土木香內(nèi)酯對C6腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移侵襲及凋亡的影響

王迅，王李桃，張波

(1. 大連市第三人民醫(yī)院神經(jīng)外科， 遼寧省 大連　116033； 2. 大連醫(yī)科大學(xué)附屬第二臨床學(xué)院神經(jīng)外科,遼寧省 大連　116027)

膠質(zhì)瘤是最常見的神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤，約占原發(fā)性腦腫瘤的60%。目前臨床上仍采用手術(shù)結(jié)合放化療的方法，但效果欠佳，預(yù)后差，死亡率高[1]。而且近年來，膠質(zhì)瘤患者對常規(guī)化療藥多耐性的問題日趨顯著。若能探尋到多種作用途徑的藥物，必將使廣大膠質(zhì)瘤患者從中獲益。

中藥抗腫瘤歷史悠久，因其毒副作用小，且具有多途徑多靶點(diǎn)抗腫瘤作用的可能，因此長期致力于中藥抗膠質(zhì)瘤的篩選具有重要的戰(zhàn)略意義。土木香內(nèi)酯(Alantolactone，AL)是從土木香的根中分離出的半萜內(nèi)酯類化合物，具有較好的抗炎、驅(qū)蟲、抗菌、抗腫瘤等方面的作用[2]。AL在抗肝癌、結(jié)腸癌及白血病等研究中已有報(bào)道[3-5]，而且Khan等[6]研究發(fā)現(xiàn)AL能透過血腦屏障，這使其在治療中樞性系統(tǒng)疾病中的應(yīng)用成為可能。本文旨在探討AL對大鼠C6膠質(zhì)細(xì)胞瘤的抑制作用及可能的作用機(jī)制。

1　材料與方法

1.1　材料

1.1.1細(xì)胞株與試劑

大鼠C6腦膠質(zhì)細(xì)胞株(購于ATCC 美國)；土木香內(nèi)酯(純度 > 98%，購于上海同田生物技術(shù) 中國)；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(購于Hyclone 美國)；N-cadherin、E-cadherin、cleaved PARP、cleaved caspase-3、cleaved caspase-9、Cyto c、GAPDH等單克隆抗體(購于Cell Signaling Technology 美國)；AnnexinV-FITC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(購于南京凱基生物科技 中國)；線粒體膜電位檢測試劑盒(JC-1)(購于上海碧云天生物技術(shù) 中國)。

1.1.2主要儀器與設(shè)備

多功能酶標(biāo)儀(Perkin Elmer美國)；C6流式細(xì)胞儀、蛋白/核酸凝膠成像儀(BD美國)；CKX41型倒置相差顯微鏡(Olympus日本)；正置/倒置熒光顯微鏡(Leica德國)；Western Blot 儀器(北京六一 中國)。

1.2　方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)

C6 細(xì)胞培養(yǎng)于含 10% FBS的 DMEM培養(yǎng)基中，于 5% CO2、95%濕度、37℃恒溫孵育箱中培養(yǎng)傳代。

1.2.2藥液儲備及使用濃度

配制土木香內(nèi)酯(AL)母液濃度為 100 mmol/L 溶解于二甲基亞砜 (DMSO)，-20℃保存?zhèn)溆?。使用時(shí)采用含1% FBS的DMEM培養(yǎng)基稀釋至終濃度為5、10 μmol/L。

1.2.3細(xì)胞活力檢測(MTT 法)

取對數(shù)期生長的C6細(xì)胞(密度為5×103個(gè)/mL)，接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔加入100 μL細(xì)胞懸液，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔；待細(xì)胞生長至 70%以上匯合度時(shí)，依次施予不同濃度的AL，共 6個(gè)濃度梯度(0、1、5、10、20、40 μmol/L)，給藥后分別孵育觀測至12、24 h及48 h終止，各加入 5 mg/mL的MTT 15 μL，孵育4 h后棄掉孔內(nèi)液體，每孔加入DMSO 150 μL，搖勻后，采用波長為490 nm的酶標(biāo)儀測定每孔 OD值。利用OD值計(jì)算出細(xì)胞增殖率 (酶標(biāo)儀所示 OD值減去空白組OD值)。以細(xì)胞活性為縱坐標(biāo)，以藥物濃度為橫坐標(biāo)，繪制細(xì)胞活力的折線圖。

1.2.4Transwell小室實(shí)驗(yàn)

將C6細(xì)胞種植于表面有基質(zhì)膠的Transwell小室上室中，下室用600 μL含有10% FBS的培養(yǎng)基填充。上、下室均含有不同濃度(0、5、10 μmol/L)的AL處理，經(jīng)孵育24 h后，用棉簽擦拭上層膜表面的非侵入性細(xì)胞。下層侵入細(xì)胞用甲醇固定，并用0.1%結(jié)晶紫染色溶液染色。顯微鏡下拍照，選取每個(gè)膜的五個(gè)獨(dú)立區(qū)域中計(jì)數(shù)細(xì)胞。

1.2.5體外遷移實(shí)驗(yàn)

將 C6細(xì)胞接種于 6 孔板，待細(xì)胞長滿后，用 200 μL移液槍槍頭在各孔板上做垂直直線劃痕，然后棄掉培養(yǎng)基，PBS清洗后，分別施予含0、5、10 μmol/L濃度AL的新培養(yǎng)基(含1% FBS)。在倒置顯微鏡下拍照(×100)，先拍下藥物處理 0 h時(shí)劃痕位置照片，并使用記號筆記錄拍攝照片的位置。再培養(yǎng)24 h后，再根據(jù)之前記錄的位置拍攝劃痕后變化的照片。

1.2.6細(xì)胞凋亡檢測

將C6細(xì)胞種植于6孔板中，采用不同濃度AL (0、5、10 μmol/L處理 24 h后；收集各組細(xì)胞， PBS 洗滌 2次，加入 500 μL 的 binding buffer 懸浮細(xì)胞；加入5 μL annexin V-FITC 混勻后；加入5 μL propidium iodide混勻后；在室溫避光下反應(yīng)15 min；于流式細(xì)胞儀上進(jìn)行熒光檢測。

1.2.7線粒體膜電位檢測(采用JC-1熒光探針試劑盒)

將C6細(xì)胞種植于6孔板中，采用不同濃度AL (0、 5、10 μmol/L)處理 24 h后；吸除培養(yǎng)液，加入1 mL JC-1染色工作液，充分混勻。細(xì)胞培養(yǎng)箱中37℃孵育20 min，吸除上清，用JC-1染色緩沖液洗滌2次，加入2 mL細(xì)胞培養(yǎng)液，熒光顯微鏡下觀察拍照。

1.2.8Western blot檢測

收集經(jīng)0、5、10 μmol/L濃度組AL處理24 h后的細(xì)胞，提取總蛋白及去線粒體的胞質(zhì)蛋白，采用BCA法測定蛋白濃度，經(jīng)凝膠電泳分離，采用半干法將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉，分別孵育一抗、二抗后洗膜顯影。

1.3　統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2　結(jié)果

2.1　AL抑制C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖

經(jīng)MTT法檢測發(fā)現(xiàn)(如圖1)，AL能顯著抑制C6細(xì)胞的生長活力，且呈劑量及時(shí)間依賴性。計(jì)算AL作用后12、24 h及48 h的IC50值分別為14.27、10.01、8.35 μmol/L。

注：不同濃度AL(0、1、5、10、20、40 μmol/L)分別作用于C6細(xì)胞12、24、48 h。圖1　AL抑制C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞活力的作用曲線Note. Different concentrations of AL (0, 1, 5, 10, 20, 40 μmol/L) were applied to C6 cells for 12, 24 h and 48 h.Fig.1　Inhibitory effect of AL on the activity of glioma C6 cells

2.2　AL通過調(diào)節(jié)鈣粘素(cadherins)蛋白抑制C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移侵襲

AL能顯著抑制C6細(xì)胞的穿透侵襲能力(P< 0. 05)，且呈劑量依賴性(圖2A)。AL能顯著抑制C6細(xì)胞的劃痕愈合能力(P< 0. 05)，且呈劑量依賴性(圖2B)。Western blot檢測與膠質(zhì)瘤侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)的兩種蛋白N-cadherin和E-cadherin，AL在降低N-cadherin蛋白表達(dá)的同時(shí)升高E-cadherin蛋白的表達(dá)，且呈劑量依賴性(圖2C)。

2.3　AL通過調(diào)節(jié)細(xì)胞色素 C/ Caspase 信號通路誘導(dǎo)C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡

AL能明顯上調(diào)C6細(xì)胞的凋亡數(shù)(P< 0. 05)，且呈劑量依賴性。線粒體損傷線粒體膜電位下降是細(xì)胞凋亡的早期標(biāo)志。JC-1是一種檢測線粒體膜電位的理想熒光探針。在線粒體膜電位較高時(shí)，JC-1聚集在線粒體的基質(zhì)中，形成聚合物，產(chǎn)生紅色熒光；在線粒體膜電位較低時(shí)，JC-1不能聚集在線粒體的基質(zhì)中，此時(shí)JC-1為單體，產(chǎn)生綠色熒光(圖3A)。AL能明顯促使JC-1多聚體(紅光)向單體(綠光)的轉(zhuǎn)變。線粒體損傷后細(xì)胞色素C從線粒體向胞質(zhì)釋放，啟動caspase級聯(lián)通路誘導(dǎo)凋亡發(fā)生(圖3B)。經(jīng)western blot檢測發(fā)現(xiàn)，施予AL后，去除線粒體的胞質(zhì)中細(xì)胞色素C蛋白表達(dá)顯著上升(P< 0. 05)。如圖3C，對caspase級聯(lián)通路中的關(guān)鍵蛋白cleaved PARP/caspase-3/caspase-9的檢測發(fā)現(xiàn)，AL均能上調(diào)以上三種蛋白的表達(dá)量，且呈劑量依賴性(圖3C)。

注：(A)Transwell小室實(shí)驗(yàn)觀察AL對C6細(xì)胞侵襲的影響(*P<0.05；**P<0.01)；(B)劃痕實(shí)驗(yàn)觀察AL對C6細(xì)胞遷移的影響(*P< 0.05；**P< 0.01；×100)；(C)AL對N-cadherin及E-cadherin蛋白表達(dá)的影響(*P< 0.05；**P< 0.01)。圖2　AL抑制C6細(xì)胞遷移和侵襲Note. (A) Effect of AL on C6 cell invasion in Transwell chamber experiment (*P< 0.05；**P< 0.01). (B) Effect of L on C6 cell migration in scratch test (*P< 0.05；**P< 0.01；×100). (C) Effect of AL on N-cadherin and E -cadherin protein expression (*P< 0.05；**P< 0.01).Fig.2　AL inhibits the migration and invasion of C6 cells

注：(A)流式細(xì)胞儀檢測AL對C6細(xì)胞凋亡情況的影響(*P< 0.05；**P< 0.01)；(B)熒光顯微鏡觀察AL對C6細(xì)胞膜電位變化的影響(×200)；(C)AL對Caspase級聯(lián)信號關(guān)鍵蛋白表達(dá)的影響(*P< 0.05；**P< 0.01)。圖3　AL誘導(dǎo)C6細(xì)胞的凋亡發(fā)生Note. (A) The effect of AL on apoptosis in C6 cells detected by flow cytometry (*P< 0.05；**P< 0.01. (B) The effect of AL on the changes of membrane potential of C6 cells by fluorescence microscopy, ×200. (C) The effect of AL on the expression of caspase cascade signaling.*P< 0.05；**P< 0.01.Fig.3　AL induces the apoptosis in C6 cells

3　討論

膠質(zhì)瘤因高侵襲性、抗凋亡、化療藥多耐性等特性，嚴(yán)重危害病人的生命健康，在臨床上治療效果欠佳的背景下，探求新的治療策略及多途徑治療機(jī)制的藥物已日益受到廣大學(xué)者的關(guān)注。中藥在抗腫瘤作用中歷來占有重要地位，天然化合物在腫瘤藥物研發(fā)中發(fā)揮著重要的作用，尤其是植物化合物與化學(xué)合成藥物相比，具有取材方便、價(jià)格低廉、毒副作用小的優(yōu)勢，尤其在抗耐藥性和減毒增效方面更具顯著優(yōu)勢，已受到國內(nèi)外學(xué)者的廣泛認(rèn)可，成為研發(fā)新型抗癌藥的重要來源。

土木香內(nèi)酯(AL)是從土木香的干燥根中提取出來的活性物質(zhì)，廣泛分布于歐洲、北美洲以及中國新疆等地區(qū)，其采集及制備簡便，價(jià)格低廉，在中、歐藥典中均有記載。AL是土木香的精油成分，具有抗炎、抗菌、抗腫瘤及保肝降糖等多種藥理活性。AL對其他系統(tǒng)腫瘤的抑制作用已經(jīng)陸續(xù)有相關(guān)報(bào)道，而對中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤作用的研究罕有報(bào)道。故本實(shí)驗(yàn)選用 C6腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞株作為研究對象，對AL在中樞神經(jīng)系統(tǒng)惡性腫瘤抑制作用的活性進(jìn)行闡述。

本實(shí)驗(yàn)首先通過細(xì)胞活力檢測證實(shí)了AL能顯著抑制C6細(xì)胞的增殖生長。隨之通過劃痕實(shí)驗(yàn)及Transwell小室實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)AL能抑制C6細(xì)胞的遷移侵襲。而腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞粘附性的改變是腫瘤侵襲與轉(zhuǎn)移的重要始動環(huán)節(jié)。鈣粘素(cadherins) 是一類結(jié)構(gòu)和功能相似的鈣依賴性單鏈跨膜糖蛋白。各類鈣粘素蛋白分子中, 以神經(jīng)-鈣粘素(N-cadherin) 和上皮-鈣粘素(E- cadherin) 與腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移關(guān)系最為密切[7]。研究發(fā)現(xiàn)N-cadherin 的過度表達(dá)和E- cadherin的表達(dá)下調(diào)在膠質(zhì)瘤的侵襲性生長及惡性進(jìn)展中發(fā)揮著重要作用[7-8]。我們的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)AL能顯著抑制N-cadherin蛋白的表達(dá)，而顯著上調(diào)E-cadherin蛋白的表達(dá)。因此我們推測AL可能通過調(diào)節(jié)cadherin蛋白的表達(dá)抑制C6細(xì)胞的遷移侵襲。

凋亡是一種細(xì)胞程序化死亡，腫瘤細(xì)胞的無限生長是細(xì)胞凋亡受抑制的結(jié)果[9]。本實(shí)驗(yàn)通過AV-PI雙染方法證實(shí)AL能顯著誘導(dǎo)C6細(xì)胞的凋亡發(fā)生。而凋亡的發(fā)生主要分為內(nèi)源性及外源性兩種途徑，其中內(nèi)源性途徑也稱為線粒體-細(xì)胞色素C(Cyto c)途徑[10-12]。本實(shí)驗(yàn)通過JC-1熒光探針發(fā)現(xiàn)AL能促使線粒體膜電位從高位向低位的轉(zhuǎn)變，可能致線粒體通透性發(fā)生改變；隨即通過蛋白印跡的方法發(fā)現(xiàn)去線粒體的胞質(zhì)中Cyto c蛋白顯著增加，從而證實(shí)Cyto c從線粒體向胞質(zhì)的釋放；進(jìn)一步通過蛋白印跡的方法檢測到天冬半胱氨酸蛋白水解酶(caspase)級聯(lián)通路中的關(guān)鍵蛋白(Cleaved PARP/caspase-3/caspase-9)均有顯著升高，最終證實(shí)了AL通過激活caspase級聯(lián)反應(yīng)誘導(dǎo)凋亡發(fā)生。

綜上所述，經(jīng)本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)AL能通過抑制遷移侵襲及誘導(dǎo)凋亡發(fā)生來發(fā)揮抗膠質(zhì)細(xì)胞瘤的作用，從而為AL在抗中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤方面的應(yīng)用提供了一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。