亞洲象糞便中產(chǎn)酸克雷伯菌分離鑒定及致病性研究

周 浪 曾邦權(quán) 李 娟 王 研 李維芬 代飛燕*

(1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，昆明，650201;2.云南省動物疫病預(yù)防控制中心，昆明，650201;3.云南省昆明市瀕危動植物收容拯救中心，昆明，651700)

亞洲象(Elephas maximus)屬于國家Ⅰ級重點保護(hù)野生動物，被國際自然和自然資源保護(hù)聯(lián)盟(IUCN)列為瀕危物種［1］。所以大象的保護(hù)和疾病監(jiān)測就顯得尤為重要，至今有文獻(xiàn)記載的大象腸道菌群的研究并不多見，可以為大象疾病診斷提供的依據(jù)遠(yuǎn)遠(yuǎn)不足，本實驗通過對該發(fā)病大象糞便病菌的分離和鑒定及對糞便中產(chǎn)酸克雷伯菌的致病性探究，初步了解大象消化道微生物菌群的結(jié)構(gòu)，以及其與大象健康的關(guān)系?？蔀槠浼膊≡\斷提供科學(xué)依據(jù)，更是為以后的大象疾病檢測增加素材和提供一定的臨床指導(dǎo)。

克雷伯菌屬(Klebsiella)有5種，分別為產(chǎn)酸克雷伯菌(K.oxytoca)、肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)、植生克雷伯菌(K.planticola)、土生克雷伯菌(K.terrigena)和變形克雷伯菌(K.preteus)，后兩個種屬對人一般不致?。?］，產(chǎn)酸克雷伯菌是抗生素相關(guān)性出血性結(jié)腸炎的一種病原體。產(chǎn)酸克雷伯菌屬于腸桿菌科(Enterobacteriaceae)克雷伯菌屬，生物學(xué)特征不同于其他克雷伯氏菌種，是重要的條件致病菌，在植物和水生環(huán)境中都能檢出，也存在于人和動物的腸道，導(dǎo)致人畜共患?。?］。

1 材料

1.1 試驗材料

本試驗實驗動物:亞洲象，43歲，雌性。所用病料為無菌采取的該患病大象新鮮糞便樣品1份，病料來源于云南省昆明市某一公園。

1.2 主要試劑與設(shè)備

麥康凱培養(yǎng)基、普通肉湯培養(yǎng)基、DNA提取試劑盒、核酸染色劑、電熱恒溫培養(yǎng)、超凈工作臺、PCR儀、電泳儀、光學(xué)顯微鏡。

1.3 實驗動物

昆明SPF小白鼠，6周齡，體重20～25 g，購于云南省昆明醫(yī)科大學(xué)實驗動物培育中心。

2 方法

2.1 細(xì)菌的接種培養(yǎng)

細(xì)菌普通培養(yǎng)后，挑取不同形態(tài)或具有溶血環(huán)的菌落分別接種于選擇、鑒別培養(yǎng)基上，進(jìn)行選擇鑒別培養(yǎng)，然后再挑取這些不同形態(tài)特征或具有溶血環(huán)的菌落分別混勻于裝有2～3 mL肉湯培養(yǎng)液的4 mL離心管中，放入37℃恒溫?fù)u床培養(yǎng)箱中進(jìn)行細(xì)菌的擴(kuò)增培養(yǎng)［4］。該實驗共挑選了5種不同形態(tài)特征的菌落進(jìn)行下一步實驗，編號為①②③④⑤。

2.2 革蘭氏染色鏡檢

涂片、干燥、初染、煤染、脫色、復(fù)染、水洗。把制作好的載玻片放在顯微鏡上，觀察其菌落形態(tài)及菌體的顏色。

2.3 生化試驗

分別挑取菌落形態(tài)與大腸桿菌(Escherichia coli)和產(chǎn)酸克雷伯菌相似的細(xì)菌，根據(jù)查閱相關(guān)材料獲得大腸桿菌和產(chǎn)酸克雷伯菌常規(guī)生化試驗相符的生化試驗微量發(fā)酵管，將其分別接種于其中。試驗結(jié)果見表1。

表1 革蘭氏陰性桿菌生化試驗結(jié)果Tab.1 Gram－negative bacilli biochemical test results

表2 革蘭氏陽性桿菌生化試驗結(jié)果Tab.2 Gram-positive bacilli biochemical test results

2.4 PCR擴(kuò)增與測序

待測細(xì)菌DNA的提取;細(xì)菌DNA擴(kuò)增體系配制;細(xì)菌檢測PCR反應(yīng);凝膠電泳觀察(PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳);測序鑒定;測序結(jié)果在NCBI上進(jìn)行序列比對分析，進(jìn)一步確定所分離到細(xì)菌的種屬。

2.5 藥敏試驗

將分離純化得到的菌株進(jìn)行藥敏試驗，用移液槍吸取0.2 mL的菌液于普通瓊脂培養(yǎng)基上，用無菌的三角玻璃棒均勻涂布接種，接種平板后，根據(jù)鏡檢結(jié)果選擇針對革蘭氏陰性菌窄譜、藥物作用性強(qiáng)、不良反應(yīng)少且臨床上常用的10種藥片進(jìn)行貼片，貼上紙片15 min內(nèi)，須把平板放在37℃電熱恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)18～24 h，觀察結(jié)果，并用直尺測量其直徑［5－6］，結(jié)果見表 3。

2.6 動物回歸實驗

取純化后的產(chǎn)酸克雷伯菌菌液吸取0.5 mL至裝有5 mL營養(yǎng)肉湯的錐形瓶中，置于37℃的搖床培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10～12 h后，取培養(yǎng)后的菌液0.1 mL到裝有0.9 mL的無菌生理鹽水的試管中充分混勻，進(jìn)行10倍稀釋，再從稀釋后的菌液中去0.1 mL到另一管裝有0.9 mL的生理鹽水中，混勻，以此類推，直至稀釋到1∶1013，共稀釋13個梯度，然后從最后2個梯度的試管中分別吸取0.1 mL到事先高壓好的普通營養(yǎng)瓊脂平板上，每個梯度涂3個平板，用無菌三角棒進(jìn)行全面涂板接種，正向放置10～15 min后倒置于37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)18 h后進(jìn)行平板計數(shù)，計數(shù)時求其平均數(shù)。計算公式為:每毫升中菌落形成單位(cfu)=同一稀釋度3次重復(fù)的平均菌落數(shù)×稀釋倍數(shù)×10(注意:濃度從大到小所乘倍數(shù)依次減小10倍)［7］。然后根據(jù)細(xì)菌計數(shù)結(jié)果將其稀釋到2.5×1012cfu/mL進(jìn)行致病性試驗，以0.5 mL/只的劑量經(jīng)腹腔注射給5只小鼠，作為實驗組，另外設(shè)5只作為對照組，對照組每只注射0.5 mL的生理鹽水，觀察小鼠情況。將稀釋到2.5×1015cfu/mL、2.5×1014cfu/mL、2.5×1013cfu/mL的菌液進(jìn)行細(xì)菌毒力試驗，取36只小白鼠隨機(jī)分為6個小組，分為5個實驗組和1個對照組，每組6只小鼠，實驗組每只小鼠注射0.5 mL的稀釋菌液，對照組每只注射0.5 mL的生理鹽水，進(jìn)行腹腔注射，試驗組和對照組分別隔離飼養(yǎng)，觀察一周內(nèi)小鼠的情況。

2.7 病理檢查

對實驗組死亡小鼠進(jìn)行解剖，在無菌的條件下采取病變嚴(yán)重部位于甲醛溶液中，送至云南省第一人民醫(yī)院進(jìn)行病理切片的制作，然后對病理結(jié)果進(jìn)行總結(jié)分析。

2.8 目的菌的回收與鑒定

將死亡的小鼠進(jìn)行解剖，取病變較為明顯的腸道和肝臟組織進(jìn)行實驗室細(xì)菌分離鑒定培養(yǎng)和測序鑒定。

2.9 治療方案

根據(jù)臨床癥狀以及綜合藥敏結(jié)果建立的治療方案如下:

① 頭孢賽肟鈉1 g/支 ×20;5%葡萄糖鹽水500 mL×6瓶。

②10%葡萄糖 500 mL/瓶 ×6;10%NaHCO310 mL/支 ×15。

③5%葡萄糖500 mL/瓶 ×4;肌苷5 mL/支 ×2盒;輔酶A(100單位)×2盒;

ATP(三磷酸腺苷)2 mL/支×2盒 。

④5%葡萄糖500 mL/瓶×3;維生素C 2 mL/支×5盒。

⑤ 痛立止10 mL/支×50支，共500 mL，分點肌肉注射。

3 結(jié)果

3.1 細(xì)菌接種培養(yǎng)結(jié)果

37℃培養(yǎng)18～24 h在普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上得到2種菌落:一種在普通營養(yǎng)瓊脂上形成圓形突起、光滑、濕潤、半透明、灰白色、邊緣整齊的，中等偏大的菌落，直徑在2～3 mm之間;在伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基上形成紫黑色帶金屬光澤的菌落;在SS培養(yǎng)基上和在麥康凱培養(yǎng)基上均形成紅色菌落，但在SS培養(yǎng)基上生長比較貧瘠;在血平板上形成溶血環(huán)。另一種在普通營養(yǎng)瓊脂上形成較大、凸起、灰白色黏液型的菌落，菌落大而厚實、光亮，相鄰菌落容易發(fā)生融合，用接種針蘸取時可挑出長絲狀細(xì)絲;在伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基上形成較大、黏稠、紅色、易融合成一片的菌落;在麥康凱培養(yǎng)基上形成粉紅色黏稠菌落;在SS瓊脂培養(yǎng)基上形成紅色菌落;在血平板上形成灰白色、大而黏、光亮形成黏絲菌落(鏡檢圖片見附件)。

3.2 革蘭氏染色鏡檢結(jié)果

鏡檢觀察到2類細(xì)菌形態(tài):一類為呈革蘭氏陰性無芽孢的直桿菌，兩端鈍圓，多散在，少成對(①、②管);另一類也為革蘭氏陰性菌，但呈單個或成對，是具有莢膜無芽抱的粗短桿菌(③、④、⑤管)。細(xì)菌鏡檢圖片見附件。

3.3 生化試驗結(jié)果

能夠分解葡萄糖、乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣;吲哚(I)和甲基紅(M)試驗都為陽性、VP(v)及枸椽酸鹽利用(C)都為陰性;氧化酶試驗為陰性;不分解甘露醇。理化特性參照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》［8］，發(fā)現(xiàn)分離到的菌種與大腸桿菌常規(guī)生化反應(yīng)相符。

分解葡萄糖，產(chǎn)酸產(chǎn)氣;靛基質(zhì)反應(yīng)陽性;甲基紅陰性;利用枸椽酸鹽和丙二酸鹽;賴氨酸反應(yīng)陽性;吲哚反應(yīng)陽性;鳥氨酸脫氫酶反應(yīng)陰性。理化特性參照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》［8］，發(fā)現(xiàn)分離到的菌種與產(chǎn)酸克雷伯菌常規(guī)生化反應(yīng)相符。

3.4 PCR擴(kuò)增與測序結(jié)果

采用設(shè)計的引物，以細(xì)菌核酸DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增試驗，結(jié)果擴(kuò)增出與目的片段大小一致的DNA片段(圖1)，獲得核酸片段大小為1500 bp左右。送擴(kuò)增的菌液至生物公司進(jìn)行測序，在NCBI上比對后，發(fā)現(xiàn)所獲得3種細(xì)菌，分別與大腸桿菌O83∶H1、大腸桿菌 O104∶H4和產(chǎn)酸克雷伯菌具有99%的同源性，可判定所測菌株①為大腸桿菌O83:H1、②為大腸桿菌O104:H4和③、④、⑤為產(chǎn)酸克雷伯菌(堿基序列見附件)。

圖1 細(xì)菌PCR擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂凝膠電泳Fig.1 Bacterial PCR products of agar gel electrophoresis

3.5 藥敏試驗結(jié)果

表3 細(xì)菌藥敏試驗結(jié)果Tab.3 Bacterial susceptibility test results

由表3可知:該細(xì)菌對氧氟沙星、頭孢曲松、頭孢賽肟鈉 、環(huán)丙沙星、卡那霉素、磺胺異亞唑等極度敏感;對阿莫西林、多粘菌素B等高度敏感;對萬古霉素等中度敏感;對甲氧嘧啶耐藥。

3.6 動物回歸實驗

3.6.1 細(xì)菌計數(shù)結(jié)果

經(jīng)18 h、37℃恒溫培養(yǎng)后，第12個細(xì)菌稀釋梯度所涂3個板長出的細(xì)菌菌落平均個數(shù)為300個左右，第13個細(xì)菌稀釋梯度所涂3個板所出的細(xì)菌菌落平均個數(shù)為200個左右，因此這2個梯度的菌液濃度為2.0×103cfu/mL和3.0×103cfu/mL，可推斷該菌原液濃度大約在2.0×1016～3.0×1016cfu/mL，所以將各個梯度的濃度定為2.5×1016cfu/mL、2.5×1015cfu/mL、2.5×1014cfu/mL……2.5×104cfu/mL、2.5×103cfu/mL、2.5×102cfu/mL。

3.6.2 動物回歸試驗結(jié)果

根據(jù)細(xì)胞計數(shù)和查閱文獻(xiàn)，選擇用3個梯度濃度的菌液分別注射給3個實驗組的小鼠，每組的cfu值分別為:第一組:2.5×1015cfu/mL，第二組:2.5×1014cfu/mL，第三組:2.5×1013cfu/mL。實驗小鼠在不同時間發(fā)生發(fā)病和死亡現(xiàn)象，第一組接種菌液后12 h開始發(fā)病，出現(xiàn)精神萎靡，眼部分泌物增多;14 h出現(xiàn)失明現(xiàn)象;16 h出現(xiàn)呼吸急促;24 h出現(xiàn)2只死亡;36 h出現(xiàn)第3只死亡;2 d后試驗組6只小鼠全部死亡。第二組和第三組小鼠接種后24 h開始出現(xiàn)癥狀，出現(xiàn)的臨床癥狀比第一組輕，1 d后出現(xiàn)死亡，4 d后實驗小組全部死亡。將死亡的小鼠進(jìn)行解剖，發(fā)現(xiàn)小鼠腹腔有黏稠的液體;胃壁增厚、腫大;部分腸管擴(kuò)張，內(nèi)有大量黃色黏液;肝臟部分壞死;脾臟出血;心臟肺臟出血。根據(jù)解剖癥狀，采取了小鼠的腸道、肝臟肺臟進(jìn)行了鑒別培養(yǎng)和測序鑒定，結(jié)果是所檢測樣品全都為產(chǎn)酸克雷伯菌(解剖圖片見附件)。

3.6.3 毒力性試驗結(jié)果

每組小鼠在注射0.5 mL不同梯度菌液后，不同梯度菌液注射的小鼠出現(xiàn)在不同的時間發(fā)病或死亡現(xiàn)象。根據(jù)各組小鼠死亡情況，計算出最小致死量(MLD)，依照寇氏改良法計算公式:LD50=log－1［Xm－i(Pm－0.5)］(Xm代表最大劑量的對數(shù);i代表組距，即相鄰2個組對數(shù)差;Pm代表各組死亡率之和)計算出半數(shù)致死量(LD50)［10］結(jié)果表明。

表4 感染克雷伯菌小鼠的死亡情況Tab.4 Deaths of infected Klebsiella mice

表5 致死量測定結(jié)果Tab.5 Lethality measurement results

3.7 病理檢查結(jié)果

圖2 腸壁(100×)Fig.2 Bowel wall(100×)

圖3 肺部(100×)Fig.3 Pulmonary(100×)

肺部(200×)Pulmonary(200×)

圖4 肝臟(100×)Fig.4 Liver(100×)

肝臟(200×)Liver(200×)

圖5 心臟(200×)Fig.5 Heart(200×)

心臟(400×)Heart(400×)

由以上組織切片結(jié)果可知:小鼠主要病變部位變化為腸壁部分黏膜自溶，慢性炎細(xì)胞浸潤;肺局灶血管旁少量炎細(xì)胞散在浸潤;肝細(xì)胞濁腫，可見雙核和核大肝細(xì)胞;心臟充血，局灶心肌纖維變性。可見小鼠病理變化主要以炎性反應(yīng)為主，引起腫大充血和變性。

3.8 目的菌回收結(jié)果

將實驗過程中死亡的實驗組小鼠進(jìn)行解剖，取腸道和肝臟所分離到的細(xì)菌，鑒別培養(yǎng)后進(jìn)行純化擴(kuò)增，送擴(kuò)增的菌液至生物公司進(jìn)行測序，在NCBI上比對后，確定其就是產(chǎn)酸克雷伯菌，說明實驗組小鼠死亡是由產(chǎn)酸克雷伯菌感染引起的。

3.9 治療結(jié)果

經(jīng)過提出的治療方案進(jìn)行了為期一周的治療，最后該患病大象基本恢復(fù)正常。

4 討論與分析

該大象在此之前一直有做定期細(xì)菌檢測，在之前的記錄中，其糞便中都存在有大腸桿菌O83∶H1和大腸桿菌O104∶H4等這些常見致病菌，但是該大象之前并未出現(xiàn)便血癥狀，所以本次實驗主要以產(chǎn)酸克雷伯菌的分離鑒定及其致病試驗研究展開的。

從死亡小鼠解剖結(jié)果來看，產(chǎn)酸克雷伯菌侵害的部位主要是腸道、肝臟和肺臟，主要表現(xiàn)為腸道水腫，內(nèi)有大量黃色黏液;肺部點狀出血和肝臟部分壞死。用前3個梯度濃度的菌液注射的小鼠，在接種后的48 h內(nèi)全部死亡，其他梯度濃度的菌液所注射的小鼠都表現(xiàn)出了輕微或嚴(yán)重的臨床癥狀，最后均發(fā)生死亡，說明該菌對小鼠易感且致病性較強(qiáng)，這跟Bleich等［11］和 Foreman 等［12］的研究是具有一致性的。

［1］ 張立．中國亞洲象現(xiàn)狀及研究進(jìn)展 ［J］．生物學(xué)通報，2006，41(11):1－3．

［2］ 趙思越，段剛，項勛，等．紅嘴鷗產(chǎn)酸克雷伯菌的生物學(xué)特性［J］．養(yǎng)殖與飼料，2014(12):19－21．

［3］ 方文珍，陳志鴻，陳小麟，等．廈門濱海濕地冬季鳥類群落多樣性研究 ［J］．海洋科學(xué)，2007，31(1):10－16，27．

［4］ 楊漢春．獸醫(yī)微生物學(xué)和免疫學(xué)［M］．北京:中國農(nóng)業(yè)出版社，2016:11－12．

［5］ 劉玉濤，吳學(xué)敏，陳如敬，等．福建省雞源大腸桿菌的分離鑒定及藥敏試驗［J］．中國農(nóng)學(xué)通報，2014，30(2):65－68．

［6］ 趙明禮．牛源性致病性大腸桿菌的分離鑒定及E.coli O157∶H7生物學(xué)特性研究［D］．哈爾濱:東北農(nóng)業(yè)大學(xué)，2013．

［7］ 趙冉冉，鐘廷，張文華．模擬生物進(jìn)化機(jī)制的探究實驗 ［J］．中學(xué)生物學(xué)，2014，30(10):45－46．

［8］ 東秀珠，蔡妙英．常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊 ［M］．8版．北京:科學(xué)出版社，2001．

［9］ 王雙山，張敬禮，劉慶昌，等．肉雞大腸桿菌的分離鑒定及藥敏試驗 ［J］．河南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2003(6):43－45．

［10］ 張成棟．I型菌毛介導(dǎo)鼠傷寒沙門氏菌對小鼠的毒力及對抗原遞呈細(xì)胞侵襲力的研究 ［D］．武漢:華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，2009:35．

［11］ Bleich A，Kirsch P，Sahly H，et al．Klebsiella oxytoca:opportunistic infections in laboratory rodents ［J］．Laboratory Animals，2008，42(3):369－375．

［12］ Foreman O，Kavirayani A M，Griffey S M，et al．Opportunistic bacterial infections in breeding colonies of the NSG mouse strain［J］．Veterinary Pathology，2011，48(2):495 －499．

附件:

細(xì)菌分離鑒定結(jié)果圖片

圖6 普通平板培養(yǎng)基Fig.6 Normal plate medium

圖8 麥康凱培養(yǎng)基Fig.8 MacConkey medium

圖7 血平板培養(yǎng)基Fig.7 Blood plate medium

圖9 伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基Fig.9 Eosin methylene blue medium

革蘭氏鏡檢結(jié)果圖片

圖10 細(xì)菌鏡檢圖片F(xiàn)ig.10 Bacteria microscopy pictures

動物解剖結(jié)果圖片

圖11 原位觀察Fig.11 In situ observation

圖12 腸道Fig.12 Intestinal

圖13 肝臟Fig.13 Liver

圖14 心臟和肺臟Fig.14 Heart and lungs

產(chǎn)酸克雷伯菌的堿基序列

大腸桿菌O104∶H4的堿基序列

大腸桿菌O83∶H3