大鼠心肌缺血再灌注損傷模型的改進(jìn)與評判

張衛(wèi)強(qiáng)，王濤，張志明，雍文興，劉永琦，李娟，梁艷

(1. 甘肅中醫(yī)藥大學(xué)，蘭州　730000； 2. 甘肅中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，蘭州　730000)

急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)是危害人類健康的重大疾病，是全球的主要死亡原因之一。經(jīng)馬爾科夫模型預(yù)測，未來20年間中國將新增2100萬例急性冠脈事件，發(fā)生700萬例心源性死亡[1]。當(dāng)前以溶栓治療或急診經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療(percutaneous coronary intervention，PCI)為代表的方法，雖能開通閉塞血管，挽救瀕死心肌，但在減少急性心肌梗死面積的同時(shí)，由于冠狀動(dòng)脈的驟然開通與血流恢復(fù)引發(fā)心肌缺血再灌注損傷(myocardial ischemia-reperfusion injury，MI/RI)，誘發(fā)病死率依然居高不下。因此，模擬人類MI/RI模型并探索新的防治方法成為基礎(chǔ)研究迫切需要解決的課題。大鼠一方面在進(jìn)化關(guān)系上比較接近人類，另一方面便于飼養(yǎng)繁殖且造模成本低廉，從而成為制備MI/RI模型的首選。傳統(tǒng)制備大鼠心肌缺血再灌注損傷模型方法主要有兩種，即：使用人工輔助通氣的心臟原位結(jié)扎和不使用人工輔助通氣的胸腔外結(jié)扎[2]。本實(shí)驗(yàn)在前人原位結(jié)扎法的基礎(chǔ)上進(jìn)行了改進(jìn)，不但降低了手術(shù)難度，而且成功建立了MI/RI模型。

1　材料與方法

1.1　材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

7～8周齡清潔級成年Wistar大鼠36只，雌雄比為1∶1，體重230～260 g，購自甘肅中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心【SCXK(甘)2015-0002】，飼養(yǎng)于甘肅中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心屏障環(huán)境中【SYXK(甘)2015-0002】。飼養(yǎng)期間給予大鼠標(biāo)準(zhǔn)飼料及潔凈飲用水(均由甘肅中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)。飼養(yǎng)環(huán)境：晝夜各半交替，濕度恒定，溫度20～25℃。所有操作均符合實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理學(xué)要求(倫理審批號：IACUC2016-039)。將大鼠隨機(jī)分為3組：正常組(Normal組)；假手術(shù)組(Sham組)，僅穿線，不結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支(LAD)；缺血再灌注組(MI/RI組)，結(jié)扎LAD 30 min，再灌注120 min。

肝臟具有調(diào)節(jié)合成重要蛋白及調(diào)節(jié)內(nèi)分泌功能的作用,合成重要蛋白指患者在急性期蛋白合成大多數(shù)血漿蛋白,其不僅決定了血漿膠體的滲透壓等重要的物質(zhì),而且為重要載體的功能,可以和多種的藥物結(jié)合而影響藥物作用[6]。

1.1.2試劑與儀器

小動(dòng)物呼吸機(jī)HX-100E (成都泰盟科技有限公司)， Powerlab數(shù)據(jù)采集分析系統(tǒng)(埃德儀器國際貿(mào)易有限公司)，結(jié)扎材料及各種手術(shù)器械，如手術(shù)刀、止血鉗、持針器、小鑷子、眼科剪、縫合針，醫(yī)用縫合線等。水合氯醛、注射用青霉素鈉、無菌生理鹽水注射液、碘伏等。

1.2　方法

1.2.1MI/RI模型的建立

根據(jù)參考文獻(xiàn)[3]的方法進(jìn)行改進(jìn)，大鼠術(shù)前禁食、不禁水12 h，稱重標(biāo)記。10%的水合氯醛(0.3 mL/100 g) ip麻醉后，仰臥位固定于手術(shù)臺上，頸部、胸前手術(shù)野備皮，碘伏消毒，鋪無菌孔巾。連接Powerlab數(shù)據(jù)采集分析系統(tǒng)，記錄標(biāo)準(zhǔn)Ⅱ?qū)?lián)心電圖，有異常者剔除。切開頸部氣管接人工呼吸機(jī)進(jìn)行輔助呼吸(潮氣量5 mL/100 g，頻率60～80次/min,呼吸比為2∶1,予呼氣末持續(xù)正壓呼吸)。胸骨左側(cè)0.5 cm處以第3、4肋骨作為上下邊界縱行剪開皮膚約3 cm，用鑷子及手術(shù)刀鈍性分離皮下組織、胸大肌直至肋間肌，用彎止血鉗將皮膚和肌肉夾起固定于兩側(cè)，于心肌搏動(dòng)明顯處縱行剪開3、4肋骨，用撐開器撐開胸腔，用眼科鑷夾破心包膜，暴露心臟，在左心耳下緣與肺動(dòng)脈圓錐間找到左冠狀靜脈主干，LAD與之伴行，在棉簽的協(xié)助下擠出心臟，用眼科縫合線在左心耳下緣與肺動(dòng)脈圓錐間距主動(dòng)脈根部約2 mm處進(jìn)針，進(jìn)針寬度及深度均在2 mm左右，穿線后于左冠狀靜脈主干上置一自制小塑料管(管中間剪一小孔，方便固定)結(jié)扎。結(jié)扎成功后肉眼見左心室前壁變青紫或蒼白，搏動(dòng)減弱，心電圖呈示ST段抬高(≥0.25 mV)為心肌缺血標(biāo)志。結(jié)扎30 min后用剪刀將結(jié)扎線剪斷形成再灌注，心電圖顯示ST段逐漸下降50%左右。造模結(jié)束后，按層次依次縫合胸腔、肌肉、皮膚，再次碘伏消毒，術(shù)后腹腔注射少量青霉素注射液預(yù)防感染。

1.2.2外周血中心梗三項(xiàng)的含量測定

再灌注2 h后右心房取血4 mL，離心，取血清，以全自動(dòng)生化分析儀檢測天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、乳酸脫氫酶(LDH)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)的含量。

1.2.3心梗面積測定

抽血完畢后取出心臟，去除非心臟組織，用生理鹽水把殘血洗凈，用濾紙吸去水分后置于-20℃冷凍25 min。然后沿著垂直于心臟長軸將其切成2.0 mm厚的薄片，立即轉(zhuǎn)到預(yù)溫37℃的1% TTC磷酸鹽緩沖液中染15 min，肉眼可觀察到：梗死區(qū)心肌為白色，非缺血區(qū)為紅色，然后將切片置于4%多聚甲醛溶液固定24 h，拍照，通過計(jì)算機(jī)圖像分析軟件(Image-Pro Plus)計(jì)算梗死區(qū)面積(IA)占左心室面積(LV)百分比(IA/LV%)。

1.2.4心肌病理組織學(xué)檢查

每組取3只大鼠開胸切取心臟，生理鹽水漂洗，濾紙吸干，取結(jié)扎線以下心肌組織置于4%多聚甲醛溶液中進(jìn)行固定，酒精梯度脫水，石蠟包埋，切片，進(jìn)行蘇木素一伊紅(hematoxylin-eosin，HE)染色，光學(xué)顯微鏡下觀察心肌組織形態(tài)學(xué)變化。

1.3　統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2　結(jié)果

2.1　大鼠成活情況

采用LAD上墊一帶凹槽塑料管的方法，一方面方便結(jié)扎時(shí)把握力度和充分固定，另一方面方便再灌注時(shí)剪短縫線而不造成撕裂傷，成功地建立了大鼠缺血再灌注模型(如圖1)。Sham組、MI/RI組造模成功數(shù)分別為11只、11只。各組間大鼠成活率的比較差異無顯著性(P> 0.05)。

2.2　大鼠心電圖的表現(xiàn)

同Normal組和sham組比較，MI/RI組心電圖有明顯ST-T動(dòng)態(tài)改變，MI/RI組結(jié)扎后ST段顯著抬高伴或不伴有T波低平或倒置，再灌注后ST段逐漸回落50%左右伴T波高聳， 這是建立模型成功的標(biāo)志(如圖2-4)。

2.3　心肌酶含量變化(如表1)

2.4　心肌梗死面積

如圖所示，TTC染色將心肌非缺血區(qū)染成紅色，梗死區(qū)染成蒼白色。用IA/LV評價(jià)心肌梗死面積。本實(shí)驗(yàn)心肌梗死面積(IA/LV%): Sham組為(0.00±0.00)%；MI/RI組為(26.80±1.60)%。與Sham組比較，MI/RI組差異有顯著性(P< 0.05)(如圖5)。

圖1　大鼠在體心肌缺血再灌注損傷模型的手術(shù)方法及結(jié)扎后表現(xiàn)Fig.1　Surgical operation to generate the rat model of myocardial ischemia reperfusion injury and the view after ligation

注：A.正常心電圖；B.開胸穿線未結(jié)扎；C.LAD結(jié)扎后；D.再灌注。圖2　大鼠心電圖表現(xiàn)Note. A. Normal ECG. B. Open chest and putting thread without ligation. C. After ligation of the LAD. D. Reperfusion.Fig.2　ECG changes in the rats

注：A.正常波形；B.開胸穿線后ST段輕度抬高；C.LAD結(jié)扎后ST段顯著抬高(≥0.25 mV)；D.再灌注后ST段回落，T波高聳。圖3　大鼠心電圖分析Note. A. Normal waveform. B. Slight elevation of ST segment after thoracotomy. C. Significant elevation of ST segment after ligation of the LAD (≥0.25 mV). D. ST segment fall after reperfusion and a higher T wave.Fig.3　ECG analysis of the rats

注：A.正常波形；B.開胸穿線后ST段輕度抬高；C.LAD結(jié)扎后ST段顯著抬高；D.再灌注后ST段回落，高聳T波。圖4　大鼠心電圖動(dòng)態(tài)演變情況Note. A. Normal waveform. B. Slight elevation of ST segment after thoracotomy. C. Significant elevation of ST segment after ligation of LAD. D. ST segment falls after reperfusion, and a higher T wave.Fig.4　Dynamic evolution of ECG in the rats

組別Groups LDH(U/L)CK-MB(U/L)AST(U/L)正常組Normal group476±262 437±217 91±30 假手術(shù)組Sham group2421±1307*1059±595* 749±512*缺血再灌注組MI/RI group3021±1238**1887±449**Δ782±522*

注：與Normal組比較*P< 0.05,**P< 0.01；與Sham組比較ΔP< 0.01。

Note. Compared with the normal group,*P< 0.05,**P< 0.01; Compared with the Sham operation group,ΔP< 0.01.

2.5　心肌病理組織學(xué)檢查

Sham組：心肌細(xì)胞排列整齊，間質(zhì)無水腫，未見明顯心肌結(jié)構(gòu)破壞；MI/RI組：部分肌纖維溶解液化，心外膜下見帶狀梗死灶，廣泛炎性細(xì)胞浸潤(如圖6)。

圖5　TTC染色結(jié)果Fig.5　Appearance of the rat heart cut surfaces(TTC staining)

3　討論

急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)在歐美發(fā)達(dá)國家有“頭號殺手”之稱。在我國隨著人民生活水平的提高，AMI的發(fā)病率和死亡率逐年上升[1]。當(dāng)前通過溶栓、介入及搭橋術(shù)雖然能夠挽救瀕死的心肌細(xì)胞，改善心功能，但恢復(fù)血供后往往出現(xiàn)“再灌注損傷”，誘發(fā)病死率居高不下。由此MI/RI成為當(dāng)前醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)。目前國內(nèi)外基礎(chǔ)研究中模擬人類MI/RI模型應(yīng)用最廣泛的方法是結(jié)扎大鼠左冠狀動(dòng)脈前降支使其供應(yīng)區(qū)血流阻斷，造成心肌缺血。心肌因缺血、缺氧而發(fā)生代謝紊亂以致發(fā)生凝固性壞死。然而在大鼠MI/RI模型制造中所采用人工輔助呼吸的心臟原位結(jié)扎法存在諸多問題：如鄧宇珺等[4]認(rèn)為既往利用墊片法實(shí)施缺血再灌注實(shí)驗(yàn)時(shí)，結(jié)扎線有可能劃破墊片表面陷入墊片，加之實(shí)驗(yàn)過程中血液沾染墊片導(dǎo)致松解活結(jié)時(shí)出現(xiàn)松解障礙而影響再灌注的順利開始。成玲俐等[5]則認(rèn)為傳統(tǒng)方法在阻斷冠狀動(dòng)脈造成缺血后實(shí)現(xiàn)再通時(shí), 結(jié)扎線不易剪斷，常導(dǎo)致左心耳破裂，引起心臟撕脫傷，造成大出血；冠狀動(dòng)脈定位不一，會造成模型缺血損傷部位及損傷程度不一致等。我們在前人造模的基礎(chǔ)上，利用大鼠撐開器擴(kuò)大胸腔術(shù)野，然后在肺動(dòng)脈圓錐與左心耳之間下2 mm處在結(jié)扎線下墊一凹槽型塑料軟圓管，不但避免了墊片較軟且容易沾染血液的弊端，且可以利用凹槽形成的高度有效控制結(jié)扎的力度，防止結(jié)扎太緊或太松導(dǎo)致模型失敗，再灌注時(shí)，利用凹槽釋放的空間易于剪短結(jié)扎線而不造成牽拉，避免了結(jié)扎線不易剪斷的問題，很好地實(shí)現(xiàn)了再灌注。造模成功率達(dá)90%以上，較好滿足了實(shí)驗(yàn)需要。在模型鑒定過程中大鼠的心電圖顯示LAD在結(jié)扎后ST段顯著抬高伴或不伴有T波低平或倒置，再灌注后ST段逐漸回落50%左右并伴有T波高聳，符合目前大多數(shù)學(xué)者主張的缺血再灌注的心電圖表現(xiàn)形式，由此說明此改進(jìn)方法是成功的。另外，心肌酶是衡量大鼠心肌損傷的敏感性指標(biāo)。心肌細(xì)胞壞死時(shí)可引起細(xì)胞膜完整性破壞和心肌標(biāo)志酶的外漏,CK-MB具有心肌組織特異性而被認(rèn)為是診斷心肌壞死的“金標(biāo)準(zhǔn)”之一，再灌注后CK-MB 釋放增多與心肌組織微灌注不良有關(guān)；LDH 增加的程度可間接反映心肌細(xì)胞膜的損傷程度，對MI/RI具有診斷價(jià)值[6]；AST則主要分布在心肌, 在細(xì)胞受損時(shí)大量溢出。我們在再灌注后檢測了AST、LDH、CK-MB變化，與Normal組和Sham組比較，MI/RI組指標(biāo) CK-MB 變化最為顯著[(1887±449) vs (437±217) U/L、(1887±449) vs (1059±595)U/L]，差異有顯著性。與Normal組比較，MI/RI組LDH差異有顯著性[(3021±1238) vs (476±262) U/L]，由此可見MI/RI組心肌細(xì)胞損傷明顯。盡管有報(bào)道[4]認(rèn)為Sham組較Normal組心肌損傷標(biāo)準(zhǔn)物無差異，但我們發(fā)現(xiàn)，差異是存在的，由于LAD存在于心臟內(nèi)，穿線及結(jié)扎過程必然會對心肌造成機(jī)械損傷，造成心肌標(biāo)志酶的外漏。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物心肌梗死面積最常見的檢測方法是氯化三苯基四氮唑(TTC) 染色[7]。本實(shí)驗(yàn)用TTC染色顯示MI/RI組梗死面積明顯大于Sham組，說明血流再通可以加劇心肌損傷，另外我們從病理形態(tài)學(xué)上觀察到Sham組心肌細(xì)胞排列整齊，未見細(xì)胞結(jié)構(gòu)明顯破壞；而MI/RI組肌纖維溶解液化，心外膜下可見一條很明顯的帶狀梗死灶，說明血流再通后明顯加劇了心肌壞死程度和范圍。

近年來，天鎮(zhèn)縣針對流動(dòng)黨員數(shù)量多、流動(dòng)范圍廣、流動(dòng)地點(diǎn)不固定的實(shí)際，積極采取舉措，將流動(dòng)黨員服務(wù)管理落到實(shí)處，努力讓流動(dòng)黨員回歸組織懷抱、實(shí)現(xiàn)“流而有家”。

綜上所述，改進(jìn)的造模方法成功提高了造模的成功率，降低了手術(shù)難度，準(zhǔn)確地復(fù)制心肌MI/RI的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停瑸楹罄m(xù)開展MI/RI研究奠定良好的模型基礎(chǔ)。