(zhǎng)652 nm處吸光度,重復(fù)試驗(yàn)3次。

    (2)催化溫度對(duì)催化體系的影響。將1 mL金納米粒子溶膠加入到盛有5 mL的HCl-NaAc緩沖液(pH值5) 的離心管中,再依次加入200 μL的四甲基聯(lián)苯胺溶液 (TMB,25 mmol/L) 和 500 μL的H2O2(1.00 mol/L),混勻后,將反應(yīng)體系放置于不同催化溫度(30,35,40,45,50℃) 水浴鍋中,水浴10 min后(水浴行程中每過(guò)1 min溫和倒轉(zhuǎn)1次)取出,靜置1 min,吸取上清液3 mL,蒸餾水為空缺,測(cè)定于波長(zhǎng)652 nm處吸光度,重復(fù)試驗(yàn)3次。

    (3)催化時(shí)間對(duì)TMB濃度體系的影響。將1 mL金納米粒子溶膠加入到盛有5 mL HCl-NaAc緩沖液(pH值5) 的離心管中,再依次加入200 μL的四甲基聯(lián)苯胺溶液(TMB,25 mmol/L) 和500 μL的H2O2(1.00 mol/L),混勻后,將反應(yīng)體系放置于40℃水浴鍋中,水浴不同催化時(shí)間(5,10,15,20,25 min)后取出(水浴行程中每過(guò)1 min溫和倒轉(zhuǎn)1次),靜置1 min,吸取上清液3 mL,以蒸餾水為空缺,測(cè)定于波長(zhǎng)652 nm處吸光度,重復(fù)試驗(yàn)3次。

    1.3.3 正交設(shè)計(jì)優(yōu)化金納米粒子模擬酶催化體系

    分別窺探H2O2濃度(A)、催化溫度(B) 和催化時(shí)間(C)對(duì)整個(gè)試驗(yàn)體系的影響,每種要素設(shè)計(jì)3個(gè)水平(根據(jù)單要素試驗(yàn)優(yōu)化得出),選用L9(34)正交表優(yōu)化試驗(yàn)方案。

    因素程度見(jiàn)表1。

    表1 因素程度

    第3列為空列,作為誤差來(lái)源,撥取直觀闡述法確定要素影響的主次依序及優(yōu)選方案,采用方差闡述法確定要素對(duì)體系的影響程度。根據(jù)正交設(shè)計(jì)表,分別制備不同的處理,將1 mL金納米粒子溶膠加入到盛有5 mL的HCl-NaAc緩沖液(pH值5) 離心管中,再依次加入200 μL的四甲基聯(lián)苯胺溶液(TMB,25 mmol/L) 和 500 μL 的 H2O2(單因素優(yōu)化結(jié)果),混勻后,將反應(yīng)體系放置于水浴鍋中(催化溫度為單因素優(yōu)化結(jié)果),水浴一段催化時(shí)間(單因素優(yōu)化結(jié)果)后取出(水浴行程中每過(guò)1 min溫和倒轉(zhuǎn) 1次),靜置1 min,吸取上清液3 mL,以蒸餾水為空缺,測(cè)定于波長(zhǎng)652 nm處吸光度,目標(biāo)越大越好,重復(fù)試驗(yàn)3次。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 金納米粒子的表征

    在金納米粒子眾多的制備方法中,最常見(jiàn)的就是化學(xué)還原制備法,其原理是向一定濃度的金離子溶液中加入化學(xué)還原劑,將三價(jià)態(tài)的金離子還原為零價(jià)態(tài)的金,從而制備出金納米粒子。借鑒此原理,選擇含有豐富還原性物質(zhì)的葡萄皮浸泡液制備金納米粒子。葡萄皮浸泡液含有豐富的抗壞血酸和黃酮類(lèi)物質(zhì),具有良好的還原性,可以制備金納米粒子。

    葡萄皮浸泡母液及不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)葡萄皮浸泡液制備的納米粒子溶膠見(jiàn)圖1。

    在試驗(yàn)的操作行程中可以清晰地看到,反應(yīng)溶液由黃色變?yōu)樽仙僮優(yōu)榫萍t色,說(shuō)明有金納米粒子的生成。為了探究不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)葡萄皮浸泡液所制備金納米粒子的性能區(qū)別,將對(duì)所制備的金納米粒子進(jìn)行體系的表征。

    圖1 葡萄皮浸泡母液及不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)葡萄皮浸泡液制備的納米粒子溶膠

    紫外-可見(jiàn)吸收光譜是研討膠體金的常用方法,紫外-可見(jiàn)光譜對(duì)高分散和締合態(tài)存在的金屬顆粒有完全不同的響應(yīng),通過(guò)闡述其譜圖,可以得到有關(guān)顆粒大小和形狀等重要信息。在波長(zhǎng)520 nm附近出現(xiàn)的吸收峰,可被指認(rèn)為金納米顆粒的等離子共振紫外吸收特征峰,此吸收峰的位置、形狀與顆粒的大小、形狀與分散狀態(tài)密切相關(guān)。根據(jù)Mie理論,金納米粒子會(huì)在波長(zhǎng)520 nm左右出現(xiàn)明顯的吸收峰。

    不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)葡萄皮浸泡液制備金納米粒子的紫外-可見(jiàn)光吸收光譜見(jiàn)圖2。

    圖2 不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)葡萄皮浸泡液制備金納米粒子的紫外-可見(jiàn)光吸收光譜

    根據(jù)圖2中的結(jié)果顯示,不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的浸泡液所制備的金納米粒子在粒徑和含量上具有較明顯的區(qū)別。紫外-可見(jiàn)光吸收光譜的結(jié)果表明,4種質(zhì)量分?jǐn)?shù)葡萄皮浸泡液所制備的金納米粒子在波長(zhǎng)530~569 nm范圍內(nèi)具有明顯的吸收峰,根據(jù)吸光度值初步判斷,都獲得了金納米粒子。1%,10%,20%浸泡液所制備的金納米粒子,在波長(zhǎng)540 nm附近出現(xiàn)了特征吸收峰。但是,伴隨著浸泡液質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增大而峰值逐漸下降,說(shuō)明金納米粒子生成的數(shù)量伴隨浸泡液質(zhì)量分?jǐn)?shù)的提高而在減少,原因可能是葡萄皮中除含有還原性物質(zhì)之外還含有高質(zhì)量分?jǐn)?shù)的大分子物質(zhì)(如氨基酸或者有機(jī)酸等),這類(lèi)物質(zhì)反而抑制了金種的生長(zhǎng),造成金種的聚集,使其無(wú)法獲得合適粒徑的金納米粒子。與此同時(shí),50%浸泡液所制備的金納米粒子吸收峰發(fā)生偏移,說(shuō)明金納米粒子整體粒徑變大,催化性能下降,不宜用于下一步試驗(yàn)。

    分別在1%,10%,20%的3個(gè)浸泡液質(zhì)量分?jǐn)?shù)條件下,所合成金納米粒子的粒徑大小區(qū)別較大。根據(jù)吸收峰波長(zhǎng)位置,初步判定3種質(zhì)量分?jǐn)?shù)浸泡液所制備出的金納米粒子粒徑都在可接受的范圍內(nèi),由小到大依次為1%,10%,20%浸泡液質(zhì)量分?jǐn)?shù)。因此,選擇這3種質(zhì)量分?jǐn)?shù)的浸泡液所制備的金納米粒子參與下面的試驗(yàn)。

    針對(duì)篩選的3種質(zhì)量分?jǐn)?shù)葡萄皮浸泡液所制備出的金納米粒子,采用透射電子掃描顯微鏡觀察其外觀形貌和粒徑大小。

    透射電子掃描顯微鏡圖片見(jiàn)圖3。

    圖3 透射電子掃描顯微鏡圖片

    由圖3可知,3種質(zhì)量分?jǐn)?shù)浸泡液所制備出的金納米粒子形狀均一,基本呈現(xiàn)圓球形。其中,1%質(zhì)量分?jǐn)?shù)浸泡液所制備出的金納米粒子分散度最好,基本沒(méi)有聚集;而10%和20%質(zhì)量分?jǐn)?shù)浸泡液所制備出的金納米粒子都呈現(xiàn)出不同程度的聚集,衡量金納米粒子的聚集情況決定了金納米粒子的穩(wěn)定性。由激光粒度儀測(cè)定結(jié)果可知,1%質(zhì)量分?jǐn)?shù)浸泡液所制備出的金納米粒子平均粒徑約為7 nm;10%質(zhì)量分?jǐn)?shù)浸泡液所制備出的金納米粒子平均粒徑約為10 nm;20%質(zhì)量分?jǐn)?shù)浸泡液所制備出的金納米粒子平均粒徑約為8 nm。根據(jù)粒徑越小、活性越強(qiáng)的原理,選擇1%質(zhì)量分?jǐn)?shù)的葡萄皮浸泡液所制備的金納米粒子參與模擬酶活性試驗(yàn)。

    2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果闡述

    2.2.1 H2O2濃度對(duì)催化體系的影響結(jié)果

    由于TMB的反應(yīng)產(chǎn)物為深藍(lán)色,且反應(yīng)產(chǎn)物越聚越大,所以顏色越深說(shuō)明模擬酶催化活性越大,根據(jù)此特點(diǎn)來(lái)測(cè)定于波長(zhǎng)652 nm處H2O2濃度的吸光度,并確定用吸光度作為單因素優(yōu)化的評(píng)定目標(biāo),窺探不同H2O2濃度對(duì)催化體系的影響。

    H2O2濃度對(duì)催化體系的影響結(jié)果見(jiàn)圖4。

    由圖4可知,H2O2濃度對(duì)催化體系有直接影響。H2O2濃度在0.05~0.25 mol/L時(shí),隨著H2O2濃度的增長(zhǎng)催化效率越來(lái)越高。H2O2濃度在0.25~1.00 mol/L時(shí),對(duì)反應(yīng)催化效率越來(lái)越低。在模擬酶催化體系中H2O2濃度取 0.10,0.25,0.50 mol/L。

    2.2.2 催化溫度對(duì)催化體系的影響結(jié)果

    圖4 H2O2濃度對(duì)催化體系的影響結(jié)果

    采用單因素變量法選定模擬酶活性試驗(yàn)不同因素的最適程度。首先,選取穩(wěn)定H2O2濃度(1.0 mol/L),催化時(shí)間30 min時(shí)。由于TMB的反應(yīng)產(chǎn)物為深藍(lán)色,且反應(yīng)產(chǎn)物越聚越大,所以顏色越深說(shuō)明催化活性越大,通過(guò)測(cè)定于波長(zhǎng)652 nm處的吸光度,并以吸光度作為單因素優(yōu)化的評(píng)定目標(biāo),窺探不同催化溫度對(duì)催化體系的影響。

    催化溫度對(duì)催化體系的影響結(jié)果見(jiàn)圖5。

    圖5 催化溫度對(duì)催化體系的影響結(jié)果

    由圖5可知,催化溫度在30~40℃時(shí),隨著催化溫度的增長(zhǎng),催化效率越來(lái)越高,40℃時(shí)催化效率達(dá)到最高值,隨后隨著催化溫度上升而下降,說(shuō)明納米金的催化能力在40℃最強(qiáng)。選取35,40,45℃為正交因素。

    2.2.3 催化時(shí)間對(duì)催化體系的影響結(jié)果

    采用單因素變量法選定模擬酶活性試驗(yàn)不同因素的最適程度。選取穩(wěn)定H2O2濃度(1.0 mol/L),催化溫度40℃,由于TMB反應(yīng)產(chǎn)物有深藍(lán)色,所以通過(guò)測(cè)定于波長(zhǎng)652 nm處的吸光度,并以吸光度作為單因素優(yōu)化的目標(biāo)。以吸光度為衡量目標(biāo),窺探不同催化時(shí)間對(duì)催化體系的影響。

    催化時(shí)間對(duì)催化體系的影響結(jié)果見(jiàn)圖6。

    圖6 催化時(shí)間對(duì)催化體系的影響結(jié)果

    由圖6可知,隨著催化時(shí)間的增長(zhǎng)催化效率越來(lái)越高,但最終趨于平緩。出于經(jīng)濟(jì)效益的考慮,在5~10 min時(shí),對(duì)反應(yīng)催化效率越來(lái)越低。在模擬酶催化體系中催化時(shí)間取15,20,25 min。

    2.3 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化模擬酶催化反應(yīng)體系

    試驗(yàn)在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,選擇3個(gè)較好程度,其中選取H2O2濃度(A)、催化溫度(B) 和催化時(shí)間(C)對(duì)整個(gè)試驗(yàn)的影響。以于波長(zhǎng)652 nm處的吸光度作為評(píng)價(jià)指標(biāo),采用L9(34)做正交試驗(yàn)表進(jìn)行正交試驗(yàn),再通過(guò)極差闡述確定最佳工藝條件。

    正交試驗(yàn)結(jié)果與分析見(jiàn)表2。

    表2 正交試驗(yàn)結(jié)果與分析

    由表2闡述可得,使用DPS軟件進(jìn)行極差闡述得出數(shù)據(jù),根據(jù)試驗(yàn)各因素模擬催化酶體系的影響力,其影響主次因素依序?yàn)锳>B>C,即H2O2濃度>催化溫度>催化時(shí)間。而通過(guò)極差分析來(lái)確定最優(yōu)方案組合,最優(yōu)方案組合為A2B1C2,即H2O2濃度0.25 mol/L,催化溫度35℃,催化時(shí)間20 min。綜上所述,催化時(shí)間是影響模擬酶催化體系的主要因素,H2O2濃度和催化溫度對(duì)模擬酶體系也有一定的影響。

    3 結(jié)論

    采用綠色合成法制備金納米粒子,并采用單因素試驗(yàn)及正交表設(shè)計(jì)優(yōu)化金納米粒子模擬酶催化活性體系,為探究催化溫度、催化時(shí)間和H2O2濃度對(duì)試驗(yàn)體系的影響,得到如下的試驗(yàn)結(jié)果:

    (1)不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)浸泡液所制備的金納米粒子在粒徑和含量上具有較明顯的區(qū)別,1%,10%,20%質(zhì)量分?jǐn)?shù)浸泡液所制備出的金納米粒子粒徑分別為 7,10,8 nm。

    (2)通過(guò)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)的結(jié)果,試驗(yàn)得出各要素模擬催化酶體系的影響,其主次依序?yàn)锳>B>C,即H2O2濃度>催化溫度>催化時(shí)間。通過(guò)極差闡述來(lái)確定最優(yōu)的方案組合,最優(yōu)方案組合為A2B1C2,即H2O2濃度0.25 mol/L,催化溫度35℃,催化時(shí)間20 min。綜上所述,反應(yīng)時(shí)間是影響模擬酶催化體系的主要因素。

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