大黃酚對局灶性腦缺血再灌注小鼠腦組織p-CREB、BDNF和p-STAT3的影響

房亞蘭 黃語悠 趙詠梅* 李錦程 段云霞 高 利 羅玉敏

(1.北京市平谷區(qū)醫(yī)院全科醫(yī)療科，北京 101200；2. 首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院 北京市老年病醫(yī)療研究中心，北京 100053)

缺血性卒中嚴(yán)重威脅人類健康，目前已成為我國國民死亡的首要原因[1]。然而臨床上治療腦缺血的藥物非常有限，唯一有效的治療方法是在有限的時(shí)間窗內(nèi)應(yīng)用重組組織型纖溶酶原激活劑進(jìn)行溶栓。中藥大黃在我國用于治療腦缺血損傷由來已久，大黃酚(chrysophanol, CHR)是自大黃中提取的一種活性成分[2]，近年來的研究[2-4]表明，CHR能顯著減少腦缺血再灌注損傷，但其相關(guān)神經(jīng)保護(hù)機(jī)制尚不完全清楚。

環(huán)磷酸腺苷反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(cyclic AMP response element binding protein，CREB)是細(xì)胞核內(nèi)的一種轉(zhuǎn)錄因子，其磷酸化程度與細(xì)胞對缺氧導(dǎo)致死亡的耐受性相關(guān)[5-6]。研究[7]表明，腦缺血損傷抑制磷酸化CREB(phosphorylated CREB，p-CREB)產(chǎn)生。給予永久性大腦中動(dòng)脈梗死(middle cerebral artery occlusion, MCAO)小鼠西洛他唑治療后，神經(jīng)元內(nèi)p-CREB蛋白表達(dá)增加，細(xì)胞凋亡減少，腦梗死體積顯著減小[5]。腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain derived neurotrophic factor，BDNF)是CREB的下游調(diào)控因子，作為大腦發(fā)育過程及成人期的主要神經(jīng)營養(yǎng)因子，廣泛分布于大腦皮質(zhì)、海馬和紋狀體，能促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)，在腦缺血損傷中發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[8]。給予腦缺血再灌注大鼠三七皂甙R1治療可能通過上調(diào)BDNF基因在海馬的表達(dá)水平，增加抗凋亡因子表達(dá)，從而保護(hù)腦缺血再灌注大鼠的海馬神經(jīng)元，減少腦梗死體積[9]。

p-CREB和BDNF在腦缺血?jiǎng)游锬Ｐ秃湍X缺血患者中表達(dá)失調(diào)，與腦缺血損傷密切相關(guān)，被認(rèn)為是未來治療腦缺血的重要靶點(diǎn)[10]。轉(zhuǎn)錄激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3, STAT3)是一種廣泛存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的DNA結(jié)合蛋白，在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄過程中發(fā)揮重要作用。有文獻(xiàn)[11]報(bào)道，STAT3聯(lián)結(jié)BDNF后可發(fā)揮神經(jīng)可塑性。磷酸化STAT3(phosphorylated STAT3，p-STAT3)是STAT3的激活形式，p-STAT3參與腦缺血損傷的細(xì)胞死亡、凋亡過程[12]。研究[13]表明，在腦缺血再灌注大鼠的缺血側(cè)海馬組織，p-STAT3顯著增加。因此，本研究采用 MCAO再灌注模型小鼠，觀察CHR對腦缺血小鼠再灌注后14 d CREB、BDNF和p-STAT3表達(dá)的影響，從而進(jìn)一步探討CHR長期拮抗腦缺血再灌注損傷的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要儀器設(shè)備

麻醉機(jī)(Harvard Apparatus公司，美國)、小動(dòng)物手術(shù)顯微鏡(Carl Zeiss公司，德國)、雙極電凝器(天業(yè)德威醫(yī)療設(shè)備有限公司)、反饋式溫度調(diào)節(jié)儀(CMA 150， Carnegie Medicin公司，瑞典)、熒光顯微鏡(Nikon公司，日本)。

1.2 試劑

CHR(中國食品藥品檢定研究院)；Tween 80(Sigma公司，美國)；恩氟烷(河北一品制藥有限公司)； p-CREB抗體(北京中杉金橋公司)；BDNF抗體(Abcam公司，美國)；NeuN抗體(Millipore公司，美國)；p-STAT3抗體(CST公司，美國)；β-actin抗體(Santa cruz公司，美國)等。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

2月齡C57BL健康雄性小鼠，體質(zhì)量(23.5±1)g，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號：SCXK(京) 2012-0001(北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物公司)，飼養(yǎng)于SPF級動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室。按照數(shù)字表法隨機(jī)將18只小鼠分為3組(每組6只)：假手術(shù)(Sham)組、MCAO組、CHR組。CHR溶于含1%(體積分?jǐn)?shù))Tween 80和1%(體積分?jǐn)?shù))DMSO的0.9%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))氯化鈉注射液中，從造模當(dāng)天至再灌注后14 d，CHR組小鼠按0.1 mg/kg腹腔注射CHR，每天1次， Sham組和MCAO組小鼠腹腔注射同等體積的含1%(體積分?jǐn)?shù)) Tween 80和1%(體積分?jǐn)?shù)) DMSO的0.9%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))氯化鈉注射液。

1.4 動(dòng)物模型制作

MCAO模型按改良ZeaLonga法制備。將恩氟烷混合于70%(體積分?jǐn)?shù))N2O和30%(體積分?jǐn)?shù))O2中，先用5%(體積分?jǐn)?shù))恩氟烷誘導(dǎo)麻醉，再用面罩吸入2%(體積分?jǐn)?shù))恩氟烷維持麻醉。于小鼠頸部沿正中線切口，分離右側(cè)頸總動(dòng)脈、頸內(nèi)動(dòng)脈及頸外動(dòng)脈，將頭端直徑0.38 mm的尼龍線栓由頸外動(dòng)脈殘端插入頸內(nèi)動(dòng)脈，至頸外動(dòng)脈和頸內(nèi)動(dòng)脈分叉約1 cm處。手術(shù)過程中使用反饋性控溫毯監(jiān)測實(shí)驗(yàn)小鼠肛溫，維持在(37.0±0.5) ℃。缺血45 min后，小心地將線栓拔出進(jìn)行再灌注。術(shù)后小鼠飼養(yǎng)于SPF級動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室，自由進(jìn)食飲水。

1.5 免疫熒光雙標(biāo)

于造模后14 d，各組小鼠經(jīng)腹腔注射水合氯醛麻醉后，快速斷頭取腦，經(jīng)4%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))多聚甲醛固定48 h后，于30%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))蔗糖脫水24 h，將腦組織行連續(xù)冰凍切片(厚度為20 μm)，切片經(jīng)PBS洗后，用含0.2%(體積分?jǐn)?shù))TritonX-100的PBS孵育10 min，再經(jīng)PBS洗后，于室溫下用5 %(體積分?jǐn)?shù))山羊血清封閉30 min，滴加一抗(p-CREB與NeuN鼠多克隆抗體 1∶300，或BDNF與NeuN鼠多克隆抗體 1∶300)，4 ℃孵育過夜。次日取出切片，經(jīng)PBS洗后，滴加山羊抗鼠和山羊抗兔熒光二抗(1∶300)，避光于室溫下孵育1 h。經(jīng)PBS洗后，最后用含DAPI(4′,6-diamidino-2-phenylindole)的封片劑進(jìn)行封片。于熒光顯微鏡下觀察腦皮質(zhì)缺血半暗帶區(qū)[14]。每組選取5只小鼠同一位置的腦切片3張，在相同放大倍數(shù)、相同參數(shù)條件下，每張腦組織冰凍切片隨機(jī)選取4個(gè)視野照相，使用NIS Element軟件統(tǒng)計(jì)p-CREB和BDNF陽性細(xì)胞數(shù)目。

1.6 Western blotting

再灌注14 d后，各組小鼠快速斷頭取腦，立即于前囟0到-0.1切取1 mm厚的腦組織冠狀切片，將缺血側(cè)腦組織在含有蛋白酶抑制劑的裂解緩沖液中于冰上勻漿，經(jīng)30 min冰浴后，4 ℃條件下12 000 g離心30 min取上清。用BCA法進(jìn)行蛋白濃度測定。將上樣緩沖液加入樣品煮沸10 min，然后進(jìn)行SDS-PAGE電泳，濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜90 min，于5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))脫脂牛奶室溫下封閉1 h，加入一抗(p-STAT3 1∶1 000，β-actin 1：1 000)，4 ℃孵育過夜，用TBST洗膜3次，室溫下于HRP標(biāo)記的二抗中孵育1 h，TBST洗膜3次，用ECL化學(xué)發(fā)光液顯色，并用化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)掃描，蛋白條帶用Image J圖像處理軟件進(jìn)行定量分析。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 CHR促進(jìn)MCAO小鼠腦缺血半暗帶區(qū)p-CREB表達(dá)

免疫熒光染色結(jié)果顯示，Sham組小鼠腦組織內(nèi)可見p-CREB紅色熒光染色，而MCAO組小鼠腦缺血半暗帶區(qū)p-CREB染色陽性細(xì)胞顯著減少，CHR組小鼠腦缺血半暗帶區(qū)p-CREB染色陽性細(xì)胞數(shù)目比MCAO組顯著增加(圖1 A)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖1 B)。免疫熒光雙標(biāo)染色結(jié)果可見，在MCAO小鼠腦缺血半暗帶區(qū)內(nèi)可見p-CREB陽性細(xì)胞及NeuN陽性細(xì)胞，其中p-CREB陽性細(xì)胞為紅色熒光，NeuN陽性細(xì)胞為綠色熒光。所有細(xì)胞的胞核為藍(lán)色熒光。圖像合并后，綠色與紅色熒光重合，表明p-CREB與神經(jīng)元共定位，即腦缺血再灌注后p-CREB在缺血半暗帶區(qū)神經(jīng)元內(nèi)表達(dá)(圖1 A)。

2.2 CHR促進(jìn)MCAO小鼠腦缺血半暗帶區(qū)BDNF表達(dá)

免疫熒光染色結(jié)果顯示，Sham組小鼠腦組織內(nèi)可見BDNF紅色熒光染色，分布于大腦皮質(zhì)、海馬及紋狀體，MCAO組小鼠腦缺血半暗帶區(qū)BDNF染色陽性細(xì)胞比Sham組明顯減少，CHR組小鼠腦缺血半暗帶區(qū)BDNF的表達(dá)比MCAO組明顯增加(圖2 A)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖2 B)。在MCAO小鼠腦缺血半暗帶區(qū)內(nèi)可見BDNF陽性細(xì)胞為紅色熒光及NeuN陽性細(xì)胞為綠色熒光，細(xì)胞核為藍(lán)色熒光。圖像合并后，綠色與紅色熒光重合，表明BDNF與神經(jīng)元共定位，即腦缺血再灌注后BDNF在缺血半暗帶區(qū)神經(jīng)元內(nèi)表達(dá)(圖2 A)。

圖1 Sham、MCAO及CHR各組小鼠再灌注14 d腦缺血半暗帶區(qū)p-CREB/NeuN免疫熒光雙標(biāo)結(jié)果Fig.1 The double immunofluorescence labeling of p-CREB (red) / NeuN (green) in cerebralischemia penumbra of Sham, MCAO and CHR groups mice 14 d after reperfusion

A：representative double immunofluorescence labeling of p-CREB (red) / NeuN (green) on 14 d after ischemia/reperfusion. Bar=20μm.B: quantification of p-CREB-positive cells. (n=5, mean ± SD)*P<0.05vssham group,#P<0.05vsMCAO group;MCAO: middle cerebral artery occlusion;CHR:chrysophanol;p-CREB:phosphorylated cyclic AMP response element binding protein;DAPI: 4′,6-diamidino-2-phenylindole.

圖2 Sham、MCAO及CHR各組小鼠再灌注14 d腦缺血半暗帶區(qū)BDNF/NeuN免疫熒光雙標(biāo)結(jié)果Fig.2 The double immunofluorescence labeling of BDNF (red) / NeuN (green) in cerebral ischemia penumbra of Sham, MCAO and CHR groups mice 14 d after reperfusion

A：representative double immunofluorescence labeling of BDNF (red) / NeuN (green) on 14 d after ischemia/reperfusion. Bar=20μm.B: quantification of BDNF-positive cells. (n=5, mean ± SD)*P<0.05vsSham group,#P<0.05vsMCAO group;BDNF：brain derived neurotrophic factor；MCAO: middle cerebral artery occlusion;CHR:chrysophanol;DAPI: 4′,6-diamidino-2-phenylindole.

2.3 CHR抑制MCAO小鼠缺血側(cè)腦組織p-STAT3蛋白表達(dá)

Western blotting結(jié)果顯示，與Sham組相比，MCAO組小鼠缺血側(cè)腦組織的p-STAT3蛋白表達(dá)水平顯著增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖3)。CHR組小鼠缺血側(cè)腦組織p-STAT3蛋白水平比MCAO組顯著減少，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖3)。

3 討論

炎性反應(yīng)、氧化應(yīng)激、興奮性氨基酸毒性等多種機(jī)制參與腦缺血/再灌注損傷過程。本課題組的研究[2]表明，腦缺血再灌注后14 d，CHR提高了MCAO小鼠生存率，改善神經(jīng)功能評分，減少腦組織丟失，從而發(fā)揮長期的神經(jīng)保護(hù)作用。這可能與CHR抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，進(jìn)而抑制腦缺血半暗帶區(qū)內(nèi)NF-κΒ活化，減少下游炎性反應(yīng)因子表達(dá)有關(guān)[2-3]。然而對于缺血性腦損傷過程中，CHR發(fā)揮長期腦保護(hù)作用的機(jī)制尚不完全清楚。本研究采用免疫熒光染色方法檢測MCAO小鼠腦缺血半暗帶區(qū)p-CREB和BDNF蛋白表達(dá)水平，Western blotting檢測MCAO小鼠缺血側(cè)腦組織p-STAT3的蛋白水平，從而探討CHR拮抗腦缺血再灌注損傷的相關(guān)機(jī)制。

圖3 Sham、MCAO及CHR各組小鼠再灌注14 d缺血側(cè)腦組織p-STAT3的蛋白免疫印跡結(jié)果Fig.3 Western blotting results of p-STAT3 in ischemiabrain tissue of Sham, MCAO and CHR groupsmice 14 d after reperfusion

Western blotting results of p-STAT3. β-actin functions as loading control.*P<0.05vsSham group,#P<0.05vsMCAO group (n=5, mean±SD);MCAO: middle cerebral artery occlusion;CHR:chrysophanol;p-STAT3:phosphorylated signal transducer and activator of transcription 3.

研究[15]表明，p-CREB誘導(dǎo)激活與神經(jīng)元存活相關(guān)的多種靶基因。為闡明CHR保護(hù)腦缺血損傷的機(jī)制，本研究觀察了CHR對MCAO小鼠腦缺血半暗帶區(qū)p-CREB表達(dá)的影響。免疫熒光染色結(jié)果顯示，腦缺血再灌注14 d，MCAO組小鼠缺血半暗帶區(qū)p-CREB蛋白水平較Sham組顯著降低，p-CREB介導(dǎo)一些神經(jīng)營養(yǎng)因子和神經(jīng)保護(hù)蛋白的轉(zhuǎn)錄，對修復(fù)神經(jīng)細(xì)胞損傷有重要作用，有助于神經(jīng)細(xì)胞存活[16]，因此，本研究結(jié)果提示短暫性局灶性腦缺血再灌注損傷抑制p-CREB產(chǎn)生，導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞損傷。給予CHR治療的MCAO小鼠腦缺血半暗帶區(qū)p-CREB蛋白表達(dá)顯著增加，表明CHR促進(jìn)p-CREB產(chǎn)生，結(jié)合課題組之前的研究[2]結(jié)果，給予CHR治療14 d能明顯改善MCAO小鼠神經(jīng)功能缺損，減少細(xì)胞凋亡。提示CHR可能是通過促進(jìn)p-CREB蛋白表達(dá)，減少神經(jīng)細(xì)胞凋亡，從而減輕腦缺血損傷。

內(nèi)源性神經(jīng)保護(hù)劑BDNF是由p-CREB激活的神經(jīng)營養(yǎng)因子之一[16]，為進(jìn)一步闡明CHR拮抗腦缺血損傷的機(jī)制，本研究觀察了CHR對MCAO小鼠腦缺血半暗帶區(qū)BDNF表達(dá)水平的影響。結(jié)果顯示，腦缺血再灌注14 d，MCAO組小鼠缺血半暗帶區(qū)BDNF蛋白水平較Sham組顯著降低，提示腦缺血再灌注損傷抑制內(nèi)源性BDNF產(chǎn)生，促進(jìn)神經(jīng)元死亡，加重腦缺血再灌注損傷。p-CREB能促進(jìn)BDNF等神經(jīng)營養(yǎng)因子產(chǎn)生[17]，增加BDNF水平或激活BDNF相關(guān)信號通路有助于恢復(fù)卒中導(dǎo)致的神經(jīng)功能缺損[18]，給予CHR治療的MCAO小鼠腦缺血半暗帶區(qū)BDNF蛋白表達(dá)顯著增加，提示CHR可能通過上調(diào)p-CREB表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)內(nèi)源性BDNF產(chǎn)生，發(fā)揮長期腦保護(hù)作用。

有研究[19]顯示，腦缺血后BDNF與TNF-α在海馬小膠質(zhì)細(xì)胞中共定位表達(dá)，BDNF能抑制TNF-α蛋白及mRNA的表達(dá)[20]，表明BDNF參與調(diào)節(jié)炎性反應(yīng)。結(jié)合本課題組之前的研究[2]結(jié)果，CHR能顯著抑制TNF-α等炎性反應(yīng)因子表達(dá)，提示CHR可能通過促進(jìn)BDNF產(chǎn)生，進(jìn)而抑制炎性反應(yīng)，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。

P-CREB能促進(jìn)BDNF等神經(jīng)營養(yǎng)因子產(chǎn)生，提高神經(jīng)元存活率，改善突觸功能[17]。為闡明MCAO小鼠腦內(nèi)p-CREB、BDNF在缺血半暗帶區(qū)神經(jīng)元中表達(dá)水平的變化，本研究分別將p-CREB、BDNF與神經(jīng)元標(biāo)志物NeuN共染。免疫熒光雙標(biāo)染色結(jié)果顯示，p-CREB、BDNF分別與NeuN共定位，表明p-CREB、BDNF在神經(jīng)元內(nèi)表達(dá)，提示p-CREB、BDNF影響腦缺血后神經(jīng)元損傷。

STAT3介導(dǎo)許多細(xì)胞因子驅(qū)動(dòng)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。STAT3磷酸化后被激活，p-STAT3促進(jìn)暫時(shí)性局灶性腦缺血后的神經(jīng)元損傷[21]。在本研究中，筆者通過Western blotting檢測發(fā)現(xiàn)，腦缺血再灌注14 d，MCAO組小鼠缺血側(cè)腦組織p-STAT3蛋白比Sham組顯著增多。局灶性缺血后，p-STAT3可與DNA結(jié)合誘導(dǎo)多種基因表達(dá)，導(dǎo)致神經(jīng)炎性反應(yīng)、細(xì)胞凋亡和腦損傷[12]。因此本研究結(jié)果提示，腦缺血再灌注促進(jìn)p-STAT3表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞凋亡，因此，p-STAT3參與腦缺血再灌注損傷。文獻(xiàn)[22]報(bào)道，肢體遠(yuǎn)端缺血后處理可調(diào)節(jié)反應(yīng)性星形細(xì)胞可塑性并抑制STAT3磷酸化，以促進(jìn)缺血性卒中后的神經(jīng)功能恢復(fù)。本研究中給予CHR治療的MCAO小鼠缺血側(cè)腦組織p-STAT3蛋白顯著減少，表明CHR可能通過抑制缺血損傷后腦組織內(nèi)p-STAT3表達(dá)，從而發(fā)揮長期神經(jīng)保護(hù)作用。

綜上，本研究結(jié)果表明，給予CHR治療能促進(jìn)腦缺血再灌注損傷過程半暗帶區(qū)p-CREB產(chǎn)生，上調(diào)BDNF表達(dá)，進(jìn)而抑制炎性反應(yīng)，并抑制缺血側(cè)腦組織p-STAT3蛋白表達(dá)，減少神經(jīng)元死亡，發(fā)揮長期腦保護(hù)作用。

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