樟葉越桔不定根培養(yǎng)體系建立

卜程洪 張 訸 羅旭璐 付 羚 唐軍榮 李 娟 丁 勇 趙 平

(1. 西南林業(yè)大學(xué)西南山地森林資源保育與利用教育部重點實驗室，云南 昆明 650224;2. 西南林業(yè)大學(xué)國家林業(yè)局西南地區(qū)生物多樣性保育重點實驗室，云南 昆明 650224;3. 西南林業(yè)大學(xué)云南省高校林木生物技術(shù)重點實驗室，云南 昆明 650224)

樟葉越桔 (Vacciniumdunalianum) 為杜鵑花科 (Ericaceae) 越桔屬 (Vaccinium)常綠灌木[1], 主要分布于云南西北部經(jīng)滇中高原至滇南和滇東[2-3]。其果實營養(yǎng)豐富，全株具有舒筋活絡(luò)、祛風(fēng)除濕等功效，具有較高的藥用和保健價值[4]。此外，樟葉越桔也是一種富含咖啡酰熊果苷類物質(zhì)的特殊資源植物[5]，其主要成分的黑色素生成抑制活性優(yōu)于熊果苷，且毒性僅為熊果苷的1/2[6]，可作為熊果苷天然替代資源加以開發(fā)利用。樟葉越桔目前仍處于野生狀態(tài)，由于連年遭受破壞性采摘，導(dǎo)致其野生資源急劇減少，因此利用生物技術(shù)手段建立其培養(yǎng)體系具有重要意義。

采用 “不定根” 生物技術(shù)定向培養(yǎng)植物細(xì)胞或組織來獲取活性次生代謝產(chǎn)物，具有生長周期短、可人為調(diào)控生長條件、重復(fù)性強等優(yōu)點，是瀕危藥用植物資源開發(fā)利用研究的有效途徑之一[7]。近年來，我國學(xué)者相繼先后開展了一些藥用植物如丹參 (Salviamiltiorrhiza)[8]、三七 (Panaxnotoginseng)[9]、蒼術(shù) (Atractylodeslancea)[10]、金鐵鎖 (Psammosilenetunicoides)[11]、太子參 (Pseudostellariaheterophylla)[12]和輪葉黨參 (Codonopsislanceolata)[13]等的不定根研究，如柴素真[11]通過金鐵鎖莖段誘導(dǎo)出愈傷組織，再以其為外植體誘導(dǎo)不定根，發(fā)現(xiàn)不定根中的總皂苷含量約為金鐵鎖原藥材的2倍。迄今為止，采用葉片直接誘導(dǎo)不定根的相關(guān)研究較少，本研究以樟葉越桔組培苗葉片為材料，建立其直接誘導(dǎo)不定根的培養(yǎng)體系，以期為樟葉越桔不定根中咖啡酰熊果苷類物質(zhì)進一步的生產(chǎn)調(diào)控及其開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 植物材料

供試樟葉越桔材料于2013年5月采自云南省楚雄彝族自治州武定縣。選取當(dāng)年新生無病蟲害、生長健壯的幼嫩莖段進行表面清洗，然后采用75%乙醇和0.1% HgCl2進一步消毒，無菌水清洗4～5次，置于WPM + 3.0 mg/L 6-BA + 0.2 mg/L NAA啟動培養(yǎng)基中培養(yǎng)，在WPM + 2.0 mg/L ZT培養(yǎng)基中進行繼代培養(yǎng)[14]，以健康的組培苗葉片作為實驗材料。

1.2 實驗方法

1.2.1葉片的處理和培養(yǎng)

選取生長健壯的樟葉越桔無菌組培苗，在無菌條件下將健康葉片 (10 mm × 15 mm) 取下，將葉片的正面劃傷，葉片的背面緊貼培養(yǎng)基進行培養(yǎng)。以下各實驗中每培養(yǎng)瓶各接種3枚葉片，每個處理均重復(fù)10瓶，置于25 ℃、暗培養(yǎng)或光照培養(yǎng) (光照強度1 000～4 000 lx，光照時間12 h/d) 條件下繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.2不定根生長培養(yǎng)時間選擇

1.2.3植物生長調(diào)節(jié)劑配比選擇

分別配制不同質(zhì)量濃度 (0.1、0.3、0.5、1.0、2.0 mg/L) 生長激素 (IBA和NAA) 的WPM + 30 g/L白砂糖培養(yǎng)基，接種葉片后各處理組暗培養(yǎng)15 d，第30天統(tǒng)計生根率和根鮮質(zhì)量。

1.2.4不定根生長的碳源選擇

分別配制不同質(zhì)量濃度 (10、20、30、40、50 g/L) 不同碳源 (蔗糖、白砂糖和葡萄糖) 的WPM +0.3 mg/L IBA培養(yǎng)基，接種葉片后各處理組暗培養(yǎng)15 d，第30天統(tǒng)計生根率和根鮮質(zhì)量。

1.2.5不定根生長的培養(yǎng)基選擇

分別配制含0.3 mg/L IBA和30 g/L白砂糖的1/4MS、1/2MS、MS、1/2WPM、WPM培養(yǎng)基，接種葉片后各處理組暗培養(yǎng)15 d，第30天統(tǒng)計生根率和根鮮質(zhì)量。

1.2.6正交實驗

一般來說，體育小鎮(zhèn)的空間布局由點、軸、網(wǎng)和域等4個基本要素構(gòu)成，這4個要素不是簡單意義的空間形態(tài)，而是有著特定內(nèi)涵和功能的區(qū)域[5]，每一要素的內(nèi)涵及布局要求如表1所示。

采用L9(33) 設(shè)計，選取暗培養(yǎng)時間、激素和碳源組合進行3因素3水平的正交實驗。每瓶接種3枚葉片，每個處理重復(fù)10瓶，第30天統(tǒng)計生根率和根鮮質(zhì)量，以篩選樟葉越桔葉片誘導(dǎo)不定根最優(yōu)條件。

2 結(jié)果與分析

2.1 暗培養(yǎng)時間對不定根的影響

暗培養(yǎng)時間對樟葉越桔不定根生長的影響結(jié)果見表1。

表1 暗培養(yǎng)時間對樟葉越桔不定根的影響Table 1 Effects of dark culture time on adventitious roots of V.dunalianum

注：接種葉片數(shù)均為30片。

由表1可知，隨著暗培養(yǎng)0～20 d時間的增加，不定根的鮮質(zhì)量和生根率也隨之增加，在暗培養(yǎng)20 d處理組中，其不定根的鮮質(zhì)量最大，表現(xiàn)為出根時間一致，在葉片傷口處出根密集，根長且有側(cè)根發(fā)生。當(dāng)暗培養(yǎng)時間超過20 d后，不定根的鮮質(zhì)量和生根率呈現(xiàn)下降趨勢，可能是由于暗培養(yǎng)時間過長導(dǎo)致根生長勢減弱所致。

2.2 不同植物生長調(diào)節(jié)劑對不定根的影響

不同植物生長調(diào)節(jié)劑對葉片誘導(dǎo)生根的影響見表2。

表2 不同植物生長調(diào)節(jié)劑對葉片誘導(dǎo)生根的影響Table 2 Effects of different hormone concentration on adventitious roots of V.dunalianum

注：接種葉片數(shù)均為30片。

由表2可知，用IBA和NAA處理樟葉越桔葉片都具有誘導(dǎo)生根的作用。隨著IBA和NAA濃度的增加，根的鮮質(zhì)量是先增加后減小。當(dāng)IBA為0.5 mg/L時，根的鮮質(zhì)量最大，且根較長，根簇密集，密布葉片，0.3 mg/L和1.0 mg/L IBA誘導(dǎo)的根鮮質(zhì)量次之。當(dāng)NAA分別為0.1 mg/L和0.3 mg/L時，其根的發(fā)生和根鮮質(zhì)量無明顯差異。當(dāng)2.0 mg/L NAA時，葉片卷曲，褐化，沒有根的發(fā)生。由于低濃度植物生長調(diào)節(jié)劑能夠促進根的發(fā)生，而高濃度則導(dǎo)致葉片褐化和抑制根的生長，因此IBA為0.3、0.5、1.0 mg/L時，樟葉越桔不定根的誘導(dǎo)效果較好。

2.3 不同碳源對樟葉越桔不定根的影響

不同碳源對樟葉越桔不定根的影響見表3。

表3 不同碳源對樟葉越桔不定根的影響Table 3 Effects of different carbon source on adventitious roots of V.dunalianum

注：接種葉片數(shù)均為30片。

由表3可知，根的鮮質(zhì)量隨著碳源質(zhì)量的增加而增加。白砂糖、蔗糖、葡萄糖分別為50 g/L時，其各自的不定根鮮質(zhì)量最大，且均表現(xiàn)為根簇密集，較長，有彎曲狀，具側(cè)根。當(dāng)40 g/L白砂糖作為碳源時，不定根的鮮質(zhì)量高于同質(zhì)量蔗糖下的鮮質(zhì)量。從綜合經(jīng)濟成本和不定根生長情況考慮，選擇白砂糖作為碳源為宜。

2.4 不同培養(yǎng)基對不定根的影響

不同培養(yǎng)基對樟葉越桔不定根的影響見表4。

表4 不同培養(yǎng)基對樟葉越桔不定根的影響Table 4 Effects of different culture medium on adventitious roots of V.dunalianum

注：接種葉片數(shù)均為30片。

由表4可知，WPM和MS培養(yǎng)基都能使樟葉越桔葉片誘導(dǎo)生根，其中WPM培養(yǎng)基的鮮質(zhì)量最大，1/4MS培養(yǎng)基的鮮質(zhì)量最小。因此，選用WPM作為樟葉越桔不定根誘導(dǎo)基本培養(yǎng)基。

2.5 正交實驗結(jié)果

不同培養(yǎng)條件對樟葉越桔不定根的影響見表5。

由表5可知，3因素3水平9個正交處理組中，其根的鮮質(zhì)量都較高。方差分析顯示，暗培養(yǎng)時間、IBA濃度和碳源質(zhì)量三者之間對于樟葉越桔不定根誘導(dǎo)的影響不顯著。在3個因素中，對不定根的影響大小依次為IBA濃度 > 暗培養(yǎng)時間 > 碳源質(zhì)量。其中處理組WPM + 1.0 mg/L IBA + 50 g/L白砂糖 + 暗培養(yǎng)15 d培養(yǎng)條件對不定根誘導(dǎo)效果最佳，不定根平均鮮質(zhì)量可達56.6 mg，生根率達96.7%，且出根一致，根簇密集，根底部黃色，根尖白色，較長，具側(cè)根 (圖1)。

表5 不同培養(yǎng)條件對樟葉越桔不定根的影響Table 5 Effects of different culture conditions on adventitious roots of V.dunalianum

A. 暗培養(yǎng)20 d；B. 0.5 mg/L IBA；C. 50 g/L白砂糖；D. WPM培養(yǎng)基；E. WPM + 1.0 mg/L IBA + 50 g/L白砂糖 + 暗培養(yǎng)15 d。

圖1樟葉越桔不定根
Fig.1 The adventitious roots ofV.dunalianum

3 結(jié)論與討論

本實驗通過研究不同暗培養(yǎng)時間、激素配比、碳源以及培養(yǎng)基等影響因子對不定根誘導(dǎo)的影響，建立了樟葉越桔葉片誘導(dǎo)不定根的培養(yǎng)體系，并采用正交試驗設(shè)計篩選出樟葉越桔葉片直接誘導(dǎo)不定根的最適條件為WPM + 1.0 mg/L IBA + 50.0 g/L白砂糖 + 暗培養(yǎng)15 d，其生根率達96.7%，每培養(yǎng)瓶平均根鮮質(zhì)量達56.6 mg。

暗培養(yǎng)對于根的誘導(dǎo)具有決定性的作用，孫清榮等[15]對中國櫻桃 (Cerasuspseudocerasus) 生根進行研究發(fā)現(xiàn)，一定時間的暗培養(yǎng)比未做暗處理的生根率明顯提高。宋剛等[16]認(rèn)為藍莓 (Vacciniumspp.) 組培苗在暗培養(yǎng)條件下有利于細(xì)胞快速完成脫分化并促使根的分化形成，隨著暗培養(yǎng)時間的增長，根的生物量也逐漸增加，但暗培養(yǎng)時間過長會導(dǎo)致根生長勢減弱。本實驗結(jié)果表明，暗培養(yǎng)15、20 d和25 d，不定根的鮮質(zhì)量較大，出根時間一致，在葉片傷口處出根密集，根長且有側(cè)根發(fā)生，這與魏國芹等[17]的研究結(jié)果相似。IBA對樟葉越桔不定根的誘導(dǎo)能力比NAA強，較低質(zhì)量濃度的IBA (0.5 mg/L) 即能獲得較高的生根率 (93.3%) 和根鮮質(zhì)量 (51.2 mg)，這與高先富等[9]對三七 (P.notoginseng) 不定根的研究結(jié)果和孫書偉[18]在藍莓試管生根中發(fā)現(xiàn)IBA是誘導(dǎo)藍莓組培養(yǎng)苗生根最好的外源生長素相符合。本實驗比較了不同質(zhì)量濃度下的白砂糖、蔗糖、葡萄糖作為碳源的不定根誘導(dǎo)情況，并發(fā)現(xiàn)WPM培養(yǎng)基的不定根誘導(dǎo)效果明顯優(yōu)于MS培養(yǎng)基，同樣也與馬懷宇等[19]對高叢藍莓 (Vacciniumcorymbosum) 離體葉片再生的研究結(jié)果相符合。

在植物組織培養(yǎng)中，不定根的誘導(dǎo)通常是首先通過植物葉片誘導(dǎo)出叢生芽形成植株，再由形成植株的莖段進一步誘導(dǎo)不定根的生成。席培宇等[20]采用金鐵鎖莖段作為外植體建立植株再生，進而促進莖段不定根的生長。近年的文獻報道發(fā)現(xiàn)，同屬植物藍莓的組培苗試管內(nèi)生根較慢，生根率低，而組培苗試管外生根則相對延長了馴化移栽成活時間，且對技術(shù)人員要求更高，需具備更好的管理經(jīng)驗[19,21-22]。本研究發(fā)現(xiàn)，樟葉越桔組培苗葉片生根相對較為容易，生根率高，其葉片不定根發(fā)生的能力較強，生根速度快，出根整齊。本實驗建立并優(yōu)化了樟葉越桔葉片直接誘導(dǎo)不定根的培養(yǎng)體系，將為進一步開展咖啡酰熊果苷類物質(zhì)進一步的生產(chǎn)調(diào)控及其開發(fā)利用提供基礎(chǔ)。此外，本實驗還發(fā)現(xiàn)個別葉片誘導(dǎo)出的不定根稀疏甚至不產(chǎn)生不定根，導(dǎo)致各試驗處理組10個重復(fù)中根鮮質(zhì)量的相對平均偏差較大，這很可能是因為各葉片切口處不定根起源細(xì)胞周圍的內(nèi)源激素積累水平不一所致[23]，值得進一步開展其不定根發(fā)生機理的深入研究。

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