Dickeya sp.DCE－01關(guān)鍵脫膠酶基因克隆及表達(dá)

曾潔，成莉鳳，段盛文，馮湘沅，鄭科，劉志遠(yuǎn)，周映君，楊琦，劉正初

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院麻類研究所，長沙410205）

麻類等韌皮纖維在加工利用過程中必須去除麻纖維伴生物，俗稱膠質(zhì)，才能獲得可供利用的纖維［1］。脫膠是為了脫去韌皮纖維中的伴生物，其主要成分為果膠、半纖維素和木質(zhì)素。果膠是一種存在于高等植物細(xì)胞壁中的雜多糖，與植物組織中的半纖維素、木質(zhì)素、纖維素和蛋白質(zhì)等相互交聯(lián)［2］。半纖維素是連接木質(zhì)素和纖維素的一類雜聚多糖，廣泛存在于各種植物纖維的細(xì)胞壁中。木聚糖和甘露聚糖都屬于半纖維素［3－4］。因此，果膠酶、木聚糖酶、甘露聚糖酶是生物脫膠的關(guān)鍵酶。與傳統(tǒng)的漚麻和化學(xué)脫膠方法相比，苧麻生物脫膠方法具有“高效、節(jié)能、減排”等優(yōu)勢，是一種環(huán)境友好型加工方式［5－7］。

Dickeya sp.DCE－01是本團(tuán)隊(duì)長期從事麻類等草本纖維生物精制科學(xué)與工程研究選育到的一株“廣譜性”、“高效性”脫膠菌，該菌株胞外分泌果膠酶、甘露聚糖酶和木聚糖酶，對苧麻、紅麻、黃麻、亞麻、羅布麻、龍須草、麥草等草本纖維原料均能起到很好的脫膠效果，且6 h能獨(dú)立完成苧麻脫膠，不需要其他化學(xué)方法后處理補(bǔ)充。其脫膠功能的廣譜性和高效性在國內(nèi)外都處于領(lǐng)先地位［8－9］。

本研究擬通過對DCE－01菌株關(guān)鍵脫膠酶基因（果膠酶基因、甘露聚糖酶基因和木聚糖酶基因）的克隆及表達(dá)分析，深入挖掘DCE－01菌株中脫膠酶基因，旨在為研發(fā)高效麻類脫膠酶制劑提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1 菌株與質(zhì)粒

菌株DCE－01是由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院麻類研究所生物加工課題組分離篩選與保存。E.coli BL21，E.coli Top 10菌株和質(zhì)粒pET－28a購自TaKaRa生物公司。

1.2 主要試劑

DNA膠回收試劑盒、細(xì)菌基因組抽提試劑盒和小量質(zhì)粒提取試劑盒均購自O(shè)MEGA公司；rTaq PCR酶、TA連接試劑盒（質(zhì)粒pMD 19－T）、KOD－Plus－高保真PCR試劑盒和T4 ligase試劑盒均購自TOYOBO生物公司；DNA Marker DL 15000和FastDigest內(nèi)切酶均購自Thermo scientific生物公司；卡那霉素、X－gal、IPTG、氨芐青霉素、酵母提取物、瓊脂粉和胰蛋白胨購自 Sigma公司；其余化學(xué)試劑均為分析純級產(chǎn)品。引物合成和核酸測序由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司完成。

1.3 主要培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨1%，NaCl 1%，酵母提取物0.5%。固體培養(yǎng)基需加1.5%的瓊脂粉［10］。

SOC培養(yǎng)基：胰蛋白胨 2%，NaCl 0.05%，酵母提取物 0.5%，2.5 mmol／L KCl，0.01 mol／L MgCl2和 0.02 mol／L葡糖糖［10］。

活化培養(yǎng)基：蛋白胨0.5%，NaCl 0.5%，葡萄糖1%，牛肉膏0.5%［10］。

2 方法

2.1 菌株DCE－01的活化

挑取一環(huán)課題組斜面管保存的DCE－01菌種菌苔接種于5 mL活化培養(yǎng)基中，振蕩懸浮，35℃培養(yǎng)5 h。稀釋涂平板，35℃培養(yǎng)16～18 h。挑取單菌落接種至5 mL LB培養(yǎng)基，35℃，180 r／min震蕩培養(yǎng) 12～16 h，用于基因組 DNA提?。?0］。

2.2 DCE－01菌株基因組DNA提取

采用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒抽提DCE－01基因組 DNA，具體操作參照《細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒說明書》。用0.7%的瓊脂糖凝膠電泳檢測基因組DNA提取質(zhì)量。于－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)菌株DCE－01的基因組DNA序列信息，利用生物信息學(xué)軟件DNAMAN設(shè)計(jì)特異引物。

表1 生物脫膠關(guān)鍵酶基因的擴(kuò)增引物Tab.1 Primers of key genes of bio－degumming enzymes

2.4 PCR擴(kuò)增DCE－01關(guān)鍵脫膠酶基因

以DCE－01菌株基因組DNA為模板，采用表1的引物和高保真聚合酶 KOD Plus－Neo－進(jìn)行 PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為：10×PCR Buffer 5μL，dNTPs 5μL，MgSO43μL，F(xiàn)a1 1μL，Ra1 1μL，KOD Plus－DNA聚合酶1μL，基因組DNA 1μL，用無菌ddH2O補(bǔ)充到總反應(yīng)體積為50μL，快速離心混和，參照TOYOBO《KOD－Plus－高保真PCR試劑盒說明書》進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

2.5 目的片段回收

采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，切取目的基因片段進(jìn)行回收，具體步驟參照OMEGA公司的《DNA凝膠回收試劑盒說明書》。

2.6 平末端DNA加A尾

加 A尾反應(yīng)體系為：10×buffer 2μL，dNTPs 3μL，MgCl21μL，rTaq酶0.5μL，PCR產(chǎn) 物13.5μL。72℃ 保溫30 min，電泳，切膠回收加尾產(chǎn)物。

2.7 目的片段的TA連接

參照試劑盒說明進(jìn)行TA連接，具體步驟如下：

（1）將Solution I溶液與pMD18－T載體等試劑置于冰上融化；

（2）于200μL滅菌反應(yīng)管中依次加入下列反應(yīng)體系：目的DNA片段4.5μL，Solution I 5μL，pMD18－T載體1μL；

（3）輕緩混勻，低速短暫離心使反應(yīng)體系集中于管底，將連接體系置于16℃孵育過夜。

2.8 重組質(zhì)粒構(gòu)建與轉(zhuǎn)化

（1）將E.coli Top10感受態(tài)細(xì)胞置于冰上融化；

（2）將酶連產(chǎn)物按1∶100的比例加入Top10感受態(tài)細(xì)胞中，輕緩混勻，置于冰水中孵育30 min；

（3）取孵育后的混合液，42℃熱激準(zhǔn)確反應(yīng)90 s，迅速置于冰上靜置5～10 min；

（4）加入 800μL SOC液體培養(yǎng)基，37℃、180 r／min振蕩培養(yǎng) 90 min；

（5）取 100μL菌液涂布于 LB固體平板上（已加 20μL 20 mg／mL IPTG、40μL 20 mg／mL X－gal、30μL 100 mg／mL Amp），于 37℃過夜培養(yǎng)。

2.9 重組子篩選與鑒定

（1）菌落PCR驗(yàn)證

從篩選平板上挑取陽性克隆單菌，用10μL無菌雙蒸水溶解懸浮后，取1μL混合菌液用各自目的基因的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，鑒定重組子是否正確［10］。

（2）重組子的酶切鑒定

參照OMEGA公司的《小量質(zhì)粒提取試劑盒說明書》提取質(zhì)粒，用限制性內(nèi)切酶Bam H I和Hand III對重組質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，驗(yàn)證目的基因片段是否正確。

2.10 高效表達(dá)重組菌的構(gòu)建與驗(yàn)證

用限制性內(nèi)切酶Bam H I和Hand III分別對重組質(zhì)粒pMD 19－T－P、pMD 19－T－X和pMD 19－T－M及載體pET－28a雙酶切。經(jīng)電泳、切膠、純化，將目的片段與線性的pET－28a載體進(jìn)行連接，并轉(zhuǎn)化到E.coli BL21中，通過含100μg／mL卡那霉素的LB平板對重組菌進(jìn)行篩選。挑取典型單菌落于LB培養(yǎng)液，過夜培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，用限制性內(nèi)切酶Bam H I和Hand III對重組質(zhì)粒pET－28a－P、pET－28a－X和pET－28a－M雙酶切，電泳檢測，驗(yàn)證目的片段是否正確插入。鑒定后的重組質(zhì)粒由上海生工生物公司進(jìn)行DNA序列測定。

2.11 重組菌的誘導(dǎo)表達(dá)與產(chǎn)酶分析

挑取正確插入目的基因片段的重組菌接種于5 mL LB培養(yǎng)液（含100μg／mL卡那霉素）中，37℃、180 r／min過夜培養(yǎng)。取1 mL菌液接種至100 mL LB培養(yǎng)液（含100μg／mL卡那霉素），37℃、180 r／min培養(yǎng)至OD600達(dá)到0.4～0.6時(shí)，添加 IPTG到終濃度1 mmol／L，放入水浴搖床中，120 r／min，30℃誘導(dǎo)產(chǎn)酶。以未插入目的片段的空載體菌株pET－28a／BL21為對照，與重組菌進(jìn)行相同處理。

取1 mL菌液10000 r／min離心5 min，收集菌體，用50μL無菌雙蒸水與等體積2×蛋白上樣緩沖液懸浮菌體，沸水浴5 min，離心取上清，用于SDS－PAGE電泳點(diǎn)樣［11－13］。

分別取誘導(dǎo)6、9、12、15、18、21、24 h的發(fā)酵菌液進(jìn)行超聲破碎，超聲參數(shù)設(shè)置為：強(qiáng)度30%，超聲5 s，間隔5 s，時(shí)間30 min［10］。將裂解后的菌體溶液10000 r／min離心10 min，上清液用于酶活力測定。果膠酶、甘露聚糖酶及木聚糖酶活力測定方法分別參照文獻(xiàn)［14－17］。

3 結(jié)果與分析

3.1 DCE－01菌株基因組DNA提取

由圖1可以看出，檢測到清晰的單一條帶。OD260/OD280值為1.6～1.8，說明該核酸純度較高，可供后續(xù)試驗(yàn)備用。

3.2 關(guān)鍵酶基因的擴(kuò)增

以提取的DCE－01基因組DNA為模板，進(jìn)行果膠酶基因（pel E）、木聚糖酶基因（xyn）和甘露聚糖酶基因（man）的PCR擴(kuò)增。采用1%瓊脂糖凝膠電泳，由圖2可知，該P(yáng)CR產(chǎn)物條帶清晰、無雜帶，基因片段大小為1000～1300 bp，與預(yù)測結(jié)果一致。經(jīng)測序分析，果膠酶基因片段為1179 bp、木聚糖酶基因片段為1251 bp、甘露聚糖酶基因片段為1137 bp。初步說明關(guān)鍵酶基因擴(kuò)增成功。

圖1 DCE－01基因組DNAFig.1 Genomic DNA of DEC－01 strain

圖2 關(guān)鍵酶基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物Fig.2 PCR products of key enzyme gene

3.3 TA克隆重組子篩選與鑒定

將PCR擴(kuò)增得到的目的基因片段加 A尾，再與pMD 19－T進(jìn)行TA連接，導(dǎo)入E.coli Top10受體，構(gòu)建獲得重組質(zhì)粒pMD 19－T－P、pMD 19－T－X和pMD 19－T－M。對陽性克隆進(jìn)行菌落PCR，圖3結(jié)果表明：1200 bp附近出現(xiàn)單一清晰的條帶，條帶大小與關(guān)鍵酶基因擴(kuò)增結(jié)果和預(yù)計(jì)基因片段大小基本一致。說明3種關(guān)鍵脫膠酶基因片段成功連接到了pMD 19－T載體上。

對PCR驗(yàn)證后的重組菌提質(zhì)粒，雙酶切驗(yàn)證，電泳檢測結(jié)果見圖4。通過雙酶切獲得兩條清晰單一條帶，分別為線性載體pMD 19－T與目的基因片段。線性載體pMD 19－T片段約2600 bp，目的基因片段在1000～1300 bp附近，與預(yù)計(jì)DNA片段大小一致，說明重組子構(gòu)建成功。

圖3 菌落PCR檢測重組子Fig.3 Detection of recombinants by PCR

圖4 酶切檢測重組子Fig.4 Detection of recombinants

3.4 高效表達(dá)重組菌的鑒定與產(chǎn)酶分析

經(jīng)連接轉(zhuǎn)化，成功構(gòu)建重組菌 pET－28a－P／BL21、pET－28a－X／BL21和 pET－28a－M／BL21。提取質(zhì)粒，用限制性內(nèi)切酶Bam H I和Hand III對重組子進(jìn)行酶切驗(yàn)證，酶切鑒定電泳檢測結(jié)果見圖5。通過雙酶切獲得兩條清晰單一條帶，分別為 pET－28a線性空載體與目的基因片段。線性載體pET－28a約5000 bp，目的片段條帶在1000～3000 bp，與預(yù)計(jì)片段大小一致。

圖5 酶切檢測重組子Fig.5 Detection of recombinants

將構(gòu)建的重組菌株誘導(dǎo)表達(dá)后進(jìn)行SDS－PAGE電泳，檢測蛋白表達(dá)量，以未插入目的片段的空載體菌株pET－28a／BL21為對照，與重組菌進(jìn)行相同處理，結(jié)果（見圖6）可看到明顯表達(dá)條帶，其表觀分子量與預(yù)測的帶有部分載體的融合蛋白分子量接近，即果膠酶（pel E）、木聚糖酶（xyn）、甘露聚糖酶（man）蛋白的表觀分子量分別為43.8、45.7、41.8 kDa。由此可見，從DCE－01菌株中克隆出來的3個(gè)關(guān)鍵酶基因轉(zhuǎn)化至菌株pET－28a／BL21中均達(dá)到了特異性表達(dá)的效果。

圖6 SDS－PAGE檢測親本酶、多基因重組菌株表達(dá)Fig.6 Expression of parent enzyme and multiple gene recombinant strains by SDS－PAGE

以未插入目的片段的空載體菌株pET－28a／BL21為對照，與重組菌進(jìn)行相同處理。分別對重組菌pET－28a－P／BL21、pET－28a－X／BL21和 pET－28a－M／BL21進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，測定不同誘導(dǎo)時(shí)間的酶活，結(jié)果（見圖7～9）發(fā)現(xiàn)3種酶酶活均較高，尤其以果膠酶和甘露聚糖酶最為明顯，果膠酶酶活最高達(dá)471.97 U／mL，甘露聚糖酶則達(dá)到16882.86 U／mL。

圖7 不同誘導(dǎo)時(shí)間的果膠酶活力Fig.7 Activity of pectinase in different induction time

圖8 不同誘導(dǎo)時(shí)間的木聚糖酶活力Fig.8 Activity of xylanase in different induction time

圖9 不同誘導(dǎo)時(shí)間的甘露聚糖酶活力Fig.9 Activity ofβ－mannanase in different induction time

4 結(jié)論與討論

通過對廣譜性高效脫膠菌株DCE0－1的關(guān)鍵性脫膠酶基因的研究，成功獲得了高效表達(dá)果膠酶、甘露聚糖酶和木聚糖酶的重組菌pET－28a－P／BL21、pET－28a－M／BL21和pET－28a－X／BL21。經(jīng)酶活測定，果膠酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶活力分別高達(dá)471.97、16882.86、64.32 U／mL。

與其他報(bào)道相比，本研究構(gòu)建的甘露聚糖酶重組菌pET－28a－M／BL21具有明顯優(yōu)勢。楊家興［18］在β－甘露聚糖酶在黑曲霉中的表達(dá)研究中報(bào)道的粗酶液的最高酶活為521 U／mL；張立霞［19］在硫色曲霉來源的β－甘露聚糖酶的異源表達(dá)及酶學(xué)性質(zhì)研究中報(bào)道的甘露聚糖酶的產(chǎn)量為587 U／mL；劉項(xiàng)羽等［20］關(guān)于β－甘露聚糖酶基因在枯草芽孢桿菌中的克隆及表達(dá)中報(bào)道的酶活力最高為2748.82 U／mL。本研究中構(gòu)建的甘露聚糖酶表達(dá)菌株比上述報(bào)道的菌株甘露聚糖酶活力高14～31倍，為脫膠用甘露聚糖酶制劑的開發(fā)利用奠定了良好的基礎(chǔ)。

本團(tuán)隊(duì)后續(xù)將會對基因工程菌種產(chǎn)酶的誘導(dǎo)條件（誘導(dǎo)劑濃度、時(shí)間、溫度等）進(jìn)一步優(yōu)化，也將對基因工程菌種所產(chǎn)的果膠酶、甘露聚糖酶和木聚糖酶進(jìn)行純化及末端氨基酸肽段測序（或western blot分析），驗(yàn)證SDS－PAGE圖譜中的目標(biāo)蛋白即為對應(yīng)的脫膠關(guān)鍵酶蛋白。

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