人源肺癌循環(huán)腫瘤細(xì)胞系在不同品系小鼠上肺轉(zhuǎn)移能力研究

闕祖俊，董昌盛，羅 斌，田建輝

(1上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院,2上海市中醫(yī)藥研究院中醫(yī)腫瘤研究所,上海200032)

0 引言

肺癌是發(fā)病率和死亡人數(shù)增長最快,對人類健康和生命威脅最大的惡性腫瘤之一［1－2］,而轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致癌癥患者死亡的最主要原因［3］,針對早期肺癌術(shù)后患者進(jìn)行及早干預(yù)進(jìn)而預(yù)防肺癌轉(zhuǎn)移是提高總體生存期的關(guān)鍵［4］。研究肺癌的轉(zhuǎn)移機(jī)制進(jìn)而阻斷肺癌的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移對于提高臨床療效具有重要意義,因此,急需建立符合臨床病理實(shí)際發(fā)病特征的肺癌轉(zhuǎn)移模型。循環(huán)腫瘤細(xì)胞(circulating tumor cells,CTCs)是指從原發(fā)灶或轉(zhuǎn)移灶脫落,在血液和淋巴管中循環(huán)的細(xì)胞［5］,它與肺癌的轉(zhuǎn)移具有十分密切的關(guān)系,在肺癌的預(yù)后、臨床分期及療效評價等方面具有重要意義［6－7］。以CTCs為靶點(diǎn)的藥物研發(fā)和治療策略的制訂很可能成為預(yù)防肺癌轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵。故本實(shí)驗(yàn)采用人源肺癌循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CTC-TJH-01),通過在不同品系小鼠上建立尾靜脈注射肺轉(zhuǎn)移模型,為研究肺癌轉(zhuǎn)移機(jī)制及抗肺癌轉(zhuǎn)移藥物的篩選提供理想的動物模型。

1 材料和方法

1.1 儀器和試劑熒光倒置顯微鏡(DMI3000B),德國萊卡公司；CO2培養(yǎng)箱(STERI-CYCLE i160),美國Thermo公司；Eppendorf冷凍離心機(jī)(5804R),德國艾本德公司；F12K培養(yǎng)基,胎牛血清,胰蛋白酶,美國Gibco公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動物和細(xì)胞C57BL/6小鼠、Nude小鼠和NOD/SCID小鼠,雄性,體質(zhì)量18～22 g,4～6周齡,各10只,購自并飼養(yǎng)于上海南方模式生物科技發(fā)展有限公司［生產(chǎn)許可證號:SCXK(滬)2014-0002；使用許可證號:SYXK(滬)2013-0035］。CTC-TJH-01細(xì)胞由課題組分離培養(yǎng)與建系。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將CTC-TJH-01細(xì)胞置于含10%胎牛血清的F12K完全培養(yǎng)基中,在37℃、50 mL/L CO2、70%濕度的恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)、傳代,取對數(shù)生長期的細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)［8］。

1.3.2 小鼠肺轉(zhuǎn)移模型的建立 將對數(shù)生長期的CTC-TJH-01細(xì)胞消化、計數(shù),用0.9%的生理鹽水調(diào)整細(xì)胞濃度為1×107個/mL,通過尾靜脈注射100 μL的CTC-TJH-01細(xì)胞懸液接種于C57BL/6小鼠、Nude小鼠和NOD/SCID小鼠體內(nèi),每組10只。

1.3.3 小鼠肺轉(zhuǎn)移情況觀察 CTC-TJH-01細(xì)胞接種于小鼠體內(nèi)后,每隔兩周處死每組一只小鼠,取肺臟組織,在解剖學(xué)顯微鏡下觀察肺部成瘤情況,計算轉(zhuǎn)移灶數(shù)目。然后用中性福爾馬林固定,制作石蠟切片,進(jìn)行H＆E染色,觀察肺臟組織及轉(zhuǎn)移灶情況。

1.3.4 病理組織切片檢查 處死小鼠后取出肺臟標(biāo)本,浸泡于10%的中性福爾馬林中固定48 h,常規(guī)石蠟包埋切片,H＆E染色,染色切片于光學(xué)顯微鏡下觀察肺組織及轉(zhuǎn)移灶形態(tài)變化并拍照。

1.4 作圖分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism5和Adobe Photoshop CS4軟件進(jìn)行作圖。

2 結(jié)果

2.1 CTC-TJH-01細(xì)胞在NOD/SCID小鼠上肺轉(zhuǎn)移率100%將CTC-TJH-01細(xì)胞通過尾靜脈注射接種于NOD/SCID小鼠體內(nèi)后第8周,首次在小鼠肺臟發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移灶,在第10周將剩余小鼠全部處死,發(fā)現(xiàn)肺部成瘤率為100%(圖1A、1B)。通過對轉(zhuǎn)移灶進(jìn)行H＆E染色發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞排列緊密、細(xì)胞核較大且深染(圖1C、1D)。表明NOD/SCID小鼠可用于肺轉(zhuǎn)移模型的建立和抗轉(zhuǎn)移藥物的篩選。

圖1 CTC-TJH-01細(xì)胞在NOD/SCID小鼠上的肺轉(zhuǎn)移模型

2.2 CTC-TJH-01細(xì)胞在Nude小鼠肺部不成瘤將CTC-TJH-01細(xì)胞通過尾靜脈注射接種于Nude小鼠后,即使在第20周,在小鼠肺部仍未發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移灶(圖2)。其原因可能是Nude小鼠體內(nèi)存在的B淋巴細(xì)胞和NK細(xì)胞對CTC-TJH-01細(xì)胞發(fā)生了排斥作用,清除了外周血中的CTCs,從而抑制了CTCs的轉(zhuǎn)移。

圖2 CTC-TJH-01細(xì)胞在Nude小鼠上的肺轉(zhuǎn)移模型

2.3 CTC-TJH-01細(xì)胞在C57BL/6小鼠肺部不成瘤將CTC-TJH-01細(xì)胞通過尾靜脈注射接種于C57BL/6小鼠,直到第20周,在小鼠的肺部均未發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移灶,由于免疫排斥作用,CTC-TJH-01細(xì)胞在C57BL/6小鼠上不具有肺轉(zhuǎn)移能力(圖3)。

圖3 CTC-TJH-01在C57BL/6小鼠上的肺轉(zhuǎn)移模型

3 討論

轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致肺癌死亡的主要原因,而當(dāng)前干預(yù)療效不佳的原因是臨床往往參考腫瘤原發(fā)灶病理用藥,而在轉(zhuǎn)移中起到關(guān)鍵作用的CTCs并未得到重視,因此肺癌早期預(yù)防轉(zhuǎn)移的干預(yù)并未體現(xiàn)精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)的指導(dǎo)理念。研究組前期發(fā)現(xiàn)早期肺癌患者即高表達(dá)CTCs［9］,并在IIa期女性肺腺癌患者外周血提取并建立了CTC-TJH-01細(xì)胞系［10］,采用外顯子測序分析,證實(shí)其來源于原發(fā)腫瘤［11］。初步發(fā)現(xiàn)與原代肺癌細(xì)胞系相比,該CTCs對紫杉醇和順鉑的耐藥性更強(qiáng),初步提示了術(shù)后化療效果不佳的原因［12］。因此,體外抗轉(zhuǎn)移藥物的篩選應(yīng)該以CTCs系為主開展,因?yàn)槠浔硇鸵呀?jīng)發(fā)生改變,并與肺癌細(xì)胞系具有很大差異。然而,當(dāng)前的人源腫瘤異種移植模型主要是建立的皮下移植瘤模型［13－16］,并不能用于抗轉(zhuǎn)移藥物的篩選,因此,急需建立符合臨床實(shí)際發(fā)病特征的肺癌轉(zhuǎn)移模型。

本課題組長期探索肺癌的臨床前動物模型的構(gòu)建,認(rèn)為模擬肺癌發(fā)病的實(shí)際病理過程和特征是成功與否的關(guān)鍵。本研究選用不同免疫背景的C57BL/6小鼠、Nude小鼠和NOD/SCID小鼠,在相同的實(shí)驗(yàn)條件下采用尾靜脈注射將CTC-TJH-01細(xì)胞接種到小鼠體內(nèi),但由于小鼠品系、免疫背景和生理病理特點(diǎn)不同,其肺部成瘤率也存在很大差異。研究發(fā)現(xiàn)CTCTJH-01細(xì)胞在NOD/SCID小鼠上接種第10周后即可100%成瘤,而在 Nude小鼠和 C57BL/6小鼠上CTCs不成瘤。其可能的原因是人源肺癌循環(huán)腫瘤細(xì)胞具有較強(qiáng)的免疫原性,在小鼠體內(nèi)激發(fā)了免疫排斥反應(yīng)。因?yàn)镃57BL/6小鼠為免疫功能正常小鼠,具有正常水平的T、B淋巴細(xì)胞和NK細(xì)胞；Nude小鼠由于無胸腺,故T淋巴細(xì)胞比例極低,但具有正常功能的B淋巴細(xì)胞和NK細(xì)胞,而NOD/SCID小鼠是聯(lián)合免疫缺陷小鼠,其體內(nèi)表達(dá)極低的T、B淋巴細(xì)胞和NK細(xì)胞,因其免疫力更低,更容易接受異種移植。

本研究表明當(dāng)小鼠體內(nèi)存在B淋巴細(xì)胞和NK細(xì)胞時,對人源肺癌循環(huán)腫瘤細(xì)胞具有較強(qiáng)的排斥作用,可顯著抑制小鼠肺部成瘤。Zahidunnabi等［17］研究也發(fā)現(xiàn)將人源乳腺癌細(xì)胞接種到NOD/SCID小鼠體內(nèi),并同時接種NK細(xì)胞后可顯著抑制乳腺癌的生長和轉(zhuǎn)移。此外,Vikis等［18］研究發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞在不同品系小鼠上的生長和轉(zhuǎn)移差異與T細(xì)胞的功能相關(guān)。因此,在建立人源循環(huán)腫瘤細(xì)胞肺轉(zhuǎn)移模型的實(shí)驗(yàn)研究中,NOD/SCID小鼠可滿足實(shí)驗(yàn)研究所需的條件,是較為理想的動物模型。本研究初步確立了CTCs尾靜脈注射后的成瘤時間和干預(yù)節(jié)點(diǎn),并提出成瘤率可以作為轉(zhuǎn)移干預(yù)的療效評價指標(biāo)。

本研究采用人源肺癌循環(huán)腫瘤細(xì)胞系建立的肺癌轉(zhuǎn)移模型,其目的是盡可能模擬臨床發(fā)病的實(shí)際情況,為篩選抗轉(zhuǎn)移藥物提供工具,但也存在仍待完善之處。首先,該模型未能體現(xiàn)人體免疫系統(tǒng)與腫瘤之間的相互作用,因此也不能用于抗轉(zhuǎn)移免疫治療藥物的研發(fā),但可用于DC-CIK或CAR-T等細(xì)胞免疫治療研究。其次,由于CTCs的異質(zhì)性問題,篩選抗轉(zhuǎn)移藥物的過程中未必能夠精準(zhǔn)靶向真正引起轉(zhuǎn)移發(fā)生的CTCs亞群細(xì)胞,這也是目前該領(lǐng)域的主要瓶頸。最后,由于個體差異和肺癌患者接受不同的治療,CTCs細(xì)胞系存在著不同的突變基因和表型,單一CTCs細(xì)胞株不能滿足于研發(fā)針對CTCs的靶向藥物。

綜上所述,本研究表明不同遺傳背景的小鼠可顯著影響人源肺癌循環(huán)腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移,而將CTCs通過尾靜脈注射接種到NOD/SCID小鼠體內(nèi),能夠建立肺癌轉(zhuǎn)移動物模型,且動物肺部成瘤時間較長,可為研究肺癌轉(zhuǎn)移機(jī)制和抗轉(zhuǎn)移藥物的篩選提供較好的實(shí)驗(yàn)平臺。

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