富血小板血漿聯(lián)合間充質(zhì)干細(xì)胞促進(jìn)前交叉韌帶腱骨愈合的臨床療效研究

陳宇 徐躋峰 章水均 畢擎

前交叉韌帶（anterior cruciate ligament，ACL）是膝關(guān)節(jié)重要的穩(wěn)定結(jié)構(gòu)，一旦發(fā)生斷裂會(huì)顯著降低膝關(guān)節(jié)穩(wěn)定性，不僅難以自愈，而且容易引起半月板損傷及關(guān)節(jié)退行性病變等并發(fā)癥的發(fā)生[1]。目前，ACL重建術(shù)已成為治療ACL損傷的主要方法，但肌腱移植物與骨隧道之間的愈合效果仍未得到很好解決[2]，因此，如何選取肌腱移植物是促進(jìn)術(shù)后骨隧道愈合的關(guān)鍵[3]。臨床常采用單一生物材料來促進(jìn)腱骨愈合，其中富血小板血漿（plate let rich plasma，PRP）是較為常用的生物材料[4]，療效雖有一定的提高，但仍不能令人滿意。部分學(xué)者開始嘗試使用間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSCs）來促進(jìn)腱骨愈合，但多數(shù)均為動(dòng)物研究[5]，針對(duì)人體的療效尚不明確。筆者推測(cè)聯(lián)合使用生物材料和MSCs或許可提高腱骨愈合效果，因此，對(duì)PRP聯(lián)合MSCs促進(jìn)ACL腱骨愈合的臨床療效進(jìn)行了研究，旨在為臨床治療提供依據(jù)。

1 對(duì)象和方法

1.1 對(duì)象 選取2014年6月至2016年5月本院收治的ACL損傷患者56例，按照隨機(jī)數(shù)字表法分為聯(lián)合組和單一各組28例，單一組采取單獨(dú)PRP治療，聯(lián)合組采取PRP聯(lián)合MSCs治療。納入標(biāo)準(zhǔn)：經(jīng)影像學(xué)檢查確診為ACL損傷；無既往膝關(guān)節(jié)手術(shù)史。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并嚴(yán)重疾病導(dǎo)致不能手術(shù)者；合并其他韌帶損傷者。聯(lián)合組男 17 例，女 11 例；年齡 27～45（35.46±9.47）歲；病程5～16（11.68±5.17）d。單一組男 15 例，女 13 例；年齡 26～47（36.11±9.87）歲；病程 7～16（12.20±4.45）d。兩組患者性別、年齡和病程等一般資料比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)和患者知情同意。

1.2 制備方法

1.2.1 自體PRP的制備 采用PRP制作包（山東威高集團(tuán)醫(yī)用高分子制品股份有限公司），于無菌條件下抽取患者肘靜脈血50ml，置于FRONTIERTM5000 MULTI PRO多功能離心機(jī)[奧豪斯國(guó)際貿(mào)易（上海）有限公司]，2 000r/min離心10min，棄去下層紅細(xì)胞，取上層懸液再次離心，取下層血漿成分為PRP，將PRP與凝血酶（北京索萊寶科技有限公司，YZ-280013-97IU）按比例10∶1進(jìn)行混合，形成PRP凝膠。

1.2.2 自體骨髓MSCs的制備 局部麻醉下用骨穿針抽取患者兩側(cè)骼后上棘骨髓血約80ml，置于肝素抗凝管內(nèi)進(jìn)行過濾，分離集合物和脂肪，置于血細(xì)胞分離機(jī)進(jìn)行離心，棄去上清液、無核紅細(xì)胞層及多核細(xì)胞層，取下層濃集液作為骨髓MSCs。

1.3 治療方法

1.3.1 手術(shù)方法 將單一組制備好的肌腱移植物置于5ml PRP凝膠中浸泡30min，將聯(lián)合組制備好的肌腱移植物置于5ml PRP凝膠及5ml MSCs中分別浸泡30min。所有患者均采取ACL重建術(shù)，手術(shù)均由同一組醫(yī)師完成。蛛網(wǎng)膜下腔阻滯麻醉下，通過膝前內(nèi)、外側(cè)入路，先行關(guān)節(jié)鏡關(guān)節(jié)探查，將脛骨端定位器定位于ACL解剖足印點(diǎn)中心處，極度屈膝關(guān)節(jié)至120°，制備脛骨隧道，其次通過保留的股骨外踝內(nèi)側(cè)壁ACL殘端識(shí)別ACL解剖足印點(diǎn)，并將股骨端定位器定位于此處，制備股骨隧道。通過克氏針及引線將兩組浸泡后的移植肌腱分別經(jīng)脛骨隧道引入膝關(guān)節(jié)，并拉入股骨隧道，拉緊移植肌腱脛骨端，屈伸膝關(guān)節(jié)20次左右，使肌腱順應(yīng)骨隧道。拉緊脛骨端肌腱，屈膝30°，通過平頭3mm克氏針自外向內(nèi)扭入可吸收擠壓螺釘，使脛骨隧道的肌腱固定。術(shù)閉，放出關(guān)節(jié)腔液體，縫合傷口。

1.3.2 治療方案 單一組于關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射PRP凝膠，在損傷關(guān)節(jié)處常規(guī)消毒并麻醉，在C型臂X線機(jī)透視下，使用注射器針頭對(duì)關(guān)節(jié)腔進(jìn)行定位，確認(rèn)針尖置于關(guān)節(jié)腔內(nèi)后，注入制備好的5ml PRP凝膠，注射完畢后，退出穿刺針頭，使用無菌敷料覆蓋包扎。聯(lián)合組于關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射PRP凝膠聯(lián)合MSCs，在C型臂X線機(jī)透視下，先將制備好的5ml PRP凝膠注入關(guān)節(jié)腔內(nèi)，再將5ml MSCs經(jīng)定位針頭注入關(guān)節(jié)腔，注射完畢后，退出穿刺針頭，使用無菌敷料（上海弘生醫(yī)療科技有限公司）覆蓋包扎。

1.4 觀察指標(biāo) 于術(shù)前及術(shù)后3、6、12個(gè)月對(duì)兩組患者進(jìn)行MRI檢查，測(cè)量脛骨隧道斜矢狀面位最大層面直徑，比較兩組術(shù)后脛骨隧道縮小程度。并于術(shù)前及術(shù)后3、6、12個(gè)月使用Lysholm評(píng)分、國(guó)際膝關(guān)節(jié)文獻(xiàn)委員會(huì)（International Knee Documentation Committee，IKDC）評(píng)分對(duì)患者膝關(guān)節(jié)功能進(jìn)行評(píng)價(jià)，總分均為100分，分?jǐn)?shù)越高，膝關(guān)節(jié)功能越好。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以表示，組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，組內(nèi)比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組患者手術(shù)前后脛骨隧道斜矢狀面位最大層面直徑比較 兩組術(shù)前、術(shù)后3個(gè)月脛骨隧道斜矢狀面位最大層面直徑比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），兩組術(shù)后3、6、12個(gè)月脛骨隧道斜矢狀面位最大層面直徑均明顯低于術(shù)前（均P＜0.05），且術(shù)后6、12個(gè)月聯(lián)合組均明顯低于單一組（均P＜0.05），見表1。

2.2 兩組患者手術(shù)前后Lysholm評(píng)分比較 兩組術(shù)前Lysholm評(píng)分比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），兩組術(shù)后3、6、12個(gè)月Lysholm評(píng)分均明顯高于術(shù)前（均P＜0.05），且聯(lián)合組均明顯高于單一組（均P＜0.05），見表2。

表1 兩組患者手術(shù)前后脛骨隧道斜矢狀面位最大層面直徑比較（mm）

表2 兩組患者手術(shù)前后Lysholm評(píng)分比較（分）

2.3 兩組患者手術(shù)前后IKDC評(píng)分比較 兩組術(shù)前IKDC評(píng)分比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），兩組術(shù)后3、6、12個(gè)月IKDC評(píng)分均明顯高于術(shù)前（均P＜0.05），且聯(lián)合組明顯高于單一組（均P＜0.05），見表3。

表3 兩組患者手術(shù)前后IKDC評(píng)分比較（分）

3 討論

ACL斷裂是目前青壯年多發(fā)的運(yùn)動(dòng)性損傷，其原因是膝蓋穩(wěn)定性降低導(dǎo)致活動(dòng)力下降[6]，患者多出現(xiàn)打軟、扭傷關(guān)節(jié)疼痛等癥狀，嚴(yán)重時(shí)可發(fā)展成為骨性關(guān)節(jié)炎[7]，嚴(yán)重影響患者日常生活，因此，采取積極有效的治療措施至關(guān)重要。多數(shù)學(xué)者主張進(jìn)行關(guān)節(jié)鏡下ACL重建術(shù)，通過肌腱移植物促進(jìn)腱骨愈合[8]，但肌腱移植物與骨組織常存在愈合緩慢的現(xiàn)象，有關(guān)研究顯示，術(shù)后仍有2%～25%的患者存在腱骨愈合慢、骨隧道擴(kuò)大等情況[9]。

ACL重建術(shù)后，腱骨愈合常需轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（TGF-β）、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）、血小板衍生因子（PDGF）等多種細(xì)胞因子作用[10-11]。PRP是全血中分離的血小板濃縮物，可通過血小板α-顆粒釋放大量細(xì)胞因子[12]，修復(fù)肌肉骨骼系統(tǒng)的損傷，促進(jìn)腱-骨隧道界面瘢痕化，從而促進(jìn)骨組織愈合。但PRP單獨(dú)使用時(shí)容易在關(guān)節(jié)液破壞下迅速流失[13]，使骨細(xì)胞再生能力受限，常存在術(shù)后腱骨愈合緩慢的狀況，而將PRP與凝血酶混合制成PRP凝膠，可防止血小板流失，使其長(zhǎng)時(shí)間停留在腱骨界面釋放細(xì)胞因子，從而延長(zhǎng)作用時(shí)間，同時(shí)PRP中含有白細(xì)胞，對(duì)防治重建術(shù)后感染具有一定意義。MSCs是存在于外周血、臍帶血及骨髓里的一種干細(xì)胞，具有多向分化潛能[14]，可在特定條件下誘導(dǎo)分化為成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、肌肉細(xì)胞等，直接促進(jìn)組織生長(zhǎng)。MSCs同樣能夠分泌多種細(xì)胞因子，促進(jìn)組織快速愈合，目前已廣泛應(yīng)用于軟骨修復(fù)、神經(jīng)修復(fù)及燒傷創(chuàng)面修復(fù)等治療中[15]，但用于ACL重建術(shù)后腱骨愈合的研究較少。PRP、MSCs取材方便，且均來源于自體血液，無排斥反應(yīng)，生物活性安全，減少了疾病傳播風(fēng)險(xiǎn)。

楊軍軍等[16]研究表明PRP聯(lián)合MSCs對(duì)促進(jìn)兔ACL重建后腱骨愈合效果較好，在此試驗(yàn)基礎(chǔ)下，本研究采用PRP聯(lián)合MSCs對(duì)人體進(jìn)行了研究，將肌腱移植物置于制備好的PRP、MSCs中浸泡，使得在注入PRP、MSCs時(shí)肌腱移植物可充分適應(yīng)PRP、MSCs環(huán)境，進(jìn)而發(fā)揮最佳療效，結(jié)果顯示，兩組患者術(shù)后6和12個(gè)月脛骨隧道斜矢狀面位最大層面直徑較術(shù)前明顯縮小，且聯(lián)合組明顯低于單一組，表明PRP聯(lián)合MSCs用于ACL重建術(shù)可明顯縮小脛骨隧道，促進(jìn)腱骨愈合，且療效優(yōu)于單獨(dú)使用PRP，這與兩者治療方式有關(guān)，PRP、MSCs通過關(guān)節(jié)腔直接注入，可與損傷部位直接接觸，使釋放的細(xì)胞因子直接作用于腱骨界面[17]，加速腱骨愈合。此外PRP中的PDGF可以促進(jìn)MSCs的分泌，加速M(fèi)SCs向肌腱細(xì)胞分裂，使MSCs在骨道內(nèi)大量增殖及分化[18]，加速了腱骨愈合過程。腱骨愈合的效果還可通過膝關(guān)節(jié)功能反映，Lysholm評(píng)分、IKDC評(píng)分是評(píng)價(jià)膝關(guān)節(jié)功能的標(biāo)準(zhǔn)[19-20]，得分越高表明膝關(guān)節(jié)功能越好。本研究顯示，術(shù)后兩組患者Lysholm評(píng)分、IKDC評(píng)分均明顯升高，且聯(lián)合組均明顯高于單一組，表明PRP聯(lián)合MSCs改善膝關(guān)節(jié)功能更加顯著。

綜上所述，PRP聯(lián)合MSCs可明顯加快ACL重建術(shù)后腱骨愈合，改善膝關(guān)節(jié)功能，較單一使用PRP具有顯著優(yōu)勢(shì)，值得臨床推廣應(yīng)用。

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