重組人源Kunitz型蛋白酶抑制劑治療大鼠腦皮質(zhì)缺血/再灌注損傷

孫曉杰，郭寶鋒，王冰

(吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院整形外科，長春　130021)

牛胰蛋白酶抑制劑(bovine pancreatic trypsin inhibitor)BPTI作為Kunitz屬絲氨酸蛋白酶抑制劑，是目前研究的最廣泛的蛋白酶抑制劑之一[1]。人Aβ淀粉樣蛋白前體(APP)包含的一段57個氨基酸序列結(jié)構(gòu)，與Kunitz型絲氨酸蛋白酶抑制劑家族高度同源[2]。我們前期利用同源重組技術(shù)制備了人源絲氨酸蛋白酶抑制劑(rhKD/APP)，并在體外研究了它的三級結(jié)構(gòu)、空間構(gòu)象和活性中心，證實了它的絲氨酸蛋白酶的抑制功能活性[3 ]。缺血/再灌注(ischemia/reperfusion, I/R)損傷是指機體器官缺血一定時間后再恢復(fù)血液灌注，組織損傷反而進(jìn)行性加重的病理生理學(xué)現(xiàn)象，其中，保護(hù)神經(jīng)元缺血/再灌注損傷，是缺血性腦血管病挽救半暗帶神經(jīng)功能的核心要素。既往研究顯示，BPTI能通過降低腦細(xì)胞水腫[4]，保護(hù)血腦屏障，發(fā)揮明確的神經(jīng)保護(hù)作用[5-6]。然而，作為從牛肺中提純的堿性蛋白酶，異體蛋白BPTI具有高抗原性[7]。本研究旨在大鼠腦缺血/再灌注動物模型上，探索人源重組絲氨酸蛋白酶抑制劑rhKD/APP治療缺血/再灌注損傷的臨床效果和潛在分子調(diào)控機制。

1　材料與方法

1.1　材料

1.1.1實驗動物

2～3月齡清潔級Sprage-Dawley (SD)大鼠60只，雄性，體重270～300 g，來源于吉林大學(xué)實驗動物部【SCXK(吉)2015-0001】，無菌手術(shù)在吉林大學(xué)實驗動物科學(xué)部動物實驗室進(jìn)行【SYXK(吉)2015-0001】。飼養(yǎng)期間給予大鼠標(biāo)準(zhǔn)飼料和潔凈飲用水，飼養(yǎng)環(huán)境：晝夜各半節(jié)律，濕度恒定，所有操作均符合實驗動物倫理學(xué)要求。

1.1.2實驗試劑

rhKD/APP (吉林大學(xué)藥學(xué)院賀巾超博士惠贈)，尼莫地平針劑 (Bayer, 德國)，氯化三苯基四氮唑 (TTC) (北京化學(xué)試劑廠)，SOD測定試劑盒 (Sigma，美國)，Na+-K+-ATP酶活性試劑盒 (Sigma，美國)，MDA檢測試劑盒 (Sigma，美國)，MPO測定試劑盒(南京建成生物公司)，TUNEL檢測試劑盒(寶靈曼,德國)，ICAM-1單抗、E-selectin多抗、caspase-3免疫組化、Bcl-2和Bax的western blot試劑盒，均購置Santa Cruz,美國。

1.2　方法

1.2.1大腦缺血/再灌注大鼠模型的構(gòu)建和評估

參照Zealonga線栓法制備大鼠右側(cè)大腦中動脈阻斷 (middle cerebral artery occlusion，MCAO)的局灶腦缺血/再灌注模型，神經(jīng)功能缺損用雙盲法進(jìn)行評分。取60只大鼠隨機均分為6組，每組10只。3個干預(yù)組分別為低劑量干預(yù)組 (rhKD/APP, 4 mg/kg)；中劑量干預(yù)組 (rhKD/APP, 8 mg/kg))；高劑量干預(yù)組(rhKD/APP, 16 mg/kg))；尼莫地平治療組 (Nimodipine, 0.7 mg/kg腹腔注射)為陽性對照；同時設(shè)置MCAO缺血/再灌注模型組作為陰性對照，偽手術(shù)組作為空白對照。

1.2.2病理學(xué)評估

取缺血3 h再灌注24 h大鼠，麻醉犧牲后取腦。常規(guī)蘇木素-伊紅(H&E)染色進(jìn)行病理評估。冠狀逐片切取腦片進(jìn)行TTC磷酸緩沖液染色，評估腦片梗死面積。染色前后稱濕重和干重，計算腦片含水量。

1.2.3自由基鏈、中性粒細(xì)胞酶MPO以及粘附因子表達(dá)的分組檢測

制備5%腦組織勻漿，分別檢測反映經(jīng)典自由基激活程度的三個指標(biāo)超氧物歧化酶 (SOD) 活性，Na+-K+-ATP酶活性、膜氧代謝產(chǎn)物丙二醇 (MDA) 含量，以及反映中性粒細(xì)胞激活程度的髓過氧化物酶(MPO)活性。腦片常規(guī)固定，免疫組化試劑盒檢測腦片ICAM-1和E-selectin表達(dá)。所有檢測均根據(jù)試劑盒說明書操作。

1.2.4神經(jīng)細(xì)胞的凋亡評估

常規(guī)制備缺血/再灌注石蠟切片，計數(shù)TUNEL陽性細(xì)胞為凋亡細(xì)胞，圖像分析計算凋亡細(xì)胞個數(shù)。caspase-3的免疫組化檢測在4%多聚甲醛處理的30 μm厚冠狀切片上完成。腦組織冰上分離即刻制備勻漿，右側(cè)損傷區(qū)為被檢測區(qū)，對側(cè)作為對照區(qū)，常規(guī)Western blot法檢測caspase-3、Bcl-2以及Bax的蛋白表達(dá)。

注：A. 假手術(shù)組；B.缺血/再灌注模型組；C. rhKD/A PP低劑量干預(yù)組(4 mg/kg)；D. rhKD/APP中劑量干預(yù)組(8 mg/kg)； E. rhKD/APP高劑量干預(yù)組(16 mg/kg)；F. 尼莫地平組。圖1　各組缺血/再灌注大鼠腦片的TTC染色結(jié)果Note. A. Sham group. B. I/R reperfusion group. C. rhKD/APP (4 mg/kg) treatment group. D. rhKD/APP (8 mg/kg) treatment group. E. rhKD/APP (16 mg/kg) treatment group. F. Nimodipine group.Fig.1　Representative TTC-staining results in the cerebral cortex tissues of rats with ischemia/reperfusion injury

1.3　統(tǒng)計學(xué)方法

2　結(jié)果

各劑量rhKD/APP干預(yù)組的預(yù)治療，均能改善腦缺血/再灌注大鼠的神經(jīng)缺損癥狀，降低腦梗死面積和腦水腫，且存在一定的劑量/效應(yīng)相關(guān)性，此神經(jīng)保護(hù)作用，可能通過清除自由基超載，拮抗炎性中性粒細(xì)胞呼吸爆炸，延遲神經(jīng)元凋亡等綜合實現(xiàn)。

2.1　rhKD/APP干預(yù)的缺血/再灌注大鼠臨床分組評估

缺血3 h/再灌注24 h模型組大鼠的神經(jīng)功能缺損明顯，模型組評分為(5.98±1.00)，低、中、高劑量組的神經(jīng)功能缺損評分分別為(1.80±0.25)、(1.63±0.05)和(1.30±0.25)(P< 0.05)。與尼莫地平組(1.92±0.50)比較，組間差異無顯著性 (P> 0.05)。模型組死亡率達(dá)26.5%，低、中、高劑量干預(yù)組的死亡率分別為18.5%、16.7%和14.0%(P< 0.05)，但與尼莫地平組(18.2%)比較，組間差異無顯著性(P> 0.05)。

2.2　rhKD/APP干預(yù)的大鼠腦缺血/再灌注腦皮質(zhì)區(qū)病理改變和腦水腫的分組評估

缺血/再灌注右腦皮質(zhì)中心可見腦梗死灶，周圍出現(xiàn)半暗帶區(qū)和腦水腫區(qū)。各個干預(yù)組和尼莫地平組大鼠，缺血中心區(qū)神經(jīng)元壞死均減輕，半暗帶區(qū)神經(jīng)元數(shù)量均增多，周圍細(xì)胞水腫均改善。經(jīng)TTC染色的腦片梗死面積，低、中、高劑量干預(yù)組分別為(21.82±2.96)、(20.43±2.33)和(14.71±3.12)，與模型組(35.42±2.21)比較均顯著減少(P< 0.05)，但是與尼莫地平組(19.92±3.47)比較，差異均無顯著性 (P> 0.05)(圖1)。腦含水量定量檢測結(jié)果的分組比較，與上述梗死面積的結(jié)果一致：低、中、高劑量干預(yù)組分別為(17.63±1.54)、(13.52±2.38)和(10.24±1.42)，與模型組(20.81±2.37)比較顯著降低(P< 0.05)，但是與尼莫地平組(14.72±2.54)比較差異無顯著性 (P> 0.05)。

2.3　各組腦片氧自由基的指標(biāo)和髓過氧化物酶活性水平

分組檢測腦勻漿反映氧自由基活化程度的三個指標(biāo)(SOD活性、Na+-K+-ATP酶活性、MDA含量)以及反映腦勻漿內(nèi)中性粒細(xì)胞激活程度的髓過氧化物酶MPO活性，各組平均水平見表1。其中，每活性單位MPO的意義為每毫克每小時腦勻漿H2O2在標(biāo)準(zhǔn)條件下被分解為1 nmol/L的酶活性。由表可見，三個干預(yù)組的中性粒細(xì)胞MPO酶活性降低，與R/I模型組比較，均呈現(xiàn)顯著降低(P< 0.05)，而尼莫地平組MPO活性，與模型組比較差異無顯著性(P> 0.05)。與尼莫地平組比較，各個劑量rhKD/APP降低MPO活性的能力均有顯著優(yōu)勢(P< 0.05)。

表1　腦勻漿SOD、MDA、Na+-K+-ATPase、MPO的分組表達(dá)Tab.1　Expression of SOD, MDA, Na+-K+-ATPase and MPO activity in the cerebral cortex tissues of the rhKD/APP-treated rats with

注：與模型組比較，*P< 0.05；與尼莫地平比較，#P< 0.05。

Note.*P< 0.05, vs. the model group；#P< 0.05,vsthe Nimodipine group.

2.4　各組腦片ICAM-1和E-selectin免疫組化表達(dá)

重組人源絲氨酸酶抑制劑干預(yù)組和尼莫地平治療組I/R大鼠腦片的ICAM-1/E-selectin的陽性血管表達(dá)情況見圖2，本圖選擇中劑量組rhKD/APP抑制劑組和尼莫地平治療組的表達(dá)比較。在表達(dá)ICAM-1的視野內(nèi)，抑制劑組陽性血管數(shù)量略少，且細(xì)胞表達(dá)強度略弱；在表達(dá)E-seletin的視野內(nèi)，抑制劑組的陽性血管數(shù)略少，但是表達(dá)強度和尼莫地平組并無差異。I/R模型組表達(dá)ICAM-1和E-selectin陽性血管，每視野不低于5個(結(jié)果未顯示)。

注：A. rhKD/APP干預(yù)組ICAM-1陽性表達(dá)； B. 尼莫地平組ICAM-1陽性表達(dá)； C. rhKD/APP干預(yù)組E-selectin陽性表達(dá)； D. 尼莫地平組E-selectin陽性表達(dá)。圖2　干預(yù)組和尼莫地平組腦片內(nèi)皮細(xì)胞粘附因子ICAM-1與E-selectin的表達(dá)比較Note. A. Expression of ICAM-1 in the rhKD/APP group. B. Expression of ICAM-1 in the Nimodipine group. C. Expression of E-selectin in the rhKD/APP Group. D. Expression of E-selectin in the Nimodipine Group.Fig.2　Expression of ICAM-1 and E-selectin in the cerebral cortex tissues of rhKD/APP-treated rats with ischemia/reperfusion injury(Immunohistochemical staining)

2.5　rhKD/APP干預(yù)的大鼠缺血/再灌注神經(jīng)細(xì)胞凋亡信號蛋白的分組表達(dá)

低、中、高劑量干預(yù)組大鼠腦組織TUNEL陽性細(xì)胞分別為(56.8±3.6)，(33.2±4.6)，(29.6±2.1)，尼莫地平組為(36.4±4.3)，與模型組 (69.6±4.6) 相比,四組神經(jīng)凋亡細(xì)胞均明顯減少(P< 0.05)。重組人源絲氨酸酶抑制劑干預(yù)組和尼莫地平治療組腦片TUNEL陽性細(xì)胞的表達(dá)結(jié)果見圖3，這里展示了中劑量組rhKD/APP和尼莫地平組的比較。展示的視野中，中劑量干預(yù)組凋亡細(xì)胞數(shù)量雖較尼莫地平組少，但局部腦組織的水腫程度略重。

重組人源絲氨酸酶抑制劑干預(yù)組和尼莫地平治療組I/R大鼠腦片caspase-3的表達(dá)結(jié)果見圖4。這里展示的仍是中劑量組rhKD/APP干預(yù)組和尼莫地平組的比較。展示的視野中，中劑量干預(yù)組caspase-3陽性數(shù)量較尼莫地平組多，但表達(dá)強度降低，提示凋亡信號的復(fù)雜性。

注：A. rhKD/APP干預(yù)組TUEL陽性細(xì)胞；B. 尼莫地平組TUEL陽性細(xì)胞。圖3　干預(yù)組與尼莫地平組大鼠腦片TUNEL陽性細(xì)胞表達(dá)比較Note: A. TUNEL-positive cells in the rhKD/APP Group. B. TUNEL-positive cells in the Nimodipine group.Fig.3　TUNEL-positive cells in the cerebral cortex tissues of rhKD/APP-treated rats with cerebral ischemia/reperfusion injury (Immunohistochemical staining)

注: A. rhKD/APP干預(yù)組caspase3陽性表達(dá)細(xì)胞；B. 尼莫地平組caspase3陽性表達(dá)細(xì)胞。圖4　干預(yù)組與尼莫地平組大鼠腦片Caspase-3陽性細(xì)胞表達(dá)比較Note: A. Caspase 3-positive cells in the rhKD/APP group. B. Caspase 3-positive cells in the Nimodipine group.Fig.4　Caspase 3-positive cells in the cerebral cortex tissues of rhKD/APP-treated and Nimodipine-treated rats with ischemia/reperfusion injury (Immunohistochemical staining)

為了進(jìn)一步探索caspase依賴的凋亡信號的開啟程度，對各組腦腦皮質(zhì)凋亡蛋白進(jìn)行定量檢測(見圖5)。Western Blot蛋白條帶的數(shù)值化通過灰度分析進(jìn)行，每個條帶的定量結(jié)果均經(jīng)各自內(nèi)參配平，蛋白定量結(jié)果由在線軟件分析后自動算出 (Image J)。圖5 A是caspase-3及其降解產(chǎn)物P17的表達(dá)條帶。如圖可見，偽手術(shù)組神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)僅表達(dá)未降解激活的caspase-32片段，I/R模型組則可看到降解產(chǎn)物P17的高表達(dá)。中、高劑量干預(yù)和尼莫地平治療后，P17的表達(dá)減少，說明神經(jīng)細(xì)胞凋亡caspase降解信號得到了拮抗，尼莫地平組和中、高劑量組之間P17的定量表達(dá)，組間差異無顯著性。圖5B和5C分別為Bcl-2和Bax的定量表達(dá)水平，無論Blc-2還是Bax的表達(dá)，尼莫地平組的表達(dá)量均與中劑量干預(yù)組的表達(dá)量接近，然而，尼莫地平治療組和中、高劑量干預(yù)組比較，三組間差異仍無顯著性。綜上，伴隨絲氨酸酶抑制劑治療量的增加，caspase-P17表達(dá)下調(diào)，Bcl-2/Bax比值呈現(xiàn)同步上調(diào)變化，這些凋亡蛋白在中、高劑量干預(yù)組與尼莫地平組的表達(dá)灰度，組間差異無顯著性。

注：A. Caspase-3及其降解產(chǎn)物P17的Western Blot表達(dá)條帶；B和C. bcl-2以及bax的Western blot表達(dá)條帶。圖5　各組Caspase-3、bcl-2以及bax的Western blot表達(dá)結(jié)果Note: A. Quantitative expression of caspase-3 and its degenerated P-17. B and C. Quantitative expression of Bcl-2 and Bax.Fig.5　Western blot analysis of the expression of caspase-3, Bcl-2 and Bax in the cerebral cortex tissues after ischemia/reperfusion injury

3　討論

本實驗應(yīng)用人源重組絲氨酸酶抑制劑rhKD/APP臨床治療大鼠腦缺血/再灌注的腦皮質(zhì)神經(jīng)損傷，顯示出良好的神經(jīng)保護(hù)效應(yīng)，且有劑量-療效相關(guān)性。缺血/再灌注損傷的神經(jīng)元凋亡調(diào)控網(wǎng)絡(luò)具有明確的雌激素依賴的性別差異[8-9]，而絲氨酸蛋白酶抑制劑可廣泛下調(diào)性激素蛋白受體的表達(dá)，因此，本研究僅選擇雄鼠進(jìn)行動物模型的制備，以消除本底雌激素差異對研究結(jié)果的影響。絲氨酸酶抑制劑臨床最廣泛應(yīng)用是調(diào)控凝血功能和炎性反應(yīng)。腦缺血/再灌注損傷的機制則非常復(fù)雜，至少涉及缺血期的氧化應(yīng)激異常、自由基超載、鈣超載，以及再灌注期的中性粒細(xì)胞激活(呼吸爆發(fā))等多個信號網(wǎng)絡(luò)的交叉調(diào)控。結(jié)合上述兩個方向，本研究選擇了以拮抗鈣超載為核心的經(jīng)典神經(jīng)保護(hù)藥物尼莫地平為陽性對照，在神經(jīng)細(xì)胞缺血/再灌注損傷的檢測指標(biāo)選擇上，我們分別入選了針對缺血超早期的氧化應(yīng)激和自由基超載指標(biāo)，以及針對再灌注超早期的中性粒細(xì)胞激活指標(biāo)MPO以及促進(jìn)中性粒細(xì)胞激活的血管內(nèi)皮分泌的粘附因子。線粒體功能異常是缺血期的啟動核心，它直接激活了細(xì)胞色素C依賴的細(xì)胞凋亡信號。細(xì)胞膜Na+-K+-ATP酶雖然對缺血缺氧的敏感性不高，但是對再灌注損傷非常敏感，這些細(xì)胞膜離子轉(zhuǎn)運蛋白的再灌注損傷，加重了細(xì)胞內(nèi)鈣超載以及自由基連鎖反應(yīng)，同時激活了細(xì)胞表面受體依賴的凋亡信號。因此，如何拮抗神經(jīng)元的凋亡，是挽救腦缺血/再灌注半暗帶損傷的重心。既往研究顯示，絲氨酸酶抑制劑能夠拮抗多個凋亡信號，抑制神經(jīng)元凋亡[10-12]。本實驗結(jié)果也顯示，各個劑量人源重組絲氨酸酶抑制劑的干預(yù)，均能夠拮抗大鼠缺血/半暗帶區(qū)受損細(xì)胞的凋亡，表現(xiàn)為caspase-17表達(dá)降低，Bcl-2/Bax比值下調(diào)。從缺血期的分子機制看，絲氨酸酶抑制劑下調(diào)了自由基超載，酶抑制劑通過抑制溶酶體的破壞穩(wěn)定細(xì)胞膜，同時抑制了溶酶體釋放出來的具有絲氨酸中心的活性酶的激活[13]。Na+-K+-ATP系列酶中也有以絲氨酸為活性中心的關(guān)鍵酶，因此，rhKD/APP能延緩ATP的降解速度，改善缺血乏氧。同時，絲氨酸蛋白酶抑制劑能下調(diào)激酶和緩肽酶的生成，抑制次黃嘌呤脫氫酶轉(zhuǎn)化為黃嘌呤氧化酶，對抗氧自由基的損傷。從再灌注期的機制看，絲氨酸酶抑制劑能顯著降低再灌注區(qū)反映中性粒細(xì)胞激活的MPO酶活性[14]，而且顯著優(yōu)于尼莫地平。激活的中性粒細(xì)胞會產(chǎn)生大量活性氧，使炎癥與自由基形成正反饋，共同加重腦組織缺血/再灌注損傷[15]。在這個激活環(huán)路中，ICAM-1和E-選擇素的上調(diào)尤為關(guān)鍵，敲除ICAM-1基因的大鼠對缺血/再灌注損傷的易感性降低[16]。同時，ICAM-1的表達(dá)下調(diào)，也可以降低缺血/再灌注腦皮質(zhì)的凋亡信號。絲氨酸蛋白酶抑制劑可以抑制粘附因子表達(dá)過程以絲氨酸為活性中心蛋白，減少血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)粘附因子[5]，進(jìn)一步下調(diào)中性粒細(xì)胞的過激活。綜上，絲氨酸酶抑制劑在大腦缺血/再灌注損傷的雙期，均顯示出臨床治療機制[17]。

雖然各個劑量的絲氨酸酶抑制劑干預(yù)均展示出神經(jīng)保護(hù)療效，但是，只有反映中性粒細(xì)胞激活程度的MPO酶活性這一個指標(biāo)，與尼莫地平治療比較，有顯著優(yōu)勢。這可能是因為絲氨酸酶抑制劑分子量大，通過血腦屏障效率低，但是中性粒細(xì)胞呼吸爆發(fā)不需要通過血腦屏障，所以該指標(biāo)對酶抑制劑的敏感度高。除這個指標(biāo)外，反映氧自由基超載、粘附因子表達(dá)和神經(jīng)凋亡的各個指標(biāo)，酶抑制劑干預(yù)與尼莫地平治療并無顯著差異。從整體上看，中劑量rhKD/APP干預(yù)組的各個均數(shù)與尼莫地平組基本接近，而高劑量組則顯示出一定的優(yōu)勢。

綜上，絲氨酸蛋白酶抑制劑通過抑制多種以絲氨酸為活性中心的蛋白酶，拮抗缺血期的自由基損傷，降低再灌注期的中性粒細(xì)胞過度活化，雙信號拮抗神經(jīng)細(xì)胞凋亡，發(fā)揮對腦缺血/再灌注的神經(jīng)保護(hù)作用，與經(jīng)典神經(jīng)保護(hù)藥物尼莫地平比較，臨床療效無明顯差異。雖然我們的研究結(jié)果顯示一定的劑量/效應(yīng)相關(guān)，而且本研究中未見明顯毒副作用，但是由于絲氨酸酶抑制劑的廣譜性，應(yīng)該慎重提高給藥劑量。我們擬加大樣本量，延長臨床觀察窗，繼續(xù)相關(guān)的臨床治療研究。得益于人源重組絲氨酸酶抑制劑的低免疫原性，該生物工程藥物rhKD/APP應(yīng)用人腦缺血/半暗帶的神經(jīng)保護(hù)的臨床前景值得期待。