不同腦發(fā)育時(shí)期大鼠認(rèn)知功能的比較

董黎明，呂靜薇，姜寧，陳善廣，劉新民,2,3*

(1. 中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥用植物研究所，北京　100193； 2. 中國航天員科研訓(xùn)練中心人因工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京　100094； 3. 湖南中醫(yī)藥大學(xué)，長沙　410208)

大鼠神經(jīng)元的發(fā)育不僅在胚胎期，在出生后以及整個(gè)生命過程中都存在[1-2]。因此，大鼠腦發(fā)育老化程度與生長發(fā)育階段有關(guān)，處于不同腦發(fā)育階段的大鼠，其認(rèn)知功能可能存在差異。對于大鼠發(fā)育年齡段的劃分有不同的文獻(xiàn)報(bào)道，從腦功能發(fā)育的角度，一般可將0～2個(gè)月齡劃分為發(fā)育早期(幼年期)大鼠，將2～12個(gè)月齡稱為青壯年期(成年期)大鼠，12個(gè)月齡以后為衰退期(老年期)大鼠[3-4]。

研究表明，大鼠進(jìn)入老年期的學(xué)習(xí)記憶能力下降已成為眾所周知的事實(shí)。王暖等[5]發(fā)現(xiàn)24月齡的老年大鼠在Y-型電迷宮中，學(xué)習(xí)記憶能力顯著性降低，具體表現(xiàn)為學(xué)習(xí)嘗試次數(shù)增加、躲避電擊的正確次數(shù)顯著性減少。郭德玉等[6]使用幼鼠、青壯年鼠和老年鼠進(jìn)行水迷宮和曠場分析法，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示青壯年大鼠學(xué)習(xí)記憶能力及對新異環(huán)境的適應(yīng)性均強(qiáng)于幼年及老年大鼠。然而，腦發(fā)育過程中的幼年期、青年期與成年期大鼠的興趣、注意力、辨識決策、執(zhí)行操作等高級認(rèn)知功能是否存在差異，卻鮮有報(bào)道。

認(rèn)知是機(jī)體認(rèn)識和獲取信息、知識的智能加工過程，是成功完成活動最重要的心理?xiàng)l件，具體包括知覺、注意、學(xué)習(xí)記憶、思維、決策、興趣、執(zhí)行能力等[7-8]。在腦機(jī)制研究中，獎勵(lì)性操作條件反射是一種較為高級的條件反射活動，可用于評價(jià)興趣、注意力、學(xué)習(xí)記憶、決策能力、執(zhí)行能力等多種認(rèn)知功能研究[9-11]。因此，本研究采用了1月齡、2月齡和8月齡的大鼠進(jìn)行獎勵(lì)性操作條件反射，評價(jià)不同腦發(fā)育階段大鼠的探索興趣、執(zhí)行操作和辨識能力等認(rèn)知功能的影響。同時(shí)，采用經(jīng)典的Morris水迷宮考察空間學(xué)習(xí)記憶能力的差異。

1　材料與方法

1.1　材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動物

1月齡、2月齡和8月齡的SPF級雄性Wistar大鼠各8只，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物科技有限公司【SCXK(京)2012-0001】。實(shí)驗(yàn)室保持安靜，溫度保持在23～25℃，12 h 照明/12 h 黑暗環(huán)境(8:30-20:30 亮燈)。動物自購入后飼養(yǎng)于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所的屏障環(huán)境【SYXK(京)2013-0023】，先進(jìn)行5 d的適應(yīng)性飼養(yǎng)，期間給予標(biāo)準(zhǔn)飼料及純凈水本動物實(shí)驗(yàn)遵守國際實(shí)驗(yàn)動物倫理學(xué)要求。

1.1.2實(shí)驗(yàn)儀器

獎勵(lì)性操作式條件反射檢測分析處理系統(tǒng)和Morris水迷宮系統(tǒng)，均由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所與中國航天員科研訓(xùn)練中心聯(lián)合研制。獎勵(lì)性操作式條件反射檢測分析處理系統(tǒng)的測試箱體由PVC板材制成(30 cm× 30 cm× 55 cm)，箱體頂部安裝有攝像裝置，可以實(shí)時(shí)監(jiān)控動物在測試箱內(nèi)暗環(huán)境下的行為活動。計(jì)算機(jī)分析處理系統(tǒng)能夠向箱體發(fā)送信號指令，并自動分析處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。Morris水迷宮系統(tǒng)的圓形水池是由不銹鋼制成，水池直徑130 cm，高60 cm，水溫(25±1)℃，計(jì)算機(jī)分析處理系統(tǒng)能夠監(jiān)控動物活動并自動分析處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1.2　方法

1.2.1獎勵(lì)性操作條件反射[12]

(1)飲食限制與雙瓶喂養(yǎng)：連續(xù)限制動物飲食10 d，每天給予每只動物14～17 g，使動物體重達(dá)到正常飼養(yǎng)動物體重的80%～85%[13,14]。同時(shí)采用雙瓶喂養(yǎng)方式，每天給予每只動物 30 mL 飲用純水和 30 mL 8%蔗糖水。飲食限制和雙瓶喂養(yǎng)持續(xù)到實(shí)驗(yàn)結(jié)束。(2)獎賞條件反射：進(jìn)行連續(xù) 7 d的獎賞條件反射，藍(lán)色信號燈作為刺激信號，周期性的亮燈10 s，亮燈間隔為 30 s，每天訓(xùn)練時(shí)間為20 min。當(dāng)藍(lán)色信號燈亮?xí)r，獎賞裝置自動給予一滴20%蔗糖水，作為獎賞物質(zhì)；進(jìn)入間歇期后沒有獎賞物質(zhì)的泵出。(3)操作條件反射：進(jìn)行4 d的操作條件反射訓(xùn)練，踏板保持伸出狀態(tài)。大鼠完成一次踏板操作后，藍(lán)色信號燈亮燈 10 s，同時(shí)給予一滴獎賞物質(zhì)，每天訓(xùn)練時(shí)間 30 min或在期間連續(xù)踏板50次即完成實(shí)驗(yàn)過程。(4)視覺信號辨識：進(jìn)行4 d的視覺信號辨識訓(xùn)練，選定藍(lán)色為正確信號燈，紅色為錯(cuò)誤信號燈；雙色燈交替亮燈，亮燈時(shí)間為 120 s，實(shí)驗(yàn)時(shí)長 28 min。藍(lán)色信號燈亮，動物踩踏板時(shí)可獲得一滴獎賞物質(zhì)，其他操作均為錯(cuò)誤操作，無獎賞物質(zhì)。

1.2.2Morris水迷宮[15]

按東西南北將水池劃分為 4 象限 (NE，SE，SW，NW)，向池中加入黑色墨汁，以保證目標(biāo)準(zhǔn)確識別。(1)定位航行實(shí)驗(yàn)：將安全平臺固定在NE中心，水面下1.5 cm。每只大鼠每天訓(xùn)練2次，每次選擇不同入水點(diǎn)將大鼠面向池壁放入水中，連續(xù)訓(xùn)練5 d。設(shè)置檢測時(shí)間為 60 s 后，若大鼠在期間找到平臺則尋臺成功，記錄其潛伏期；若大鼠在期間未找到平臺，結(jié)束此次訓(xùn)練并記錄潛伏期為 60 s，將大鼠引至平臺并停留 10 s。(2)空間探索實(shí)驗(yàn)：第6天撤去平臺，從SE象限入水，檢測其在 90 s 內(nèi)穿臺次數(shù)、目標(biāo)象限游程比和時(shí)間比等指標(biāo)。

1.3　數(shù)據(jù)分析

2　結(jié)果

2.1　不同腦發(fā)育階段大鼠的探索興趣比較

如圖1所示，在獎賞條件反射訓(xùn)練階段，隨著訓(xùn)練天數(shù)的增加，三組大鼠的正確鼻觸次數(shù)和鼻觸總次數(shù)均呈現(xiàn)增加趨勢，錯(cuò)誤鼻觸次數(shù)變化不明顯。1月齡和2月齡大鼠的探索興趣無明顯差異。1月齡大鼠的正確鼻觸次數(shù)、錯(cuò)誤鼻觸次數(shù)、鼻觸總次數(shù)均顯著多于8月齡大鼠(P< 0.01)，表現(xiàn)出更強(qiáng)的探索興趣。三組大鼠的鼻觸正確率均隨著訓(xùn)練天數(shù)的增加而增加，但組間比較未出現(xiàn)顯著性差異。經(jīng)過7 d的訓(xùn)練后，不同月齡的大鼠均能成功建立獎賞條件反射。

注：與1月齡大鼠比較，*P< 0.05，**P< 0.01差異有顯著性。圖1　不同腦發(fā)育階段大鼠的探索興趣的比較Note. Compared with the 1-month-old rats, *P< 0.05, **P< 0.01.Fig.1　Comparison of exploration interest in the rats at different brain developmental stages

2.2　不同腦發(fā)育階段大鼠的執(zhí)行操作能力比較

由圖2可知，在操作條件反射訓(xùn)練階段，1月齡和2月齡大鼠的執(zhí)行操作能力無明顯差異。不同月齡大鼠鼻觸總次數(shù)逐漸減少，并且1月齡大鼠的鼻觸總次數(shù)顯著高于8月齡大鼠(P< 0.05或P< 0.01)。三組大鼠的踏板總次數(shù)和踏板準(zhǔn)確率均隨訓(xùn)練時(shí)間的延長呈現(xiàn)增加趨勢，1月齡大鼠踏板總次數(shù)顯著多于8月齡大鼠(P< 0.05或P< 0.01)，1月齡大鼠的踏板準(zhǔn)確率在Day 2和Day 3顯著大于8月齡大鼠(P< 0.05)，踏板準(zhǔn)確率即鼻觸總次數(shù)與踏板總次數(shù)的比值，能夠體現(xiàn)大鼠執(zhí)行操作能力差異。大鼠首次做出踏板操作的時(shí)間即操作潛伏期，1月齡大鼠的操作潛伏期顯著低于8月齡大鼠(P< 0.05)，表示1月齡大鼠已成功建立信號燈-踏板操作-獎賞之間的聯(lián)系，并且執(zhí)行操作反應(yīng)能力更加敏捷。以上結(jié)果表明，1月齡和2月齡大鼠的執(zhí)行操作能力、反應(yīng)速率和準(zhǔn)確率均優(yōu)于8月齡大鼠。

注：與1月齡大鼠比較，*P< 0.05，**P< 0.01差異有顯著性。圖2　不同腦發(fā)育階段大鼠的執(zhí)行操作能力比較Note. Compared with the 1-month-old rats, *P< 0.05, **P< 0.01.Fig.2　Comparison of executive ability of the rats at different brain developmental stages

注：與1月齡大鼠比較，*P< 0.05，**P< 0.01差異有顯著性。圖3　不同腦發(fā)育階段大鼠的視覺信號辨識能力比較Note. Compared with the 1-month-old rats, *P< 0.05, **P< 0.01.Fig.3　Comparison of visual recognition ability of the rats at different brain developmental stages

2.3　不同腦發(fā)育階段大鼠的視覺信號辨識能力比較

視覺信號辨識要求大鼠對視覺刺激信號進(jìn)行聯(lián)想記憶，準(zhǔn)確判斷正確和錯(cuò)誤信號燈提示，然后進(jìn)行相應(yīng)的操作行為以獲得糖水獎勵(lì)，屬于難度較大的辨識和學(xué)習(xí)記憶模式[16]。大鼠對視覺信號辨識和記憶的準(zhǔn)確程度，可以通過視覺信號辨識指數(shù)表示，視覺信號辨識指數(shù)=(正確踏板次數(shù) - 錯(cuò)誤踏板次數(shù))/踏板總次數(shù)。圖3顯示在視覺信號辨識階段，1月齡和2月齡大鼠的視覺信號辨識能力無明顯差異。8月齡大鼠的獎賞次數(shù)、踏板總次數(shù)和視覺信號辨識指數(shù)均顯著低于1月齡大鼠(P< 0.05或P< 0.01)。

2.4　不同腦發(fā)育階段大鼠的空間學(xué)習(xí)能力比較

圖4顯示大鼠在Morris水迷宮中的空間學(xué)習(xí)能力。經(jīng)過連續(xù)5 d的加強(qiáng)學(xué)習(xí)，大鼠逐漸縮短了找到安全平臺的總游程和時(shí)間。1月齡和2月齡大鼠的空間學(xué)習(xí)能力無明顯差異。8月齡大鼠的平均速度顯著大于1月齡大鼠，表明其具有更強(qiáng)的游泳運(yùn)動能力(P< 0.05)；但是總游程和尋臺潛伏期顯著大于1月齡大鼠(P< 0.05或P< 0.01)，即對安全平臺空間位置的記憶不夠準(zhǔn)確，尋找過程更具有盲目性，需要游更長的游程和時(shí)間找到安全平臺。

注：與1月齡大鼠比較，*P< 0.05，**P< 0.01差異有顯著性。圖4　不同腦發(fā)育階段大鼠的空間學(xué)習(xí)能力比較Note. Compared with 1-month-old rats, *P< 0.05, **P< 0.01.Fig.4　Comparison of spatial learning ability of the rats at different brain developmental stages

注：與1月齡大鼠比較，**P < 0.01差異有顯著性。a.1月齡組；b.2月齡組；c.8月齡組。圖5　不同腦發(fā)育階段大鼠的空間記憶能力和運(yùn)動軌跡比較Note. Compared with the 1-month-old rats, **P< 0.01. a. 1-month-old group; b. 2-month-old group; c. 8-month-old group.Fig.5　Comparison of spatial memory ability and movement tracks of the rats at different brain developmental stages

2.5　不同腦發(fā)育階段大鼠的空間記憶能力比較

在空間探索階段，撤去放置于水下的隱蔽安全平臺，考察大鼠的空間記憶能力。由圖5可知，1月齡和2月齡大鼠的空間記憶能力無明顯差異。與1月齡大鼠比較，8月齡大鼠的穿臺次數(shù)呈現(xiàn)減少趨勢，但未出現(xiàn)顯著性差異；8月齡大鼠在目標(biāo)象限的游程比和時(shí)間比均顯著性減少(P< 0.01)。此外，運(yùn)動軌跡圖顯示，1月齡和2月齡大鼠的運(yùn)動軌跡主要集中在目標(biāo)象限區(qū)域，而8月齡大鼠的運(yùn)動軌跡雜亂，表明對安全平臺的空間位置記憶不準(zhǔn)確。

3　討論

獎勵(lì)性操作條件反射是在經(jīng)典條件反射的信號-條件性刺激之間加入操作行為，動物通過隨機(jī)發(fā)現(xiàn)、主動探索、獲得經(jīng)驗(yàn)、強(qiáng)化記憶最終形成條件反射，屬于聯(lián)想式學(xué)習(xí)記憶范疇[12,17-18]。相對于穿梭、跳臺、避暗等懲罰性認(rèn)知功能評價(jià)方法，獎勵(lì)性操作條件反射避免了對動物的傷害性刺激，在獎勵(lì)性刺激與條件反射之間形成良性循環(huán)，易化條件反射的形成，也更加符合動物福利[19-20]。大鼠的鼻觸次數(shù)能夠反映出動物對獎賞物質(zhì)的興趣程度以及對刺激信號的反應(yīng)能力，而探索興趣和反應(yīng)能力也是動物進(jìn)行踏板操作的基礎(chǔ)[16]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在獎賞條件反射階段，與1月齡和2月齡大鼠比較，8月齡大鼠的正確鼻觸次數(shù)、鼻觸總次數(shù)等指標(biāo)顯著性減小，鼻觸正確率未發(fā)生明顯變化，表明8月齡大鼠對獎賞物質(zhì)的探索興趣降低，但不影響?yīng)勝p條件反射形成能力。在操作條件反射過程中，8月齡大鼠的踏板操作次數(shù)、踏板正確率等指標(biāo)顯著性降低，踏板操作潛伏期延長，表明該組大鼠操作能力和準(zhǔn)確率降低。在視覺信號辨識階段，8月齡大鼠的視覺信號辨識能力弱于1月齡和2月齡大鼠，獎賞獲得次數(shù)和辨識指數(shù)顯著性減小，表明視覺信號辨識相關(guān)的學(xué)習(xí)記憶功能出現(xiàn)減退。

Morris水迷宮是英國心理學(xué)家Morris于20世紀(jì)80年代初提出并應(yīng)用于認(rèn)知功能研究的一種實(shí)驗(yàn)手段[21-22]。該實(shí)驗(yàn)是利用嚙齒類動物天生厭惡水環(huán)境，學(xué)習(xí)尋找固定位置的隱蔽安全平臺，從而形成穩(wěn)定的空間記憶?？臻g記憶是動物對周圍環(huán)境中空間信息進(jìn)行加工而形成，是一種以“異我”為參照物的空間參考記憶(reference memory)，其儲存機(jī)制主要涉及海馬和大腦皮質(zhì)等有關(guān)腦區(qū)[23-24]。在本實(shí)驗(yàn)中，8月齡大鼠的平均速度大于1月齡和2月齡大鼠，具有更強(qiáng)的游泳運(yùn)動能力。但是其到達(dá)安全平臺的總游程和尋臺潛伏期均顯著大于1月齡和2月齡大鼠，表明該組大鼠的空間學(xué)習(xí)能力減退。撤去安全平臺后，8月齡大鼠穿過平臺位置的穿臺次數(shù)、目標(biāo)象限的游程比和時(shí)間比均降低，表明其對安全平臺的空間位置記憶不準(zhǔn)確。

綜上所述，與8月齡成年期大鼠相比，幼年期和青年期大鼠具有更強(qiáng)的探索興趣、執(zhí)行操作和視覺信號辨識能力，以及空間學(xué)習(xí)記憶能力。雖然8月齡成年期大鼠的運(yùn)動能力很強(qiáng)，但是認(rèn)知功能出現(xiàn)了一定程度的減退。大鼠的認(rèn)知功能隨著不同腦發(fā)育階段而發(fā)生變化，在進(jìn)入老年期之前的成年期即呈現(xiàn)認(rèn)知功能下降趨勢，該實(shí)驗(yàn)為開展腦的發(fā)育老化過程及嚙齒類動物高級認(rèn)知功能研究提供了行為學(xué)實(shí)驗(yàn)的參考依據(jù)。