阿魏酸抑制A549肺癌移植瘤生長及其機制研究

吳競 王廷祥 魏楠 吳秀紹 劉杏娥

肺癌是全球癌癥相關(guān)死亡的首要原因[1]。盡管目前多種治療策略和抗癌藥物的使用提高了治療效果，但是肺癌患者的5年生存率仍然很低[2]。中藥被用來治療人類疾病已有幾百年的歷史。近年來，隨著聯(lián)合化療藥物的應用，中藥在腫瘤的治療中起著增強化療效果、減輕患者疼痛、延長患者生存時間等作用[3]。阿魏酸是從傘形科阿魏根莖中提取的一種中藥單體，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)其在結(jié)腸癌、肺癌和乳腺癌中具有抗腫瘤活性[4-6]。哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin,mTOR）是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，在調(diào)節(jié)細胞生長、增殖和凋亡過程中起著重要的作用。腫瘤的生長與腫瘤細胞增殖、凋亡密切相關(guān)，增殖蛋白Ki-67和凋亡蛋白半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）被廣泛用來檢測腫瘤生長過程中細胞增殖凋亡的影響。但是阿魏酸是否具有抑制肺癌生長的作用及其可能的機制尚未明確。本研究擬通過用阿魏酸干預肺癌動物模型，探究阿魏酸對肺癌移植瘤的影響，為臨床治療肺癌提供新思路。

1 材料和方法

1.1 實驗試劑 阿魏酸購自上海中醫(yī)藥研究所；A549細胞購自美國ATCC細胞庫；TUNEL試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；Trizol試劑盒購自美國Invitrogen公司；引物購自廣州銳博生物技術(shù)有限公司；mTOR、Ki-67、Caspase-3 和甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）一抗購自美國Sigma公司；雙氧水和檸檬酸鈉抗原修復液購自杭州昊鑫生物科技股份有限公司；DAB顯色盒購自北京中杉金橋有限公司。

1.2 實驗動物 6周齡BALB/c雄性裸鼠40只，SPF級，體重約（20±3）g，購自上海史萊克實驗動物有限公司，動物合格證編號：SCXK（滬）2012-0002。本實驗研究方案通過醫(yī)院倫理委員會批準。

1.3 細胞處理 將A549細胞加入含10%FBS的DMEM培養(yǎng)液中，37℃、5%CO2條件下進行培養(yǎng)，取對數(shù)生長期細胞用于后續(xù)實驗。

1.4 裸鼠移植瘤模型構(gòu)建 取對數(shù)生長期的A549細胞，配置成1×107/ml，向裸鼠右側(cè)腋窩皮下注射100μl（1×106個細胞）細胞懸液。在注射期間和注射后觀察注射部位有無包塊出現(xiàn)，保證無破潰區(qū)，無菌條件下飼養(yǎng)，建立裸鼠肺癌移植瘤模型。本研究40只裸鼠全部成瘤，成瘤率100.00%。

1.5 分組及給藥方法 采用隨機數(shù)字表法將模型裸鼠分為模型對照組、阿魏酸25mg/L組、阿魏酸50mg/L組和阿魏酸100mg/L組4組，每組10只。各組給藥方法：（1）模型對照組：腹腔注射0.2ml的 0.9%氯化鈉溶液；（2）阿魏酸25mg/L組：腹腔注射由25mg阿魏酸加入1L 0.9%氯化鈉溶液配置的25mg/L阿魏酸溶液0.2ml；（3）阿魏酸50mg/L組：腹腔注射由50mg阿魏酸加入1L 0.9%氯化鈉溶液配置的50mg/L阿魏酸溶液0.2ml；（4）阿魏酸 100mg/L組：腹腔注射由 100mg阿魏酸加入1L 0.9%氯化鈉溶液配置的100mg/L阿魏酸溶液0.2ml。各組每天給藥1次，連續(xù)3周。

1.6 移植瘤的處理 3周后脫臼處死裸鼠，記錄裸鼠瘤體質(zhì)量、移植瘤的長徑和短徑，腫瘤體積計算方式：體積=（長徑×短徑2）/2。計算腫瘤的抑瘤率來比較各組裸鼠瘤體質(zhì)量的差異性變化，抑瘤率=（1-實驗組平均瘤質(zhì)量/模型對照組平均瘤質(zhì)量）×100%。然后將腫瘤組織凍存于液氮中進行后續(xù)實驗。

1.7 qRT-PCR定量檢測mTOR mRNA表達水平 將移植瘤組織剪碎后加1ml Trizol提取組織總RNA，分光光度計測定RNA濃度，進行反轉(zhuǎn)錄成cDNA。以cDNA為模板，在TaqDNA聚合酶催化下進行PCR擴增。以U6為內(nèi)參，設計引物。mTOR上游：5′-GAACCTCAGGGCAAGATGCT-3′，下游：5′-CTGGTTTCCTCATTCCGGCT-3′。PCR 反應條件：94℃預變性 5min，95℃變性 10s，60℃退火 30s，72℃延伸 30s，擴增 40 個循環(huán)。采用2-ΔΔCT法進行結(jié)果分析。

1.8 Western blot法檢測 mTOR、Ki-67、Caspase-3 蛋白表達水平 將腫瘤組織剪碎后放入液氮進行研磨，加入500μl蛋白裂解液繼續(xù)研磨，離心去上清液，用蛋白定量法（BCA法）檢測蛋白濃度。取40μg總蛋白進行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），電泳結(jié)束后將其轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜，室溫下用5%的脫脂奶粉封閉30min，加入mTOR、Ki-67、Caspase-3一抗置于4℃孵育過夜，等滲鹽溶液加Tris-HCl緩沖液（TBST）洗膜后加入兔二抗于室溫下孵育2h，TBST洗膜后用ECL化學發(fā)光液進行化學發(fā)光反應并曝光。以GAPDH為內(nèi)參照，用Quantity One軟件對條帶灰度值進行測量并分析。

1.9 免疫組化法檢測組織中mTOR、Ki-67、Caspase-3蛋白表達水平 將腫瘤組織進行固定并常規(guī)石蠟包埋，進行連續(xù)切片，切片厚度約4μm。切片脫蠟至水，用檸檬酸鈉進行抗原修復，用3%雙氧水滅活內(nèi)源性氧化酶，加入 mTOR、Ki-67、Caspase-3 一抗（1：100）孵育后，加入二抗繼續(xù)孵育，用DAB溶液進行顯色，蘇木素復染后封片。視野下棕黃色顆粒為陽性結(jié)果，觀察蛋白在腫瘤組織中的表達情況。棕黃色顆粒越多，表示蛋白表達水平越高。

1.10 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件。計量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。每個實驗均重復3次。

2 結(jié)果

2.1 阿魏酸對肺癌腫瘤組織生長的影響 模型對照組裸鼠移植瘤的體質(zhì)量為（0.64±0.05）g；阿魏酸25mg/L組裸鼠移植瘤的體質(zhì)量為（0.43±0.03）g，抑瘤率為32.82%；阿魏酸50mg/L裸鼠移植瘤的體質(zhì)量為（0.36±0.04）g，抑瘤率為43.75%；阿魏酸100mg/L裸鼠移植瘤的體質(zhì)量為（0.24±0.03）g，抑瘤率高達62.51%；不同劑量的阿魏酸組與模型對照組比較，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05），見圖1a。另外，檢測肺癌移植瘤的體積發(fā)現(xiàn)，模型對照組裸鼠移植瘤體積為（0.98±0.11）cm3，不同劑量的阿魏酸組肺癌移植瘤生長也受到顯著的抑制，分別為（0.57±0.03）、（0.43±0.04）、（0.31±0.05）cm3，與模型對照組比較，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05），呈現(xiàn)劑量效應關(guān)系，見圖1b。

圖1 阿魏酸抑制瘤體質(zhì)量和體積（a：移植瘤體質(zhì)量；b：移植瘤體積；與模型對照組相比，*P＜0.05）

2.2 阿魏酸對肺癌移植瘤組織mTOR的mRNA和蛋白表達水平的影響 與模型對照組比較，不同劑量的阿魏酸組mTOR的mRNA和蛋白表達水平均下降，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05），并具有劑量依賴性，見圖2。

圖2 阿魏酸抑制瘤體質(zhì)量和體積（a：移植瘤體質(zhì)量；b：移植瘤體積；c：各組肺癌移植瘤組織mTOR蛋白表達水平；與模型對照組相比，*P＜0.05）

2.3 阿魏酸對肺癌移植瘤組織中Ki-67、Caspase-3蛋白表達的影響 與模型對照組比較，不同劑量的阿魏酸組處理移植瘤后，A549細胞的Ki-67蛋白表達水平均降低（均P＜0.05），并且隨著阿魏酸的劑量升高而降低；而Caspase-3蛋白表達水平均升高（均P＜0.05），亦具有劑量依賴性，見圖3。

圖3 阿魏酸對肺癌移植瘤組織中Ki-67、Caspase-3蛋白表達的影響（a：各組肺癌移植瘤組織Ki-67和Caspase-3蛋白表達電泳圖；b：各組肺癌移植瘤組織Ki-67和Caspase-3蛋白表達水平；與模型對照組相比，*P＜0.05）

2.4 免疫組化檢測肺癌移植瘤mTOR、Ki-67和Caspase-3蛋白表達水平 免疫組化結(jié)果顯示阿魏酸能抑制移植瘤組織中mTOR蛋白表達，并隨阿魏酸劑量升高移植瘤組織中mTOR蛋白表達水平降低更明顯。免疫組化結(jié)果亦顯示阿魏酸能抑制Ki-67蛋白表達，促進Caspase-3蛋白表達升高，見圖4（插頁）。

3 討論

我國作為傳統(tǒng)的中醫(yī)藥大國，中草藥資源豐富且易于獲得，因此，尋找合適的中藥防治肺癌不僅有助于完善肺癌的治療方案，減少肺癌患者的病死率，提高肺癌患者近期和遠期存活率，也可以作為肺癌姑息治療中的一種選擇，對治療肺癌具有重要意義。

阿魏酸作為一種芳香族化合物，大量存在于植物的細胞壁中。阿魏酸具有抗氧化、抗微生物、抗血小板、抗炎、抗高血脂和抗癌等多種生物活性[7]。Fong等[8]報道阿魏酸能通過增加腫瘤細胞內(nèi)源性活性氧生成抑制肺癌細胞的增殖和遷移。Nasr等[9]發(fā)現(xiàn)阿魏酸能通過抑制肺癌腫瘤細胞的粘連和遷移延緩腫瘤的進展。本研究通過檢測各組小鼠中肺癌移植瘤的體質(zhì)量和體積，發(fā)現(xiàn)阿魏酸可以抑制肺癌移植瘤的生長，并且100mg/L的阿魏酸抑瘤率高達62.51%。

已有研究報道m(xù)TOR蛋白的異常表達影響多種癌癥組織的生長和凋亡，比如肺癌、前列腺癌、肝癌、胃癌和乳腺癌[10]。Jin等[11]報道抑制mTOR蛋白表達能抑制肺癌增殖并促進肺癌的凋亡。本研究中qRT-PCR、Western blot和免疫組化結(jié)果均顯示阿魏酸干預后，肺癌移植瘤組織中mTOR表達受到抑制，說明阿魏酸可以抑制肺癌移植瘤組織中的mTOR表達，這可能是其發(fā)揮抑制肺癌移植瘤生長的一種機制。

Ki-67作為細胞增殖蛋白，其在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中有重要作用。Antonarakis等[12]研究表明Ki-67的表達增加與腫瘤的增殖和侵襲密切相關(guān)。Ji等[13]報道Ki-67的高表達與肺癌腫瘤組織的高增殖活性、低分化和早期侵襲轉(zhuǎn)移有關(guān)，并對肺癌患者的預后具有一定預測意義。Caspase-3作為含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶家族成員之一，在組織細胞凋亡過程中表達水平顯著增加[14]。本研究Western blot和免疫組化結(jié)果均顯示不同劑量的阿魏酸干預后，肺癌移植瘤組織中Ki-67表達下降，Caspase-3表達升高，說明阿魏酸抑制肺癌移植瘤增殖蛋白Ki-67表達和促進凋亡蛋白Caspase-3表達，導致腫瘤增殖受到抑制并促進腫瘤凋亡。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)阿魏酸可以抑制肺癌移植瘤的生長，其機制可能是通過下調(diào)mTOR蛋白表達，抑制增殖蛋白Ki-67表達和促進凋亡蛋白Caspase-3表達。之后筆者將通過細胞實驗進一步探索mTOR通路在阿魏酸抑制肺癌細胞增殖中的作用。

[1]Torre LA,Bray F,Siegel RL,et al.Global cancer statistics,2012[J].CA:a Cancer Journal for Clinicians,2015,65(2):87-108.doi:10.3322/caac.21262.

[2]Luo H,Yang A,Schulte BA,et al.Resveratrol induces premature senescence in lung cancer cells via ROS-mediated DNA damage[J].PLoS One,2013,8(3):e60065s.doi:10.1371/journal.pone.0060065.

[3]Zheng T,Que Z,Jiao L,et al.Herbal formula YYJD inhibits tumor growth by inducing cell cycle arrest and senescence in lung cancer[J].Scientific reports,2017,7(1):4984.doi:10.1038/s41598-017-05146-x.

[4]Roy N,Narayanankutty A,Nazeem PA,et al.Plant phenolics ferulic acid and P-coumaric acid inhibit colorectal cancer cell proliferation through egfr down-regulation[J].Asian Pac J Cancer Prev,2016,17(8):4019-4023.

[5]Tsai CM,Yen GC,Sun FM,et al.Assessment of the anti-invasion potential and mechanism of select cinnamic acid derivatives on human lung adenocarcinoma cells[J].Molecular Pharmaceutics,2013,10(5):1890-1900.doi:10.1021/mp3006648.

[6]Zhang X,Lin D,Jiang R,et al.Ferulic acid exerts antitumor activity and inhibits metastasis in breast cancer cells by regulating epithelial to mesenchymal transition[J].Oncology Reports,2016,36(1):271-278.doi:10.3892/or.2016.4804.

[7]Peng CC,Chyau CC,Wang HE,et al.Cytotoxicity of ferulic Acid on T24 cell line differentiated by different microenvironments[J].Biomed Research International,2013,2013:579859.doi:10.1155/2013/579859.

[8]Fong Y,Tang CC,Hu HT,et al.Inhibitory effect of trans-ferulic acid on proliferation and migration of human lung cancer cells accompanied with increased endogenous reactive oxygen species and beta-catenin instability[J].Chinese Medicine,2016,11:45.doi:10.1186/s13020-016-0116-7.

[9]Nasr Bouzaiene N,Kilani Jaziri S,Kovacic H,et al.The effects of caffeic,coumaric and ferulic acids on proliferation,superoxide production,adhesion and migration of human tumor cells in vitro[J].Eur J Pharmacol,2015,766:99-105.doi:10.1016/j.ejphar.2015.09.044.

[10]Populo H,Lopes JM,Soares P.The mTOR signalling pathway in human cancer[J].International Journal of Molecular Sciences,2012,13(2):1886-1918.doi:10.3390/ijms13021886.

[11]Jin H,Jiang AY,Wang H,et al.Dihydroartemisinin and gefitinib synergistically inhibit NSCLC cellgrowth and promote apoptosis via the Akt/mTOR/STAT3 pathway[J].MolMed Rep,2017,16(3):3475-3481.doi:10.3892/mmr.2017.6989.

[12]Antonarakis ES,Keizman D,Zhang Z,et al.An immunohistochemical signature comprising PTEN,MYC,and Ki-67 predicts progression in prostate cancer patients receiving adjuvant docetaxel after prostatectomy[J].Cancer,2012,118(24):6063-6071.doi:10.1002/cncr.27689.

[13]Ji Y,Zheng M,Ye S,et al.PTEN and Ki-67 expression is associated with clinicopathologic features of non-small cell lung cancer[J].J Biomed Res,2014,28(6):462-467.doi:10.7555/jbr.27.20130084.

[14]Zhao Y,Jing Z,Lv J,et al.Berberine activates caspase-9/cytochrome c-mediated apoptosis to suppress triple-negative breast cancer cells in vitro and in vivo[J].Biomed Pharmacother,2017,95:18-24.doi:10.1016/j.biopha.2017.08.045.