抑制microRNA-202-3p表達(dá)促進(jìn)滑膜間充質(zhì)干細(xì)胞軟骨分化

張 聘，張林香，趙建寧，張 雷

［1南京醫(yī)科大學(xué)金陵臨床醫(yī)學(xué)院(解放軍南京總醫(yī)院)骨科,2解放軍南京總醫(yī)院麻醉科,3解放軍南京總醫(yī)院骨科,江蘇 南京210002］

0 引言

滑膜間充質(zhì)干細(xì)胞(synovium-derived mesenchymal stem cells,SMSCs)可以從正?；蚬顷P(guān)節(jié)炎滑膜組織中獲得［1］,具有良好的多項(xiàng)分化潛能,相較于其他間充質(zhì)干細(xì)胞成軟骨分化能力更強(qiáng)［2］,并且滑膜組織再生能力強(qiáng),臨床上取材方便,目前被廣泛用于軟骨組織工程中。

MicroRNA(miRNA)是一類(lèi)長(zhǎng)約22 nt的內(nèi)源性非編碼單鏈小RNA,主要通過(guò)參與基因的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控實(shí)現(xiàn)對(duì)靶基因的表達(dá)調(diào)節(jié),其在腫瘤發(fā)生發(fā)展、生物發(fā)育、器官形成、表觀調(diào)控及代謝等方面發(fā)揮極其重要的調(diào)控作用。已有大量研究［3－4］表明miRNA參與調(diào)控間充質(zhì)干細(xì)胞成軟骨分化。在既往關(guān)于miR-202-3p的研究中,Zhou等［5］通過(guò)熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)發(fā)現(xiàn)基質(zhì)金屬蛋白酶1(matrix metalloproteinase 1,MMP1)是miR-202-3p的直接靶點(diǎn),MMP與其特異性組織抑制因子之間的失衡是骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis,OA)軟骨降解的重要原因之一。Wainwright等［6］發(fā)現(xiàn)pri-miR-202可能是Sox9基因的一個(gè)直接轉(zhuǎn)錄靶點(diǎn)。Zhang等［7］發(fā)現(xiàn)miR-202能夠通過(guò)互補(bǔ)配對(duì)結(jié)合Sox6 3'-UTR從而調(diào)控Sox6基因表達(dá),Sox6、Sox9基因在軟骨分化過(guò)程中都發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。課題組利用microRNA基因芯片技術(shù)檢測(cè)長(zhǎng)鏈非編碼RNA DANCR誘導(dǎo)滑膜間充質(zhì)干細(xì)胞成軟骨分化過(guò)程中miRNA的表達(dá)情況,篩選出在分化不同時(shí)期表達(dá)明顯差異的miRNA［8］,其中miR-202-3p在誘導(dǎo)分化后期表達(dá)明顯降低。綜合以上研究結(jié)果,推測(cè)miR-202-3p可能在軟骨細(xì)胞代謝及分化過(guò)程中發(fā)揮重要作用。

基于以上研究背景,實(shí)驗(yàn)構(gòu)建miR-202-3p抑制劑表達(dá)載體轉(zhuǎn)染人SMSCs,觀察其對(duì)SMSCs增殖以及成軟骨分化的影響。

1 材料和方法

1.1 設(shè)計(jì)細(xì)胞體外觀察性實(shí)驗(yàn)。

1.2 時(shí)間及地點(diǎn)實(shí)驗(yàn)于2016年11月至2017年11月在解放軍南京總醫(yī)院完成。

1.3 材料滑膜組織:選擇在解放軍南京總醫(yī)院住院并進(jìn)行全膝關(guān)節(jié)置換的膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎患者10例,其中男5例,女5例,平均年齡65歲,術(shù)中獲取需要切除的膝關(guān)節(jié)髕上囊部位滑膜組織。研究開(kāi)始前均取得患者同意并簽署知情同意書(shū)。研究?jī)?nèi)容經(jīng)解放軍南京總醫(yī)院倫理部門(mén)審核并批準(zhǔn)。

主要試劑及儀器:miR-202-3p inbibitor及其對(duì)照inhibitor-NC由江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司合成；間充質(zhì)干細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基和成軟骨誘導(dǎo)分化完全培養(yǎng)基(廣州賽業(yè)公司)；胎牛血清(Gibco公司)；Ⅱ型膠原酶(Gibco公司)；甲苯胺藍(lán)(成都貝斯特試劑有限公司)；TRIzol(Invitrogen)；cDNA第一鏈合成試劑盒(美國(guó) Thermo Fisher K1622)；倒置相差顯微鏡(Nikon TMS顯微鏡)。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 SMSCs的分離和培養(yǎng) 獲取行膝關(guān)節(jié)置換手術(shù)患者的滑膜,按照 Pei等［9］的方法分離滑膜干細(xì)胞。取術(shù)中切除的髕上囊部位的滑膜,無(wú)菌條件下轉(zhuǎn)移至超凈工作臺(tái),PBS沖洗3次。剪除多余的脂肪和結(jié)締組織,分離出平滑光亮的滑膜組織,將其剪碎至1 mm3大小。加入0.2%濃度的Ⅱ型膠原酶在37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)消化4 h。經(jīng)120目尼龍網(wǎng)過(guò)濾,濾液移至離心管,1000 rpm離心10 min棄去上清液。以1×104個(gè)有核細(xì)胞平鋪于25 cm2培養(yǎng)瓶中,在基礎(chǔ)培養(yǎng)基(HG-DMEM、10%胎牛血清、1%青霉素+鏈霉素)中培養(yǎng)。24 h后換液棄去未貼壁的細(xì)胞,此時(shí)獲得原代SMSCs,繼續(xù)培養(yǎng),待細(xì)胞鋪滿(mǎn)80%時(shí),以1∶3進(jìn)行傳代培養(yǎng)。第3代細(xì)胞即為人SMSCs。

1.4.2 SMSCs的鑒定 采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面抗原。取第3代貼壁SMSCs,0.25%胰酶消化重懸至1.5×106/mL,各管分別加入單克隆抗體 CD44、CD90、CD45、CD34,同時(shí)每管樣品設(shè)立同型陰性對(duì)照。室溫避光孵育45 min,用PBS洗去未結(jié)合抗體,重懸細(xì)胞,流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)分析。

1.4.3 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 取第3代貼壁SMSCs,細(xì)胞密度達(dá)到80%時(shí),加入1 mL培養(yǎng)基。將Lipo2000和miRNA-202-3p inhibitor混勻,室溫孵育20 min,然后將miRNA-202-3p inhibitor-lipo2000混合液加入含細(xì)胞的培養(yǎng)基中,37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h后,將含有miRNA-202-3p inhibitor-lipo2000混合液的培養(yǎng)基移去,更換新鮮基礎(chǔ)培養(yǎng)基,繼續(xù)培養(yǎng)48 h。同樣方法轉(zhuǎn)染miRNA-202-3p inhibitor NC,設(shè)為對(duì)照組。qRT-PCR檢測(cè)miR-202-3p表達(dá)水平。

1.4.4 CCK-8檢測(cè) 細(xì)胞消化、計(jì)數(shù)、配制成濃度為3×104/mL的細(xì)胞懸液,96孔板中每孔加入100 μL細(xì)胞懸液,將96孔板置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)1、2、3、4、5、6、7 d,將96 孔板進(jìn)行CCK-8 染色,λ＝450 nm,測(cè)定OD值,繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。

1.4.5 微團(tuán)培養(yǎng)誘導(dǎo)SMSCs軟骨分化 分別取inhibitor組、NC組的 SMSCs,按照 7.5×105/mL的密度重懸,吸取0.5 mL細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至15 mL離心管中,置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞團(tuán)出現(xiàn)聚攏現(xiàn)象時(shí),輕彈離心管使其懸浮于液體中。每3天更換1次培養(yǎng)基,每管約0.5 mL軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基,持續(xù)培養(yǎng)21 d。

1.4.6 組織學(xué)檢測(cè) 采用堿性甲苯胺藍(lán)染色方法鑒定軟骨細(xì)胞。自然晾干細(xì)胞樣本,浸入4%的多聚甲醛固定液中30 min,PBS浸洗3次,0.1%堿性甲苯胺藍(lán)液浸染30 min,水洗,入冰醋酸液分化,直至胞核和顆粒清晰,風(fēng)干,中性樹(shù)膠封片,顯微鏡觀察。

1.4.7 qRT-PCR檢測(cè) 收集各組成軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)21 d的細(xì)胞團(tuán),使用TRIzol試劑提取各組總RNA,通過(guò)cDNA第一鏈合成試劑盒逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA,將cDNA樣品配置Real-time PCR反應(yīng)體系:SYRB Green PCR Master Mix 10 μL,cDNA 模板 1 μL,上游和下游引物各 1 μL,0.1%DEPC 水 7 μL,總體積 20 μL。 置于Real-time PCR儀上進(jìn)行PCR反應(yīng)。檢測(cè)軟骨細(xì)胞特異性基因Ⅱ型膠原、蛋白多糖、Sox9的表達(dá),NC組的細(xì)胞作為陰性對(duì)照,以GAPDH為內(nèi)參照(表1)。

表1 引物序列

1.5 觀察指標(biāo)轉(zhuǎn)染miR-202-3p抑制劑后,對(duì)人SMSCs增殖的影響；轉(zhuǎn)染miR-202-3p抑制劑后,對(duì)誘導(dǎo)人SMSCs成軟骨分化相關(guān)基因(Ⅱ型膠原、蛋白聚糖、Sox9)表達(dá)的影響。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理實(shí)驗(yàn)結(jié)果用SPSS17.0軟件進(jìn)行分析,兩組間比較采用兩獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn),數(shù)據(jù)以±s表示,P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SMSCs細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察SMSCs接種48 h后開(kāi)始貼壁生長(zhǎng),顯微鏡下可見(jiàn)大量細(xì)胞,形態(tài)多樣,以多角形為主,細(xì)胞核位于細(xì)胞中心,細(xì)胞質(zhì)呈放射狀向外突起(圖1A),隨著傳代次數(shù)增加,SMSCs趨向成形態(tài)單一的長(zhǎng)梭形(圖1B),至第3代,鏡下可見(jiàn)大量按特定方向排列的形態(tài)一致的長(zhǎng)梭形細(xì)胞(圖1C)。

圖1 SMSCs的形態(tài)(×200)

2.2 流式細(xì)胞儀檢測(cè)SMSCs表面抗原流式細(xì)胞檢測(cè)細(xì)胞表面抗原:CD44、CD90、CD45、CD34。 其中CD44、CD90 呈陽(yáng)性表達(dá)(陽(yáng)性率＞95%),CD45、CD34呈陰性表達(dá)(＜10%),與間充質(zhì)干細(xì)胞特點(diǎn)相符(圖 2)。

圖2 流式細(xì)胞術(shù)鑒定結(jié)果

2.3 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染SMSCsqRT-PCR結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染抑制劑組細(xì)胞中miR-202-3p表達(dá)明顯低于陰性對(duì)照組,表明轉(zhuǎn)染 miR-202-3p inhibitor后能有效沉默SMSCs中miR-202-3p的表達(dá)(圖3)。

圖3 qRT-PCR檢測(cè)SMSCs中miR-202-3p的表達(dá)水平

2.4 細(xì)胞增殖分析從轉(zhuǎn)染后第3天起,miR-202-3p inhibitor組的細(xì)胞增殖率明顯高于陰性對(duì)照組,這說(shuō)明抑制SMSCs中的miR-202-3p可明顯提高SMSCs的增殖活性(圖4)。

圖4 連續(xù)培養(yǎng)7 d細(xì)胞增殖情況

2.5 甲苯胺藍(lán)染色結(jié)果成軟骨誘導(dǎo)21 d后,行甲苯胺藍(lán)染色,可見(jiàn)實(shí)驗(yàn)組和陰性對(duì)照組細(xì)胞外基質(zhì)均呈藍(lán)色,表明細(xì)胞外基質(zhì)中有糖胺聚糖形成,符合軟骨細(xì)胞細(xì)胞外基質(zhì)特征,miR-202-3p inhibitor組藍(lán)染更明顯,細(xì)胞數(shù)量更多(圖5)。

圖5 實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組SMSCs成軟骨誘導(dǎo)后甲苯胺藍(lán)染色結(jié)果(×200)

2.6 軟骨細(xì)胞相關(guān)基因表達(dá)qRT-PCR結(jié)果顯示,實(shí)驗(yàn)組軟骨細(xì)胞特異性基因(Ⅱ型膠原蛋白、蛋白多糖、Sox9)的表達(dá)明顯高于陰性對(duì)照組(圖6),說(shuō)明抑制miR-202-3p表達(dá)能夠促進(jìn)Ⅱ型膠原、蛋白多糖、Sox9的合成,對(duì)SMSCs的軟骨形成能力有促進(jìn)作用。

圖6 qRT-PCR檢測(cè)SMSCs成軟骨誘導(dǎo)后軟骨特異性基因的表達(dá)

3 討論

創(chuàng)傷、骨關(guān)節(jié)炎等常引起關(guān)節(jié)軟骨缺損。由于軟骨組織缺乏血供、愈合能力差,成人關(guān)節(jié)軟骨缺損很難自我修復(fù)。SMSCs在既往研究中表現(xiàn)出良好的軟骨再生效果［10］。 Kondo 等［11］發(fā)現(xiàn) SMSCs 有著與軟骨細(xì)胞相似的基因表達(dá)譜,說(shuō)明二者可能來(lái)源于同一種前體細(xì)胞。相較于其他來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞,SMSCs具有更強(qiáng)的成軟骨分化能力,目前是軟骨組織工程最主要的種子細(xì)胞。

本實(shí)驗(yàn)室利用miRNA芯片檢測(cè)SMSCs成軟骨分化前后miRNA的表達(dá)譜,發(fā)現(xiàn)miR-202-3p表達(dá)明顯降低,并且miR-202-3p在多種細(xì)胞增殖過(guò)程中都起到抑制作用［12－15］,所以推測(cè) miR-202-3p 可能為SMSCs軟骨分化的負(fù)調(diào)節(jié)因子。本研究結(jié)果表明,抑制miR-202-3p的表達(dá)能夠顯著促進(jìn)SMSCs增殖,同時(shí)軟骨特異性基因的表達(dá)也顯著提高,證實(shí)了miR-202-3p與軟骨分化及修復(fù)有密切關(guān)系。

MiRNA主要通過(guò)結(jié)合目標(biāo)mRNA的3'-UTR,誘導(dǎo)mRNA降解或抑制mRNA翻譯,從而調(diào)控目標(biāo)基因的表達(dá)［16］。通過(guò)檢索 TargetScan數(shù)據(jù)庫(kù)發(fā)現(xiàn)miR-202-3p直接互補(bǔ)配對(duì)結(jié)合Sox6 3'-UTR的第2290-2296和6261-6267位點(diǎn),保守互補(bǔ)序列分別為5'-ACAUUUCA-3'、5'-UACCUCA-3',并且 Zhang 等［7］的實(shí)驗(yàn)證實(shí)miR-202負(fù)向調(diào)控Sox6的表達(dá)。Sox6和L-Sox5共同提高 Sox9的轉(zhuǎn)錄活性［17］。MiR-202-3p與Sox9無(wú)互補(bǔ)配對(duì)序列,Sox9不是miR-202-3p的直接靶目標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)中抑制miR-202-3p表達(dá)后,可能提高了Sox6的表達(dá),從而引起Sox9表達(dá)增加。而Col2A1是Sox9依賴(lài)性的軟骨細(xì)胞特異性增殖基因,Col2A1在軟骨細(xì)胞中的表達(dá)與Sox9呈正比關(guān)系,Col2A1的增高可能是由Sox9的增高引起的。

MiRNAs具有非常復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò),往往一個(gè)miRNA可以調(diào)控多種靶基因,而同一個(gè)靶基因也可以由很多miRNAs來(lái)進(jìn)行調(diào)節(jié)。目前已經(jīng)確認(rèn)的miRNA在軟骨形成與分化過(guò)程中調(diào)控的靶點(diǎn)包括Sox 家族［18－19］、TGF-β 通路［8,20－21］、BMP 通路［22］、Wnt通路［3］、MAPK 通路［23］等。 Zhang 等［8］認(rèn)為軟骨分化可能潛在地是由 TGF-β引起的,既往的研究［24－26］發(fā)現(xiàn)TGF-β1可通過(guò)多條信號(hào)通路參與間充質(zhì)干細(xì)胞成軟骨分化過(guò)程,而且研究［27－28］發(fā)現(xiàn) TGF-β1可以誘導(dǎo)miR-202表達(dá)。在SMSCs成軟骨分化中,miR-202-3p可能也受到TGF-β1調(diào)控,并且可能在多條通路中都發(fā)揮調(diào)控作用,具體的機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

研究microRNA在軟骨細(xì)胞增殖、分化過(guò)程中的作用十分有意義,能夠?yàn)槔瞄g充質(zhì)干細(xì)胞和RNA干擾技術(shù)進(jìn)行軟骨損傷修復(fù)及對(duì)骨關(guān)節(jié)炎的治療提供一定的理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù),我們期待干細(xì)胞和RNA技術(shù)給臨床治療軟骨缺損帶來(lái)新的突破。

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