基于小鼠焦慮模型研究黃連阿膠湯中雞子黃的配伍作用

河南省中醫(yī)院，河南 鄭州 450002

黃連阿膠湯出自張仲景所著《傷寒論》[1]第303條：“少陰病，得之二三日以上，心中煩，不得臥，黃連阿膠湯主之”。處方中以黃芩、黃連清心火，以阿膠、白芍、雞子黃滋腎水，使水火既濟(jì)，心腎相交，諸證得愈。但雞子黃一藥，歷代醫(yī)家注解頗多?！蹲⒔鈧摗穂2]曰：“陰不足，以甘補(bǔ)之，雞子黃之甘以補(bǔ)血”；《傷寒附翼》[3]曰：“雞子黃稟南方之火色，入通于心，可以補(bǔ)離宮之火，用生者攪和，取其流動(dòng)之義也”；《傷寒溯源集》[4]曰：“雞子苦，氣味俱厚，陰中之陰，故能補(bǔ)陰除熱”；《絳雪園古方選注》[5]曰：“雞子黃色赤，入通于心，補(bǔ)離中之氣”。歷代醫(yī)家或主要根據(jù)法象藥理學(xué)理論對(duì)雞子黃的作用進(jìn)行注解，對(duì)其配伍作用較為推崇。然而亦有現(xiàn)代研究認(rèn)為處方中不用雞子黃者[6]。另根據(jù)《傷寒論》中雞子黃用量為兩枚，待藥液“小冷，納雞子黃，攪令相得”。最后所得到的黃連阿膠湯黃褐色，較粘稠，有較重腥味，難以入口。其中雞子黃是引起黃連阿膠湯煎劑色澤和味道較差的重要因素?，F(xiàn)代藥理研究，黃連阿膠湯具有明顯的抗焦慮作用[6]。為了讓患者能夠順利服藥，并考慮到雞子黃在處方中為佐藥。本實(shí)驗(yàn)基于黃連阿膠湯的抗焦慮作用研究雞子黃配伍的必要性。

1 材料與方法

1.1 材料 雞子黃為雞蛋(購(gòu)于思達(dá)超市)去除蛋清后的雞子黃；地西泮(規(guī)格2.5 mg/片，批號(hào)20090521，廣東三才醫(yī)藥集團(tuán)有限公司)，GABA試劑盒(R&D公司)，5-HT試劑盒(R&D公司)，NE試劑盒(南京建成生物工程研究所)。

1.2 動(dòng)物 SPF級(jí)昆明種小鼠，體重(20±2)g，均為雄性，購(gòu)自鄭州大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。小鼠生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(豫)2010-0002。

1.3 儀器 高架十字迷宮裝置(批號(hào)20050228，成都泰盟科技有限公司)；小鼠明暗箱(自制，實(shí)驗(yàn)裝置包括相連的明暗兩個(gè)小室組成。整個(gè)裝置為1個(gè)44 cm×21 cm×21 cm的動(dòng)物籠，籠子的2/3部分為明室(由旁邊所放的臺(tái)燈照亮)；1/3為暗室，由隔板將明暗兩室分開(kāi)，隔板規(guī)格為21 cm×21 cm；小鼠可在明暗兩室之間自由活動(dòng))；Enspire 2300 多功能酶標(biāo)儀(美國(guó) PerkinElmer 公司)；電動(dòng)勻漿器(IKA，德國(guó))。

1.4 實(shí)驗(yàn)樣品的制備

1.4.1 陽(yáng)性藥的制備 取地西泮兩片研缽中研細(xì)，加蒸餾水25 mL，得0.2 mg/mL地西泮藥液。

1.4.2 黃連阿膠湯全方高劑量組及缺雞子黃黃連阿膠湯高劑量組的制備 取黃連48 g，黃芩24 g，白芍24 g，煎煮2次，第1次加水1 200 mL，浸泡30 min后煎煮30 min，第2次加水800 mL，煎煮20 min，合并水煎液濃縮至200 mL，去滓趁熱加阿膠36 g煬化，攪均后等分，一份為缺雞子黃黃連阿膠湯高劑量組(0.66 g/mL)；一份待稍冷(50℃以下)后加入兩枚雞子黃，即黃連阿膠湯高劑量組。

1.4.3 黃連阿膠湯中、低劑量 取高劑量黃連阿膠湯，用蒸餾水配成0.40 g/mL、0.20 g/mL溶液。

1.4.4 缺雞子黃黃連阿膠湯高劑量中、低劑量 取缺雞子黃黃連阿膠湯高劑量，配成0.33 g/mL、0.165 g/mL溶液。

1.5 實(shí)驗(yàn)方法

1.5.1 分組與給藥 雄性小鼠100只，18～22 g，隨機(jī)分成8組，正常組、陽(yáng)性組、黃連阿膠湯全方高、中、低劑量組，缺雞子黃黃連阿膠湯方高、中、低劑量組。室溫保持在20 ℃左右，保持安靜，不限食水飼養(yǎng)3 d，接著連續(xù)灌胃5 d，每組依次給予生理鹽水，2.0 mg/Kg地西泮混懸液，黃連阿膠湯全方提取液高、中、低劑量，缺雞子黃黃連阿膠湯提取液高、中、低劑量，灌胃為體積0.2 mL/10 g。5 d后進(jìn)行十字迷宮和明暗箱穿箱的行為學(xué)實(shí)驗(yàn)。

1.5.2 行為學(xué)實(shí)驗(yàn)[7]

1.5.2.1 十字迷宮實(shí)驗(yàn) 于末次給藥30 min后將小鼠放在塑料箱中(60 cm×40 cm×40 cm)活動(dòng)，任其自由探究5 min后然后迅速至于EPM的中央平臺(tái)處，使頭朝開(kāi)放臂，放下小鼠的同時(shí)另一人員用鼠標(biāo)點(diǎn)擊“開(kāi)始實(shí)驗(yàn)”。預(yù)先在電腦上設(shè)置好十字迷宮跟蹤系統(tǒng)，電腦自動(dòng)記錄行蹤。每只小鼠5 min，中間用濕布擦拭迷宮，清除糞便。以小鼠開(kāi)放臂進(jìn)入次數(shù)百分比(OE%)即開(kāi)放臂進(jìn)入次數(shù)/(開(kāi)放臂進(jìn)入次數(shù)+封閉臂進(jìn)入次數(shù))和開(kāi)放臂滯留時(shí)間百分比(OT%)即開(kāi)放臂滯留時(shí)間/(開(kāi)放臂滯留時(shí)間+封閉臂滯留時(shí)間)作為評(píng)價(jià)藥物抗焦慮作用的指標(biāo)。

1.5.2.2 明暗箱穿箱實(shí)驗(yàn) 十字迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)束后馬上進(jìn)行明暗箱測(cè)試。測(cè)試前10 min將小鼠放在寬闊的塑料箱中進(jìn)行適應(yīng)性活動(dòng)10 min，然后由一名測(cè)試人員把小鼠(背對(duì)暗箱)放入明箱中，同時(shí)打開(kāi)秒表，蓋上明箱蓋子，記錄10 min內(nèi)小鼠穿箱次數(shù)。

1.5.3 生化指標(biāo)檢測(cè)

1.5.3.1 小鼠腦組織中GABA和5-HT的含量測(cè)定 小鼠行為學(xué)觀察后，立即斷頭處死，冰臺(tái)上迅速剝離全腦，然后用分析天平稱量其重量，根據(jù)此重量計(jì)算應(yīng)加入的冰冷的生理鹽水的量，以腦組織(g)∶生理鹽水(mL)=1∶9的比例在低溫下用玻璃勻漿機(jī)進(jìn)行勻漿，4℃下3 000 r/min離心20 min，取上清液于-20℃以下低溫保存。制成10%的腦勻漿按測(cè)試盒說(shuō)明操作，分別測(cè)定腦組織中GABA和5-HT的含量。

1.5.3.2 小鼠血清中NE水平測(cè)定 行為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)束后立即摘眼球取血1 mL，室內(nèi)靜置2 h，4 000 r/min離心10 min，取血清置于1.5 mLEP管內(nèi)，80℃儲(chǔ)存。ELISA試劑盒法測(cè)定血清中NE水平。

1.5.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)分析用SPSS13.0 for windows統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)資料的統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，各組間比較采用單因素方差分析，計(jì)量資料用平均數(shù)加減標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較用方差分析(LSD法)，等級(jí)資料采用Riddit檢驗(yàn)。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 高架十字迷宮、明暗箱實(shí)驗(yàn)結(jié)果 與正常組比較，陽(yáng)性藥物地西泮能顯著增加小鼠進(jìn)入高架十字迷宮OE%(P<0.05) OT%(P<0.05)和小鼠明暗箱穿箱次數(shù)(P<0.05)；黃連阿膠湯全方4.0 g/kg、2.0g/kg能顯著增加小鼠進(jìn)入高架十字迷宮OE%(P<0.05)和OT%(P<0.05)；黃連阿膠湯全方4.0 g/kg、能顯著增加小鼠明暗箱穿箱次數(shù)(P<0.05)；黃連阿膠湯缺雞子黃組對(duì)小鼠進(jìn)入高架十字迷宮OE%(P<0.05)、OT%(P<0.05)無(wú)顯著性影響，8.0 g/kg能顯著增加小鼠明暗箱穿箱次數(shù)(P<0.05)。見(jiàn)表1、表2。

組別鼠數(shù)給藥劑量開(kāi)臂時(shí)間 百分比/OT% 開(kāi)臂次數(shù)百分比/OE%正常組100.2mL/10g25.97±7.4739.46±3.66地西泮組102.0mg/kg58.28±10.01?58.49±7.75?黃連阿膠湯全方高劑量組108.0g/kg32.66±13.1345.77±4.29黃連阿膠湯全方中劑量組104.0g/kg45.87±7.93?53.56±4.71?黃連阿膠湯全方低劑量組102.0g/kg51.85±12.54?48.04±5.90?缺雞子黃黃連阿膠湯高劑量組106.6g/kg29.46±11.1348.98±7.76?缺雞子黃黃連阿膠湯中劑量組103.3g/kg36.01±11.7745.31±9.51缺雞子黃黃連阿膠湯低劑量組101.65g/kg34.73±14.1941.30±10.77

注：與模型組比較，*P<0.05。

組別鼠數(shù)給藥劑量穿箱次數(shù)正常組100.2mL/10g9.22±2.32地西泮組102.0mg/kg22.44±3.98?黃連阿膠湯全方高劑量組108.0g/kg12.89±4.86黃連阿膠湯全方中劑量組104.0g/kg19.56±4.18?黃連阿膠湯全方低劑量組102.0g/kg15.44±5.59黃連阿膠湯缺雞子黃方高劑量組106.6g/kg16.78±2.97?黃連阿膠湯缺雞子黃方中劑量組103.3g/kg14.89±5.54黃連阿膠湯缺雞子黃方低劑量組101.65g/kg12.56±5.66

注:與模型組比較，*P<0.05。

2.2 生化指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果

2.2.1 小鼠腦組織中GABA和5-HT的含量測(cè)定 與正常組比較，陽(yáng)性藥物地西泮能顯著提高小鼠腦內(nèi)GABA含量(P<0.05)，降低腦內(nèi)5-HT的含量；黃連阿膠湯配伍雞子黃8.0 g/kg、4.0 g/kg能顯著增加小鼠腦內(nèi)GABA含量，8.0 g/kg能顯著降低5-HT的含量；黃連阿膠湯缺雞子黃方對(duì)小鼠腦內(nèi)5-HT的含量無(wú)顯著性影響，8.0 g/kg能顯著增加小鼠腦內(nèi)GABA含量。見(jiàn)表3。

組別鼠數(shù)給藥劑量GAB/μmoL/L5-HT/pg/mL正常組100.2mL/10g1.93±0.74120.46±2.15地西泮組102.0mg/kg3.95±0.25?90.49±6.57?黃連阿膠湯全方高劑量組108.0g/kg3.71±0.31?103.77±5.26?黃連阿膠湯全方中劑量組104.0g/kg3.63±0.33?107.56±3.71黃連阿膠湯全方低劑量組102.0g/kg2.78±0.54110.04±6.23黃連阿膠湯缺雞子黃方高劑量組106.6g/kg3.26±0.13?109.98±6.77黃連阿膠湯缺雞子黃方中劑量組103.3g/kg2.66±0.77112.31±5.91黃連阿膠湯缺雞子黃方低劑量組101.65g/kg2.43±0.19113.30±7.10

注：與模型組比較，*P<0.05。

2.2.2 小鼠血清中NE水平測(cè)定 與正常組比較，陽(yáng)性藥物地西泮能顯著降低小鼠血清中NE含量(P<0.01)；黃連阿膠湯全方8.0 g/kg、4.0 g/kg降低小鼠血清中NE含量；黃連阿膠湯缺雞子黃方對(duì)焦慮小鼠血清中NE含量無(wú)顯著性影響。見(jiàn)表4。

組別鼠數(shù)給藥劑量NE/pg/mL 正常組100.2mL/10g36.92± 8.43地西泮組102.0mg/kg24.96±5.47??黃連阿膠湯全方高劑量組108.0g/kg28.16± 6.39?黃連阿膠湯全方中劑量組104.0g/kg28.77±5.48?黃連阿膠湯全方低劑量組102.0g/kg29.69± 7.21黃連阿膠湯缺雞子黃方高劑量組106.6g/kg30.12± 5.67黃連阿膠湯缺雞子黃方中劑量組103.3g/kg30.45± 5.55黃連阿膠湯缺雞子黃方低劑量組101.65g/kg30.96± 8.33

注：與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01。

3 討論

高架十字迷宮和明暗箱實(shí)驗(yàn)兩種模型均是利用新異環(huán)境及光線造成焦慮刺激的行為，由于這些模型引起的動(dòng)物焦慮狀態(tài)方法較為快速簡(jiǎn)便。趙玉堂使用高架十字迷宮焦慮小鼠模型發(fā)現(xiàn)黃連阿膠湯具有明顯的抗焦慮作用[6]，故本實(shí)驗(yàn)選用此經(jīng)典模型進(jìn)行雞子黃抗焦慮作用研究。

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在受到新異環(huán)境及光線刺激造成焦慮刺激之后，丘腦-垂體-腎上腺(HPA)軸系統(tǒng)被激活，如NE的含量上升；腦組織神經(jīng)遞質(zhì)釋放量改變[8-9]。GABA為大腦內(nèi)的抑制性氨基酸，5-HT為大腦內(nèi)的興奮性氨基酸[10]，黃連阿膠湯全方高劑量組與缺雞子黃高劑量組相比能夠顯著降低焦慮模型小鼠腦內(nèi)的5-HT含量，降低焦慮模型小鼠腦內(nèi)的NE含量；說(shuō)明黃連阿膠湯配伍雞子黃可能通過(guò)降低焦慮模型小鼠腦內(nèi)興奮性氨基酸和降低丘腦-垂體-腎上腺(HPA)軸系統(tǒng)釋放發(fā)揮抗焦慮作用。不論是高架十字迷宮和還是明暗箱實(shí)驗(yàn)，黃連阿膠湯配伍雞子黃灌胃的小鼠對(duì)新異環(huán)境及光線造成的焦慮刺激的抵抗都優(yōu)于缺雞子黃黃連阿膠湯灌胃的小鼠；對(duì)不同組內(nèi)小鼠體內(nèi)生化指標(biāo)的進(jìn)行檢測(cè)，全方黃連阿膠湯灌胃的小鼠體內(nèi)興奮性氨基酸含量較低，而抑制性氨基酸含量較高，以上實(shí)驗(yàn)均表明黃連阿膠湯配伍雞子黃抗焦慮作用較優(yōu)，因此原方配伍雞子黃是有必要的。

黃連阿膠湯中黃連和黃芩兩味藥合煎后黃連中的異喹啉型生物堿與黃芩中多酚類成分生成了分子量較大的水不溶性化合物[11]。文獻(xiàn)報(bào)道[12]黃連、黃芩共同煎煮時(shí)有效成分雖然相互結(jié)合生成沉淀，但是口服后在胃液和腸液的作用下均能被分解而發(fā)揮藥效作用。陳哲杰等[13]也發(fā)現(xiàn)三黃瀉心湯中黃連與黃芩共煎產(chǎn)生的“絮狀物”是其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)不可或缺的一部分，因?yàn)樾鯛钗镞M(jìn)入胃腸以后可以緩慢釋放而發(fā)揮療效。黃連、黃芩、白芍一起煎煮之后產(chǎn)生沉淀，藥液在60℃以上阿膠烊化，50℃以下加入雞子黃后攪拌，阿膠和雞子黃的加入使藥液形成一種較為穩(wěn)定、均勻的混合體系，可以避免因?yàn)榛颊叻帟r(shí)沉淀物的丟棄而使療效降低?？紤]到以上因素，雞子黃或許在增強(qiáng)抗焦慮作用的同時(shí)在湯劑中起到一定助懸劑的作用。

[1]張仲景.傷寒論[M]. 北京：學(xué)苑出版社,2009:107.

[2] 成無(wú)己.注解傷寒論[M]. 北京：人民衛(wèi)生出版社,2012:152.

[3] 柯琴.傷寒論[M].上海：上海科學(xué)技術(shù)出版社,1990:42.

[4]錢潢.傷寒溯源集[M].北京：學(xué)苑出版社, 2009:365.

[5] 王子接.絳雪園古方選注[M].上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社, 1982:13.

[6] 趙玉堂. 黃連阿膠湯對(duì)高架十字迷宮焦慮小鼠模型的影響[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志, 2012,18(20):281-282.

[7] 陳奇,鄧文龍,張世瑋,等.中藥藥理研究方法學(xué)[M].北京:人民衛(wèi)生出版社, 2000.

[8] 孫璐,付茜,張嬋溪,等.野燈心草地上部分菲類成分及其抗焦慮作用研究[J].中國(guó)中藥雜志,2016,41(6):1070-1074.

[9] 陳超杰,鐘志鳳,謝璇,等.鉤吻素子對(duì)孤立大鼠的抗焦慮作用及其機(jī)制[J].中國(guó)醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2016,13(26):8-12.

[10]李凱,賈利利,張振凌.不同煎煮方法黃連阿膠湯對(duì)失眠小鼠作用的比較[J].中國(guó)中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)雜志,2013,19(10):1191-1193.

[11]陳漢裕,陳鳳麗,林贊檬,等.安神補(bǔ)心膠囊對(duì)小鼠大腦內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)影響[J].世界中醫(yī)藥, 2017,3(15):138-141.

[12]李建榮. 中藥沉淀性配伍的研究[C].//中藥研究論文集,2002,9(1):491-493.

[13]陳哲杰,李文,林美斯,等.三黃瀉心湯研究現(xiàn)狀及其關(guān)鍵技術(shù)與核心問(wèn)題分析[J].中草藥, 2016,47(22):4111-4117.