櫻亞屬部分園藝品種遺傳多樣性的ISSR分析

蔣冬月 沈鳳強 徐盧雨 李因剛 沈 鑫 柳新紅

(1. 浙江省林業(yè)科學研究院，浙江 杭州 310023；2. 浙江物產(chǎn)長樂實業(yè)有限公司，浙江 杭州 311116)

櫻花是薔薇科 (Rosaceae) 李亞科 (Prunoideae) 櫻屬 (Cerasus) 典型櫻亞屬植物的泛稱。全世界約150種，分布于亞洲、歐洲、北美洲等北半球溫和地帶，我國有38個種，8個變種[1-2]。櫻花是早春開花植物之一，花色豐富，有白色、粉色、玫紅色、深紅色、黃綠色及各種漸變色和交叉色，花期一般在2—5月，少數(shù)11—1月；果色多為紅色、紫紅色、深紅色至黑色，果期為4—6月，少數(shù)10月[3]。櫻花花朵數(shù)量多，獨樹成景，成片種植時花海極為震撼，是優(yōu)良的園林彩化樹種，具有極高的園林推廣與應用價值。近年來，各地爭相建立櫻花主題公園、櫻花大道、櫻花長廊、櫻花專類園等，對櫻花品種的需求量非常大。全世界的櫻花栽培品種約400余種，以日本品種居多，常見品種200余種[4-6]。目前我國園林綠化中常用的櫻花只有染井吉野 (C.×yedoensis‘Somei-yoshino’)、關山 (C.serrulata‘Kanzan’)、普賢象 (C.serrulata‘Albo-rosea’) 等10余個日本品種；難以滿足櫻花現(xiàn)代化生產(chǎn)的需求。為迎合各地櫻花市場的需求，野生櫻花資源和栽培品種大量涌現(xiàn)，在品種數(shù)量增加的同時給櫻花品種的分類鑒定工作帶來了很大的困難；櫻花品種同名異物或同物異名、命名不規(guī)范、親本來源不明等現(xiàn)象時有發(fā)生。另外，各引種地栽培環(huán)境、營養(yǎng)條件和繁殖砧木各異常造成品種內(nèi)一定程度的形態(tài)差異。因此，僅僅依靠形態(tài)特征的差異已不能滿足櫻花品種的鑒定和分類。分子標記作為一種以核酸多態(tài)性為基礎的遺傳標記，因其不受組織類別、發(fā)育時期、環(huán)境條件等干擾，具有數(shù)量極多、多態(tài)性高等優(yōu)點，被證實是評價品種間親緣關系和遺傳多樣性的理想標記[7-9]。ISSR是建立在SSR (Simple Sequence Repeat) 基礎上的一種新型的分子標記技術，具有操作簡單、成本低、多態(tài)性高和重復性好等優(yōu)點[10]，已廣泛應用于香茅屬 (Cymbopogon)[11]、鳶尾屬 (Iris)[12]、風信子 (Hyacinthorientalis)[13]、桃 (Prunuspersica)[14]、石榴 (Punicagranatum)[15]等植物品種間的遺傳多樣性和親緣關系研究中。本研究以國內(nèi)常見的櫻花品種為實驗材料，利用ISSR標記從分子水平研究櫻花品種間的親緣關系和遺傳多樣性，為櫻花品種的鑒定、分類和利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料來源

在對全國櫻花品種廣泛調(diào)查基礎上，于2015年12月，從福建省、貴州省、山東省、湖北省、上海市、云南省和浙江省7個省的櫻花育種基地采集櫻花品種接穗，共采集到208份櫻花品種資源，共109個品種 (見表1)。將直徑為1.0 cm的1 a草櫻枝條截成長10 cm的插穗作為品種砧木，進行嫁接。品種嫁接苗扦插于滅菌后的苗床，采用全光照自動噴霧系統(tǒng)定時噴霧，每35 min噴10 s，正常管理，每10 d對砧木抹芽1次。于2016年5月采集品種的DNA樣品，分別將新鮮、無病害的幼嫩葉片置于裝有硅膠的自封袋中迅速干燥，然后保存于-20 ℃冰柜中備用。

1.2 研究方法

1.2.1DNA提取

利用Bioteke公司生產(chǎn)的快速植物基因組DNA提取試劑盒 (型號DP3112) 提取208份供試材料的基因組DNA，提取前利用緩沖液對樣品進行預處理，以去除大量的多糖、色素等雜質(zhì)[16]。利用1%的瓊脂糖凝膠電泳法檢測DNA質(zhì)量，用Nanodrop超微量分光光度計測定DNA濃度，并將其稀釋到50 ng/μL，置于-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2ISSR-PCR反應

經(jīng)過預實驗確定PCR優(yōu)化體系為20 μL反應液，包括2 × Taq PCR Master Mix (TSINGKE公司) 10 μL，ISSR-primer 0.6 μL，模板DNA 1.0 μL，ddH2O 8.4 μL。PCR擴增程序為94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，47.10～59.50 ℃復性30 s，72 ℃延伸90 s，共35個循環(huán)；最后72 ℃延伸7 min，于4 ℃保存。PCR擴增產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠中150 V電泳30 min，然后置于自動凝膠成像系統(tǒng)中拍照、記錄。

ISSR引物由生工生物工程 (上海) 股份有限公司合成，PCR Master Mix (blue) 購于TSINGKE公司。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用人工計數(shù)法對電泳結(jié)果進行統(tǒng)計，同一引物的同一位置擴增有帶記為1，無帶記為0，構建01矩陣[17]。根據(jù)數(shù)據(jù)矩陣，利用Ntsys 2.1軟件計算各樣品間的遺傳相似系數(shù)和遺傳距離，并采用UPGMA法進行聚類；利用Popgene 32軟件計算群體的等位基因數(shù) (Na)、有效等位基因數(shù) (Ne)、Nei′s基因多樣性指數(shù) (H)、Shannon′s信息指數(shù) (I) 等遺傳參數(shù)[18]。

2 結(jié)果與分析

2.1 ISSR標記多態(tài)性分析

通過對DNA質(zhì)量和濃度的檢測，得出208份葉片基因組DNA的濃度均大于350 ng/μL，A260/A280在1.8～2.0之間，A260/A230均大于2.0，說明提取獲得的DNA樣品純度較高，雜質(zhì)較少，能夠滿足ISSR檢測的需求。從美國哥倫比亞大學公布的100條ISSR通用引物中共篩選出15條擴增條帶清晰、穩(wěn)定性高、重復性好并呈多態(tài)性的引物 (見表2)。利用篩選出的15條ISSR引物分別對208份櫻花品種基因組DNA進行擴增，共獲得91條清晰的條帶，擴增條帶在250～1 200 bp之間；其中，多態(tài)性條帶83條。UBC834引物對部分櫻花基因組DNA擴增圖譜見圖1。不同ISSR引物擴增的多態(tài)性條帶數(shù)不同，為4～7條，平均每個引物擴增5.53條多態(tài)性條帶，平均多態(tài)性條帶比率為91.21%。這些均表明15條ISSR引物對櫻花品種基因組DNA擴增的多態(tài)性較高，說明櫻花在分子水平上的遺傳多樣性比較豐富。

表2 ISSR引物退火溫度及擴增結(jié)果Table 2 The annealing temperature and amplification results of ISSR primers

注：Y=(C, T)，R=(A, G)。

2.2 不同地區(qū)櫻花品種的遺傳多樣性

櫻花品種水平上等位基因數(shù) (Na) 為1.940 3，有效等位基因數(shù) (Ne) 為1.521 5，多態(tài)位點百分率達94.03%。櫻花在各栽培區(qū)之間的遺傳多樣性存在差異 (見表3)，多態(tài)位點百分率 (PPB) 在16.42%～83.58%之間，其中07ZJ > 03HB > 05SH > 02GZ > 04SD > 06YN > 01FJ，浙江地區(qū)的PPL最高，福建地區(qū)最低，各地區(qū)平均PPL為55.65%。Na的變化范圍為1.164 2～1.835 8，平均為1.556 5；Ne的變化范圍為1.085 9～1.491 2，平均1.343 1；Nei′s基因多樣性指數(shù) (H) 在0.054 8～0.289 5之間，平均為0.199 9；Shannon′s信息指數(shù) (I) 在0.084 4～0.435 2之間，平均為0.298 0；各遺傳參數(shù)均以浙江地區(qū)的最大，福建地區(qū)的最小。

櫻花資源總的基因多樣度 (Ht) 為0.310 7，各地區(qū)內(nèi)基因多樣度 (Hs) 為0.199 9，地區(qū)間的基因多樣度 (Dst=Ht-Hs) 為0.110 8，地區(qū)間基因分化系數(shù) (Gst=Dst/Ht) 為0.356 6，表明櫻花在地區(qū)間和地區(qū)內(nèi)均有一定程度的遺傳分化，遺傳變異主要存在地區(qū)內(nèi)。各地區(qū)間的基因交流 (Nm) 為0.451 1，說明各地區(qū)間基因交流程度相對較低。

各地區(qū)之間的遺傳距離在0.02～0.44之間，平均0.18，遺傳一致度在0.65～0.98之間，平均為0.84。其中，福建地區(qū)與貴州地區(qū)遺傳距離最大，遺傳一致度最低；湖北與浙江遺傳距離最小，一致度最高 (見圖2)。

圖1UBC834引物對部分櫻花基因組DNA的擴增圖譜
Fig.1 The profile amplified with primer UBC834 of some DNA

表3 各地區(qū)櫻花品種的遺傳多樣性Table 3 Genetic diversity of Cerasus cultivars in different regions

圖2基于Nei′s遺傳距離的UPGMA聚類
Fig.2 UPGMA dendrogram based on Nei′s genetic distance

2.3 櫻花品種的聚類分析

208份櫻花品種遺傳相似系數(shù)的范圍為0.30～0.97，平均為0.64；其中SD06與SD12，SD11與SD22，SD12、SD19和SD29，YN07與YN08的相似系數(shù)均最大，說明這些品種間親緣關系較近；YN11和HB97的遺傳相似系數(shù)最小，說明兩者親緣關系較遠。櫻花品種間的遺傳距離為0.04～1.43，平均0.59；其中SD06與SD12，SD11與SD22，SD12、SD19和SD29，YN07與YN08的遺傳距離僅為0.04，說明兩者親緣關系最近，與遺傳相似系數(shù)的結(jié)果相同；FJ03與HB100，F(xiàn)J03與HB51，SH21與FJ01，SD21與HB20，SH21與SD08，SH21與YN10遺傳距離均最大，說明彼此間親緣關系相對較遠。

根據(jù)遺傳相似系數(shù)對櫻花品種進行聚類分析，在遺傳相似系數(shù)為0.62時，208份品種分為2大類 (見圖3)，Ⅰ類群主要為福建、山東和云南地區(qū)的品種，Ⅱ類群主要為采自貴州、湖北、浙江和上海的品種。當遺傳相似系數(shù)為0.82時，除SD21外，Ⅰ類群分為E1、E2和E3小類群。其中，E1類群主要為寒緋櫻系列，花色為深紅色；E2類群花色為淡紅色系列；E3類群花色為白色、淡紅色和紅色，其中紅色系列的品種聚在一起。當遺傳相似系數(shù)為0.664時，Ⅱ類群又分為A、B、C 3個小類群，A類群、C類群為山櫻系的園藝栽培品種；B類群主要為華中櫻系列和大島櫻-寒緋櫻-江戶彼岸系列。

圖3櫻花種質(zhì)資源基于遺傳相似系數(shù)的UPGMA聚類
Fig.3 UPGMA dendrogram ofCerasusgermplasm resources based on genetic similarity coefficients

3 結(jié)論與討論

分子標記技術是繼形態(tài)標記、細胞標記以及(生化標記之后發(fā)展起來的直接反映遺傳多樣性的一種遺傳標記，可以高效、穩(wěn)定、準確地鑒定植物材料，評價品種間親緣關系和遺傳多樣性，已在牡丹 (Paeoniasuffruticosa)[19]、月季 (Rosachinensis)[20]、杜鵑 (Rhododendron)[21]等花卉中廣泛應用。在櫻花種質(zhì)資源的研究上，Badenes等[22]、曹東偉等[23]利用RFLP標記得出不同櫻桃的親緣關系；Gerlach等[24]、周春玲等[25]、Hormaza[26]成功利用RAPD技術對櫻花進行親緣關系鑒定和品種分類；Antonius等[27]、Kato等[28]、商韜等[29]通過SSR標記研究櫻花資源的遺傳多樣性。本研究利用篩選出的15條ISSR引物對208份櫻花進行PCR擴增，共獲得83條多態(tài)性條帶，引物平均多態(tài)性條帶比率為91.21%，櫻花品種水平上多態(tài)位點百分率達94.03%，Nei′s基因多樣性指數(shù)為0.309 5。說明櫻花品種間存在豐富的遺傳變異，篩選獲得的15條ISSR引物可以有效地反映208份供試材料間的親緣關系。這與前人的研究結(jié)果一致，宋常美等[30]利用21條ISSR引物對64份中國櫻桃資源多樣性進行分析，得到引物的多態(tài)性比例為87.28%；艾呈祥等[31]對34份櫻桃資源進行ISSR分析，得到多態(tài)性比率為95.97%；Shahi-Gharahlar等[32]通過ISSR對伊朗的野生櫻花資源多樣性研究，得出其多態(tài)性比率均大于81.80%；林立等[33]利用14條ISSR探究39個櫻花品種的親緣關系，得出其引物多態(tài)性比例為93.58%，平均Nei′s基因多樣性指數(shù)為0.268 3；這些研究結(jié)果均證明ISSR可以反映櫻花品種間的親緣關系。由于ISSR標記采用17～22個堿基的重復錨定引物擴增重復序列之間的片段，其比PAPD標記的長度更長，更穩(wěn)定，重復性更好，且與SSR相比其多態(tài)性更豐富，通用性更高[34-35]；因此，ISSR標記可作為櫻花資源鑒定的有效手段。

不同地區(qū)櫻花品種的遺傳多樣性結(jié)果顯示各地區(qū)平均多態(tài)位點百分率為55.65%，說明品種分布具有一定的地域特征。櫻花基因多樣度的分析也可以看出品種在地區(qū)間和地區(qū)內(nèi)均有一定程度的遺傳分化，地區(qū)內(nèi)的基因多樣度和基因分化系數(shù)大于地區(qū)間的，說明這些遺傳變異主要存在于地區(qū)內(nèi)。同時，各地區(qū)間的基因交流僅為0.451 1，小于1.00，說明各地區(qū)間基因交流程度相對較低，各地區(qū)的品種由于人為選擇及生長環(huán)境差異等原因，產(chǎn)生了一定程度的遺傳分化，這與前人對廣西甜茶 (Rubussuavissimus)[17]、七葉一枝花 (Parispolyphyllavar.chinensis)[36]、浙江紅花油茶 (Camelliachakiangoleosa)[37]、桃 (Prunuspersica)[38]等植物多樣性的研究結(jié)果一致?；贜ei′s遺傳距離和遺傳相似系數(shù)的UPGMA聚類分析均表明，208份品種可以分類2大類，一類為福建、山東和云南地區(qū)的品種，另一類為貴州、湖北、浙江和上海的品種。各類群中，遺傳背景相近的櫻花品種聚在一起，地里分布相近的品種基本上也能相鄰而聚；如八重寒緋櫻、福建山櫻花、重瓣中國紅等，其彼此間遺傳相似系數(shù)較大，遺傳距離較小，具有較近的親緣關系，這些品種聚為了E1類群。研究發(fā)現(xiàn)Ⅱ類群中的B類群由于品種親本來源比較復雜，大島櫻、寒緋櫻、江戶彼岸櫻及其雜交后代雖然聚為一類，但類群內(nèi)部各品種系列并未完全分開，這可能由于地區(qū)間的品種差異對實驗結(jié)果造成了影響，也可能是因為所用的ISSR標記數(shù)量有限，不能滿足該復雜類群內(nèi)品種區(qū)分，有待后續(xù)進一步深入研究。

櫻花作為早春開花喬木之一，花色豐富、花型各異，獨樹成景，是園林景觀綠化中不可或缺的觀花觀果觀葉樹種，具有極高的應用價值。研究櫻花品種的遺傳多樣性和親緣關系可為今后櫻花資源的保護和利用提供理論依據(jù)，為后期新品種選育提供花色艷、花量大、抗逆性強的親本材料。本研究通過ISSR標記的方法，在分子水平揭示了所收集到的櫻花品種具有豐富的遺傳多樣性，品種分布具有明顯的地域特征。證明了ISSR分子標記是分析櫻花品種遺傳多樣性十分有效的方法。因此，在今后的研究中可利用分子標記與形態(tài)標記相結(jié)合的方法，對全國范圍內(nèi)的櫻花品種進行鑒定和分類。

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