雷帕霉素對(duì)EMs血管生成影響的實(shí)驗(yàn)研究

任 旭，王沂峰，孫利華 (南方醫(yī)科大學(xué)南海醫(yī)院,廣東佛山5844；南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院,廣東廣州5080)

0 引言

子宮內(nèi)膜異位癥(內(nèi)異癥,endometriosis)是婦科常見病之一,其異位子宮內(nèi)膜來源至今未闡明,存在多種學(xué)說,至今沒有一種學(xué)說可以解釋該病的所有現(xiàn)象,它雖為良性疾病,但卻具有惡性疾病的生物學(xué)行為,有發(fā)生組織侵襲及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的特性,并且復(fù)發(fā)率高［1］。目前臨床治療內(nèi)異癥的手段包括激素藥物治療和手術(shù)治療,主要目的是去除或破壞肉眼所能見到的異位內(nèi)膜病灶,分離粘連、恢復(fù)器官的正常解剖結(jié)構(gòu),緩解臨床癥狀,改善生育環(huán)境。但無論哪種治療手段,都存在著治療效果差異大,復(fù)發(fā)率高的困境［2－3］。近年來,學(xué)者們對(duì)于EMs的發(fā)病機(jī)理及靶向治療的研究從未停止過,大量研究［4－5］證明血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)與EMs存在著密切的關(guān)系,抗血管藥物的研究也取得了一定的成果。雷帕霉素是特異性哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)抑制劑。mTOR屬于磷脂酰肌醇3-激酶相關(guān)激酶(phosp hatidylinositol 3-kinase-related kinase,PIKK)蛋白家族,在調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、調(diào)控細(xì)胞周期等多個(gè)方面起到重要作用,mTOR可在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平調(diào)節(jié)VEGF等促血管生成因子的產(chǎn)生。大量科學(xué)研究［6－7］確證,使用 mTOR 抑制劑——雷帕霉素能抑制胰腺癌、肝癌、肺癌、子宮癌、胃癌、膽管癌等腫瘤細(xì)胞株生長(zhǎng)及侵襲轉(zhuǎn)移,并能阻滯細(xì)胞周期,誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡,從而抑制腫瘤形成。mTOR在惡性腫瘤治療領(lǐng)域有著廣泛的研究,并取得了很好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果及臨床效果,但對(duì)于EMs的治療報(bào)道尚少,本課題擬通過建立動(dòng)物模型來進(jìn)一步探討VEGF與內(nèi)異癥的關(guān)系,并摸索使用雷帕霉素作為EMs的個(gè)性化治療方法,從而為臨床治療提供實(shí)驗(yàn)學(xué)基礎(chǔ)。

1 資料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SCID小鼠均由中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,雌性NOD-SCID小鼠20只。

1.2 標(biāo)本來源子宮內(nèi)膜組織標(biāo)本取自因盆腔內(nèi)異癥入住南方醫(yī)科大學(xué)南海醫(yī)院婦科行腹腔鏡手術(shù)治療的患者20例,患者術(shù)前6個(gè)月未接受過任何激素類藥物治療,術(shù)后病理證實(shí)為EMs,平均年齡(33±8)歲。

1.3 主要藥品雷帕霉素購(gòu)自福建科瑞藥業(yè)有限公司。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法根據(jù)文獻(xiàn)［8］建立內(nèi)異癥SCID小鼠動(dòng)物模型,將建模成功后的小鼠隨機(jī)分為兩組,對(duì)照組10例,給予腹壁皮下的病灶內(nèi)注射生理鹽水0.25 mL/只,一周后重復(fù)注射一次；治療組10例,給予腹壁皮下的病灶內(nèi)注射雷帕霉素250 μg/只,注射劑量參考國(guó)外相關(guān)小鼠實(shí)驗(yàn)［9］,一周后重復(fù)注射一次,兩次治療后一周用斷頸法將小鼠處死。

1.5 觀察指標(biāo)

1.5.1 觀察動(dòng)物的基本情況 從用藥開始每三天記錄兩組小鼠的體質(zhì)量,皮膚顏色、飲食情況、大小便及活動(dòng)等情況,并記錄有無生病及死亡等。

1.5.2 觀察子宮內(nèi)膜異位病灶的大小 從用藥開始后每天觀察小鼠皮下異位病灶的生長(zhǎng)變化,使用游標(biāo)卡尺測(cè)量皮下異位病灶的長(zhǎng)徑(a)與短徑(b),每三天記錄一次。計(jì)算方式均參照腫瘤的計(jì)算公式:體積V＝a×b2×0.52。 a＝內(nèi)異灶的長(zhǎng)徑(mm),b＝內(nèi)異灶的短徑(mm)。

1.5.3 觀察兩組微血管密度 切取SCID小鼠異位病灶組織,標(biāo)本經(jīng)石蠟包埋、切片、HE染色,在顯微鏡下觀察兩組的微血管生長(zhǎng)情況,并通過免疫組化的方法,使用CD34標(biāo)記血管內(nèi)皮細(xì)胞,計(jì)數(shù)兩組組織中的微血管密度(microvessel density,MVD)。

從用藥開始,每三日記錄一次,檢測(cè)了兩組SCID小鼠血清中E2及FSH的水平,對(duì)兩組SCID小鼠的肝、腎、卵巢及子宮組織行常規(guī)檢查,組織病理學(xué)檢查。

2 結(jié)果

2.1 雷帕霉素治療后病灶的生長(zhǎng)情況自注射雷帕霉素治療后第3天開始,雷帕霉素治療組皮下異位病灶體積開始逐漸縮小,而對(duì)照組無明顯變化,并繪制異位病灶的生長(zhǎng)體積-時(shí)間曲線圖(表1,圖1),顯示治療組異位病灶的體積逐漸減小,生長(zhǎng)被抑制,顯著低于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

表1 治療后兩組異位病灶體積 (mm3)

圖1 異位病灶的生長(zhǎng)體積-時(shí)間曲線圖

在第一次注射治療后,對(duì)照組的異位病灶體積大小無明顯變化,病灶表面血管可見；而治療組的異位病灶體積明顯縮小、變硬、甚至消失,萎縮成斑塊狀的異位病灶表面血管不明顯(圖2～5)。

圖2 剝離的異位病灶

圖3 對(duì)照組異位病灶體積無變化

圖4 治療組異位病灶萎縮變小

圖5 治療組異位病灶消失

2.2 雷帕霉素對(duì)異位病灶MVD的影響雷帕霉素對(duì)EMs-SCID小鼠異位病灶生長(zhǎng)有顯著的抑制作用:經(jīng)隨機(jī)分組,治療組中發(fā)現(xiàn)雷帕霉素作用于異位病灶后,微血管密度MVD顯著減少,異位病灶體積明顯縮小,與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05,表2)±s)

表2 兩組MVD值情況 (n＝10,x

標(biāo)本經(jīng)石蠟包埋、切片、HE染色,在顯微鏡下觀察兩組的微血管情況。EMs-SCID小鼠異位病灶血管HE染色情況見圖6,使用雷帕霉素后EMs-SCID小鼠異位病灶血管HE染色情況見圖7。

圖6 對(duì)照組異位病灶組織(HE×400)

圖7 治療組異位病灶組織(HE×400)

通過CD34染色陽性的微血管的計(jì)數(shù)來判定,CD34染色陽性呈棕色或棕褐色物質(zhì),表達(dá)于血管內(nèi)皮細(xì)胞。微血管在鏡下表現(xiàn)為血管內(nèi)皮細(xì)胞染棕色或棕褐色。MVD為微血管密度物質(zhì),呈逗點(diǎn)狀、條索狀或小管狀,有清晰的管腔。使用雷帕霉素后CD34陽性表達(dá)明顯減少。對(duì)照組CD34陽性表達(dá)見圖8,治療組CD34陽性表達(dá)見圖9。

圖8 對(duì)照組異位病灶CD34表達(dá)(SP×400)

圖9 治療組異位病灶CD34表達(dá)(SP×400)

2.3 雷帕霉素對(duì)小鼠的毒性作用觀察雷帕霉素治療前后SCID小鼠的體質(zhì)量,經(jīng)配對(duì)t檢驗(yàn),其差異亦無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；SCID小鼠的精神、皮色、飲食、大小便及活動(dòng)亦無明顯異常變化；本研究檢測(cè)了兩組SCID小鼠血清中E2及FSH的水平,發(fā)現(xiàn)雷帕霉素對(duì)SCID小鼠血清中E2及FSH水平無明顯影響(圖10～11)。兩組SCID小鼠的肝、腎、卵巢及子宮組織行常規(guī)檢查,外觀無異常,組織病理學(xué)結(jié)果無異常,本研究雷帕霉素采取局部注射給藥法,僅對(duì)局部的病灶組織的血管生成產(chǎn)生影響,而對(duì)正常組織影響較小,全身性的毒副作用小,起到更好的療效。

圖10 兩組小鼠體內(nèi)雌二醇的表達(dá)

圖11 兩組小鼠體內(nèi)FSH的表達(dá)

3 討論

EMs具備侵襲、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)等類似惡性腫瘤的特性,一直以來被稱為良性癌,在位內(nèi)膜異位種植、存活、生長(zhǎng)及侵蝕依賴于充足的血液供應(yīng),而充足的血液供應(yīng)必須依賴于新生血管的形成［10－11］。由于EMs造成的局部炎癥反應(yīng)、性激素變化以及缺氧環(huán)境均導(dǎo)致盆腔微血管生長(zhǎng)增加,從而導(dǎo)致異位內(nèi)膜易于種植生長(zhǎng)［12］。 大量數(shù)據(jù)［13－14］提示 EMs 患者腹腔液中VEGF等血管生長(zhǎng)因子明顯增多,并且腹腔鏡手術(shù)過程中可見病灶周圍及受侵犯器官中大量新生血管,同時(shí)切除病灶組織的病理切片鏡下可見新生血管和毛細(xì)血管數(shù)量明顯增多,由此可見新生血管形成是EMs發(fā)病過程中重要的病理過程,血管生成與EMs的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān),VEGF促進(jìn)了異位內(nèi)膜細(xì)胞的增殖和侵襲性生長(zhǎng)。

哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)是存在于細(xì)胞質(zhì)中的非典型絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶,被認(rèn)為是細(xì)胞生長(zhǎng)的中心調(diào)控因子,調(diào)控著很多翻譯元件的蛋白合成,具有對(duì) mRNA翻譯起始的調(diào)控功能［15］。mTOR通路可以調(diào)控單核巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的血管新生,VEGF一直被認(rèn)為是促進(jìn)腫瘤血管生成最重要的生長(zhǎng)因子,而有研究［16］表明mTOR促進(jìn)了VEGF分泌的上調(diào),從而促進(jìn)血管新生。雷帕霉素通過抑制哺乳動(dòng)物mTOR受體,影響其轉(zhuǎn)導(dǎo)的多種信號(hào)通路,從而發(fā)揮抗血管生成、阻滯細(xì)胞周期和促進(jìn)細(xì)胞凋亡等多種作用。

基于內(nèi)異癥有類似腫瘤的生物學(xué)特性,為了尋找有效的針對(duì)EMs的靶向治療手段,本研究成功地建立了EMs-SCID小鼠模型,并對(duì)比了雷帕霉素治療后異位病灶的生長(zhǎng)情況以及異位病灶組織內(nèi)MVD的表達(dá),發(fā)現(xiàn)雷帕霉素能顯著抑制子EMs病灶的生長(zhǎng),并顯著抑制異位病灶組織內(nèi)MVD的表達(dá),所以我們推測(cè)mTOR信號(hào)通路可能與EMs的發(fā)病機(jī)制相關(guān),為探討EMs的發(fā)病機(jī)理提供新的思路；該研究中雷帕霉素的局部用藥對(duì)其他正常組織系統(tǒng)無明顯毒副作用,克服了傳統(tǒng)藥物治療的最大弊端,提示雷帕霉素治療內(nèi)異癥具有較高的安全性,該研究為EMs的靶向治療提供了實(shí)驗(yàn)學(xué)依據(jù)。

［1］Gordts S,Koninckx P,Brosens I.Pathogenesis of deep endometriosis［J］.Fertil Steril,2017,108(6):872－885.e1.

［2］Becker CM,Gattrell WT,Gude K,et al.Reevaluating response and failure of medical treatment of endometriosis:a systematic review［J］.Fertil Steril,2017,108(1):125－136.

［3］Laganà AS,Vitale SG,Granese R,et al.Clinical dynamics of Dienogest for the treatment of endometriosis:from bench to bedside［J］.Expert Opin Drug Metab Toxicol,2017,13(6):593－596.

［4］Acimovic M,Vidakovic S,Milic N,et al.Survivin and VEGF as Novel Biomarkers in Diagnosis of Endometriosis［J］.J Med Biochem,2016,35(1):63－68.

［5］Yeniel A?,Erbas O,Ergenoglu AM,et al.Effect of oxytocin treatment on explant size,plasma and peritoneal levels of MCP-1,VEGF,TNF-α and histopathological parameters in a rat endometriosis model［J］.Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol,2014,175:134－139.

［6］Kongpracha P,Nagamori S,Wiriyasermkul P,et al.Structure-activity relationship of a novel series of inhibitors for cancer type transporter L-type amino acid transporter 1(LAT1)［J］.J Pharmacol Sci,2017,133(2):96－102.

［7］Guan B,Wu K,Zeng J,et al.Tumor-suppressive microRNA-218 inhibits tumor angiogenesis via targeting the mTOR component RICTOR in prostate cancer［J］.Oncotarget,2017,8(5):8162－8172.

［8］任 旭,王沂峰,戴麗冰.子宮內(nèi)膜異位癥SCID小鼠動(dòng)物模型的構(gòu)建［J］.昆明醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2018,39(1):30－34.

［9］Laschke MW,Elitzsch A,Scheuer C,et al.Rapamycin induces regression of endometriotic lesions by inhibiting neovascularization and cell proliferation［J］.Br J Pharmacol,2006,149(2):137－144.

［10］Sheveleva T,Bejenar V,Komlichenko E,et al.Innovative approach in assessing the role of neurogenesis,angiogenesis,and lymphangiogenesis in the pathogenesis of external genital endometriosis［J］.Gynecol Endocrinol,2016,32(sup2):75－79.

［11］Bouquet De Jolinière J,Ayoubi JM,Gianaroli L,et al.Endometriosis:a new cellular and molecular genetic approach for understanding the pathogenesis and evolutivity［J］.Front Surg,2014,1:16.

［12］Mohamed ML,El Behery MM,Mansour SA.Comparative study between VEGF-A and CA-125 in diagnosis and follow-up of advanced endometriosis after conservative laparoscopic surgery［J］.Arch Gynecol Obstet,2013,287(1):77－82.

［13］Liu S,Xin X,Hua T,et al.Efficacy of Anti-VEGF/VEGFR Agents on Animal Models of Endometriosis:A Systematic Review and Meta-Analysis［J］.PLoS ONE,2016,11(11):e0166658.

［14］Young VJ,Ahmad SF,Brown JK,et al.Peritoneal VEGF-A expression is regulated by TGF-β1 through an ID1 pathway in women with endometriosis［J］.Sci Rep,2015,5:16859.

［15］Makker A,Goel MM,Das V,et al.PI3K-Akt-mTOR and MAPK signaling pathways in polycystic ovarian syndrome,uterine leiomyomas and endometriosis:an update［J］.Gynecol Endocrinol,2012,28(3):175－181.

［16］Kim GD.Kaempferol Inhibits Angiogenesis by Suppressing HIF-1α and VEGFR2 Activation via ERK/p38 MAPK and PI3K/Akt/mTOR Signaling Pathways in Endothelial Cells［J］.Prev Nutr Food Sci,2017,22(4):320－326.