枸櫞酸碘溶液對4種病原菌的載體消毒效果研究

李亞菲，曾振靈，梁先明，譚志堅，賈 諫

(1.華南農(nóng)業(yè)大學獸醫(yī)學院，廣州 510642；2.廣東省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)產(chǎn)品公共監(jiān)測中心，廣州 510640；3.中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081；4.佛山市正典生物技術(shù)有限公司，廣東佛山 528138)

現(xiàn)代化養(yǎng)殖業(yè)中，養(yǎng)殖場使用消毒劑凈化畜禽生長環(huán)境、消除病原微生物、減少病原菌的入侵、阻止疾病的引入和傳播，從而預防和控制畜禽傳染病的發(fā)生[1-3]?？茖W選擇和合理使用消毒劑，對于做好養(yǎng)殖場的消毒凈化工作以及疫病的預防、控制、撲滅起到至關重要的作用[4]。碘類化合物作為消毒劑的一種，已廣泛應用于生產(chǎn)，其作用原理是通過氧化、碘代反應破壞細胞結(jié)構(gòu)和酶系統(tǒng)等，從而達到殺菌目的[5-6]。有研究表明，檸檬酸作為一種弱有機酸，也具有一定的抗菌作用[7]。將兩者制成復方消毒劑，克服了含碘消毒劑不穩(wěn)定、易受環(huán)境酸堿性影響且容易產(chǎn)生刺激性和腐蝕性等缺點，以期達到高效、廣譜、低毒的特點。我國農(nóng)業(yè)部1992年頒布了《獸用消毒劑鑒定技術(shù)規(guī)范》，詳細介紹了評價獸用消毒劑的試驗方法。試驗方法與衛(wèi)生部頒布的《消毒技術(shù)規(guī)范》相似，包括對細菌、芽孢、病毒作用效果的試驗方法。根據(jù)以上標準，本研究評價復方枸櫞酸碘溶液對4種病原菌的消毒效果，同時選擇國外產(chǎn)品百勝-30溶液作為對照，進行載體消毒試驗，以期為該藥在臨床的應用提供依據(jù)和參考。

1 材 料

1.1 供試藥品 枸櫞酸碘溶液：含碘2.0%，佛山正典生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)，批號1211070。百勝-30溶液：含碘3.0%，英國Evans生產(chǎn)，批號14744。

1.2 供試菌株 大腸桿菌8099、金黃色葡萄球菌ATCC6538、馬腺疫鏈球菌獸疫亞種強毒CVCC556、蠟樣芽孢桿菌8008，均為專用消毒劑鑒定菌種，購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。

1.3 主要試劑 營養(yǎng)肉湯、營養(yǎng)瓊脂、胰蛋白胨大豆肉湯、胰蛋白胨大豆瓊脂，購自廣州環(huán)凱微生物科技有限公司，新生小牛血清購自北京普博欣生物科技有限公司，無菌脫纖維綿羊血購自廣州蕊特生物有限公司，其他分析純試劑磷酸氫二鈉、氯化鈉購自廣州化學試劑廠，無水氯化鈣和氯化鎂購自天津市科密歐化學試劑有限公司，磷酸二氫鉀購自成都市科龍化工試劑廠，吐溫-80購自天津市化學試劑三廠，硫代硫酸鈉購自天津市大茂化學試劑廠。

1.4 主要儀器 微量移液器：法國吉爾森公司；超凈工作臺：蘇州凈化設備有限公司；SN510C高壓滅菌鍋：日本YAMATO公司；FA2004N型電子分析天平：上海精密科學儀器有限公司；數(shù)顯隔熱式培養(yǎng)箱：上海錦屏儀器儀表有限公司通州公司；HZQ-F160全溫振蕩培養(yǎng)箱：揚州市培英實驗儀器有限公司；渦旋混合器：德國IKA公司；電子計時器：杭州精誠三合實業(yè)有限公司；顯微鏡：日本OLYMPUS公司。

1.5 溶液配制 標準硬水(硬度342 mg/L)：無水氯化鈣0.304 g，氯化鎂0.139 g，蒸餾水加至1000 mL，121 ℃滅菌20 min即可。磷酸鹽緩沖溶液(0.03 mol/L，pH 7.2)：十二水合磷酸氫二鈉7.13 g，磷酸二氫鉀1.36 g，蒸餾水加至1000 mL，121 ℃滅菌20 min即可。

2 試驗方法

載體消毒試驗方法，根據(jù)試驗指導原則進行[8]。

2.1 菌種的制備

2.1.1 細菌繁殖體懸液的制備 取凍干菌種管，在無菌操作下打開，加入適量營養(yǎng)肉湯，輕柔吹吸數(shù)次，使菌種融化分散。接種菌懸液于合適的液體培養(yǎng)基，置37 ℃培養(yǎng)18～24 h。用接種環(huán)取第1代培養(yǎng)的菌懸液，劃線接種于合適的固體培養(yǎng)基平板上，于37 ℃培養(yǎng) 18～24 h。挑取上述第2代培養(yǎng)物中典型菌落，接種于合適的固體培養(yǎng)基平板上，于37 ℃培養(yǎng)18～24 h，即為第3代培養(yǎng)物。取第3～14代的固體培養(yǎng)基平板上的新鮮培養(yǎng)物(18～24 h)進行試驗。將上述經(jīng)傳代后的菌種接種到合適的液體培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)18～24 h即得到細菌懸液。懸液應當天使用不得過夜。

2.1.2 細菌芽孢懸液的制備 取凍干菌種管，在無菌操作下打開，加入適量營養(yǎng)肉湯，輕柔吹吸數(shù)次，使菌種融化分散。接種菌懸液于合適的液體培養(yǎng)基，置37 ℃培養(yǎng)18～24 h。用接種環(huán)取第1代培養(yǎng)的菌懸液，劃線接種于合適的固體培養(yǎng)基平板上，于37 ℃培養(yǎng) 18～24 h。挑取上述第2代培養(yǎng)物中典型菌落，接種于合適的固體培養(yǎng)基平板上，于37 ℃培養(yǎng)5～7 d后挑取少許菌苔作芽孢染色鏡檢。當每個視野內(nèi)的芽孢數(shù)達90%～95%以上時，可收集芽孢。

芽孢染色方法：①用接種環(huán)蘸取菌樣涂布于玻片上，待自然干燥。然后通過火焰加熱將菌固定于玻片上。②將涂片放入平皿內(nèi)，片上放兩層濾紙，滴加足量的 5.0% 孔雀綠水溶液。將平皿蓋好，放54～56 ℃ 條件下，加熱 30 min。取出，去濾紙，用自來水沖洗殘留孔雀綠溶液。③加0.5% 沙黃水溶液，染1 min。水洗，待干后鏡檢。芽孢呈綠色，菌體呈紅色。

芽孢收集方法：在無菌操作下于瓊脂培養(yǎng)基平板中加入4.0 mL無菌蒸餾水，使其浸潤菌苔，再以涂布棒輕輕推刮下菌苔(小心勿將瓊脂刮破)。吸取第1批洗下的菌懸液于無菌離心管中，再加4.0 mL無菌蒸餾水重復洗一遍。將第1和第2批洗下的菌懸液集中于一個無菌離心管內(nèi)，以3000 r/min速度離心10 min。棄上清液，加入少量無菌蒸餾水懸浮菌體，再離心，如此重復3次。最后將濃縮的芽孢懸液置于80 ℃水浴中 10 min，以殺滅殘余的細菌繁殖體。待冷至室溫后，保存于4 ℃冰箱中備用。芽孢懸液在使用時，應先進行活菌培養(yǎng)計數(shù)。

2.2 中和劑篩選實驗 以大腸桿菌8099和金黃色葡萄球菌ATCC6538為指示菌。中和劑擬采用含硫代硫酸鈉、吐溫-80的營養(yǎng)肉湯，使用前高壓滅菌。消毒劑用無菌硬水稀釋為一定濃度，稀釋液用0.03 mol/L的無菌磷酸鹽緩沖液。試驗按以下分組進行：第一組：消毒劑+菌懸液。吸取1.0 mL試驗菌懸液與4.0 mL消毒劑于試管內(nèi)，渦旋20 s，混勻。作用至預定時間，吸此樣液0.5 mL加于含有4.5 mL稀釋液的試管中，混勻。吸取該最終樣液0.1 mL涂布于瓊脂平皿中，置37 ℃培養(yǎng)計數(shù)。第二組：(消毒劑+菌懸液)+中和劑。吸取1.0 mL試驗菌懸液與4.0 mL消毒劑試管內(nèi)，混勻。作用至預定時間，吸此樣液0.5 mL加于含4.5 mL中和劑溶液試管中，渦旋20 s，混勻，作用10 min。吸取該最終樣液0.1 mL涂布于瓊脂平皿中，置37 ℃培養(yǎng)計數(shù)。第三組：中和劑+菌懸液。吸取0.1mL試驗菌懸液與4.9 mL中和劑于試管內(nèi)，渦旋20 s，混勻，作用10 min。吸取該最終樣液0.5 mL，用中和劑做10倍系列稀釋，選適宜稀釋度懸液，各吸取0.1 mL涂布于瓊脂平皿中，置37 ℃培養(yǎng)計數(shù)。第四組：中和產(chǎn)物+菌懸液。吸取0.1 mL試驗菌懸液與4.9 mL中和產(chǎn)物溶液(以0.4 mL消毒劑加4.5 mL中和劑，作用10 min 配制而成)于試管內(nèi)，混勻。作用10 min，吸取該最終樣液0.5 mL，用中和產(chǎn)物溶液做10倍系列稀釋，選適宜稀釋度懸液，各吸取0.1 mL涂布于瓊脂平皿中，置37 ℃培養(yǎng)計數(shù)。第五組：稀釋液+菌懸液。吸取0.1mL試驗菌懸液與4.9 mL稀釋液于試管內(nèi)，作用10 min。吸取該最終樣液0.5 mL，用稀釋液做10倍系列稀釋，選適宜稀釋度懸液，各吸取0.1 mL涂布于瓊脂平皿中，置37 ℃培養(yǎng)計數(shù)。第六組：空白對照組。分別取中和劑、稀釋液、無菌硬水0.1 mL涂布于瓊脂平皿中，置37 ℃培養(yǎng)計數(shù)。

2.3 載體消毒實驗

2.3.1 載體制作 根據(jù)試驗目的、可能性、需要以及制作的可行性，選用橡膠片作為載體制作菌片，用橡膠手套剪制成大小為0.5×1.0 cm2，先脫脂，即用1%洗衣粉溶液煮沸30 min，再用自來水洗凈。用蒸餾水再煮沸10 min，再漂洗3次。晾干。

2.3.2 染菌 把預先培養(yǎng)好的菌液稀釋好，將經(jīng)滅菌的載體片平鋪于無菌平皿內(nèi)，逐片滴加菌液。每片滴加菌液10 μL。用10 μL移液器接滅菌塑料吸頭滴染菌液，并用接種環(huán)涂勻整個載體表面，染菌105～106個以上，并使之分布均勻。滴染菌液后，染菌載體可置37 ℃溫箱內(nèi)干燥(約20～30 min)備用。

2.3.3 消毒 將消毒液按預先的濃度稀釋好，再將菌片浸入消毒液中，放入恒溫箱內(nèi)，立即記時。以0.03 mol/L磷酸鹽緩沖液代替消毒液，作為對照組。

2.3.4 中和與培養(yǎng) 定性試驗：作用預定時間后，將菌片分別放入含足量中和劑的試管，中和10 min，再取出放入液體培養(yǎng)基內(nèi)，置37 ℃培養(yǎng)24 h。若發(fā)生混濁即表示有細菌生長。必要時，可移植到固體培養(yǎng)基上，觀察菌落形態(tài)，或進行涂片染色鏡檢，以判斷生長的是否為試驗菌，以排除污染。若肉湯不變混濁，應繼續(xù)培養(yǎng)至第7天，若仍不混濁方可判為無菌生長。

定量試驗：根據(jù)定性試驗結(jié)果初步判定消毒劑作用時間和濃度，進行定量試驗。取出菌片放于有玻璃珠的中和液內(nèi)，振搖100次洗脫載體上的細菌，然后進行活菌計算及統(tǒng)計分析。以無菌生長管消毒液的最低濃度為最低殺菌有效濃度，以無菌生長管的最短消毒時間為該濃度殺菌最快有效時間。

殺菌率的計算：根據(jù)活菌計數(shù)的結(jié)果，計算殺菌率(Pt)。消毒t時的殺菌率(Pt)=[(n0-nt)/n0]×l00%，式中n0為消毒前或?qū)φ战M活菌數(shù)。nt為消毒后或?qū)嶒灲M活菌數(shù)。

3 結(jié)果與分析

3.1 中和劑鑒定試驗 中和劑的鑒定選擇大腸桿菌8099和金黃色葡萄球菌ATCC6538為代表進行試驗。試驗中所用消毒劑的濃度為殺菌試驗中使用的最高濃度，即針對大腸桿菌8099，2%檸檬酸碘溶液按1∶2500稀釋，百勝-30溶液按1∶3750稀釋。針對金黃色葡萄球菌ATCC6538，2%檸檬酸碘溶液按1∶5000稀釋，百勝-30溶液按1∶7500稀釋。

結(jié)果表明，含0.3%硫代硫酸鈉、1%吐溫-80的滅菌營養(yǎng)肉湯中和劑可以有效中和2%檸檬酸碘溶液。含0.5%硫代硫酸鈉、1%吐溫-80的滅菌營養(yǎng)肉湯中和劑可以有效中和劑百勝-30溶液。以上兩種中和劑、中和產(chǎn)物對細菌生長無明顯影響(表1)。

表1 中和劑鑒定試驗結(jié)果Tab 1 The test for the identification of neutralizer

試驗條件均為20±1 ℃，作用時間為5 min；以上結(jié)果為3次試驗的平均值

3.2 定性試驗結(jié)果 在室溫條件下(20 ℃左右)，在橡膠片載體上時，對于大腸桿菌8099，2%枸櫞酸碘溶液最低殺菌有效濃度為1∶320，該濃度的最短消毒時間為5 min；對于金黃色葡萄球菌ATCC6538和馬腺疫鏈球菌獸疫亞種強毒CVCC 556，2%枸櫞酸碘溶液最低殺菌有效濃度為1∶640，該濃度的最短消毒時間為5 min。對照組百勝-30溶液按1∶1920稀釋時，對上述三種菌株的作用時間為1 h；當濃度提高到1∶960時，對三種菌的最短作用時間是5 min。對于蠟樣桿菌芽孢，2%枸櫞酸碘溶液最低殺菌有效濃度為1∶1，該濃度的最短消毒時間為10 min；對照組百勝-30溶液最低殺菌有效濃度為1∶1，該濃度的最短消毒時間為30 min。詳細結(jié)果見表2～表4。

表2 2%枸櫞酸碘消毒劑對三種細菌定性殺菌效果Tab 2 The qualitative germicidal effect of 2% citrate iodine solution on three kinds of bacteria

A代表大腸桿菌8009，B代表金黃色葡萄球菌ATCC6538，C代表馬腺疫鏈球菌獸疫亞種強毒CVCC556；“+”表示有細菌生長，“-”表示無細菌生長；陽性對照均渾濁；表內(nèi)結(jié)果是3次試驗的平均值

表3 百勝-30消毒劑對三種細菌定性殺菌效果Tab 3 The qualitative germicidal effect of Bai Sheng-30 solution on three kinds of bacteria

此消毒劑含碘量為3%，按照最終含碘量一致的原則，稀釋倍數(shù)參考受試消毒劑；A代表大腸桿菌8009，B代表金黃色葡萄球菌ATCC6538，C代表馬腺疫鏈球菌獸疫亞種強毒CVCC556；“+”表示有細菌生長，“-”表示無細菌生長；陽性對照均渾濁；表內(nèi)結(jié)果是3次試驗的平均值

表4 兩種消毒劑對蠟樣芽胞桿菌8008定性殺菌效果Tab 4 The qualitative germicidal effect of two kinds of solutions on Bacillus cereus 8008

“+”表示有細菌生長，“-”表示無細菌生長。陽性對照均渾濁。表內(nèi)結(jié)果是3次試驗的平均值

3.3 定量試驗結(jié)果 對四種病原菌的殺滅效果見下表5～表6。在室溫條件(20 ℃左右)、橡膠片載體上時，對于大腸桿菌8099，2%枸櫞酸碘溶液按1∶500稀釋，5 min殺滅率均達99.90%以上，當稀釋倍數(shù)再提高，即使作用時間延長，其殺菌率也不能達標；對照消毒劑百勝-30溶液按照1∶900稀釋，5 min殺滅率也達99.90%以上(表5)。

如表5所示，對于金黃色葡萄球菌ATCC6538，2%枸櫞酸碘溶液按1∶1000稀釋，5 min殺滅率均達99.90%以上，當稀釋倍數(shù)提高到1∶1200，最低作用時間是10 min，相對應的百勝-30溶液按照1∶1800稀釋，最低作用10 min，殺菌率才能達標，即使提高消毒劑濃度，最低作用10 min，其殺菌率才能達99.90%以上。對于馬腺疫鏈球菌獸疫亞種強毒CVCC 556，2%枸櫞酸碘溶液按照1∶1200稀釋，30 min殺滅率達99.90%以上，當濃度再提高至1∶800以上時，作用10 min殺滅率均達99.90%以上，相對應的百勝-30溶液，按照1∶1800稀釋時，5 min殺滅率均達99.90%以上。

如表6所示，對于蠟樣桿菌8008芽孢，枸櫞酸碘溶液按1∶10稀釋，1.5 h殺滅率才達99.90%以上，當藥物濃度提高到1∶8以及更高濃度時，作用30 min殺滅率才能達標；對照組百勝-30溶液，按1∶10稀釋時，作用1.5 h，殺滅率才達99.90%以上，當藥物濃度提高1∶6稀釋時，作用1 h，殺滅率才能達標。

表5 兩種消毒劑對三種細菌定量殺菌試驗結(jié)果Tab 5 The quantitative germicidal effect of two kinds of solutions on three kinds of bacteria

對照組菌數(shù)為106CFU/mL；枸櫞酸碘溶液按1∶300、1∶400、1∶500、1∶600稀釋后，分別與百勝-30溶液按1∶450、1∶600、1∶750、1∶900稀釋后，最終碘含量一致。枸櫞酸碘溶液按1∶600、1∶800、1∶1000、1∶1200稀釋后，分別與百勝-30溶液分別按1∶900、1∶1200、1∶1500、1∶1800稀釋后，最終碘含量一致；表內(nèi)結(jié)果是3次試驗的平均值

表6 兩種消毒劑對蠟樣芽胞桿菌8008芽孢定量殺菌試驗結(jié)果Tab 6 The quantitative germicidal effect of two solutions against Bacillus cereus 8008

對照組菌數(shù)為106CFU/mL；枸櫞酸碘溶液與百勝-30分別按1∶6、1∶8、1∶10、1∶12稀釋；表內(nèi)結(jié)果是3次試驗的平均值

4 討論與小結(jié)

影響消毒劑殺菌作用的因素有藥物濃度、作用時間、溫度等[9]。微生物附著于不同的載體，也會影響消毒和滅菌效果[10-11]。本試驗初步證明了受試菌株(大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、馬腺疫鏈球菌和蠟樣芽胞桿菌)附著在橡膠片載體上時，枸櫞酸碘溶液和百勝-30溶液的殺菌效果。上述試驗結(jié)果是建立在兩種消毒劑按一定比例稀釋后，最終碘含量一致的前提下(將枸櫞酸碘溶液稀釋為相應倍數(shù)時，消毒劑百勝-30溶液稀釋倍數(shù)為上述消毒劑稀釋倍數(shù)乘以1.5)得到的。對于蠟樣芽胞桿菌，在定性試驗中，消毒劑百勝-30稀釋倍數(shù)為1∶1時，作用10 min也無作用，因此，在定量試驗中，其稀釋濃度相應提高，稀釋倍數(shù)與受試組藥物一致。

通過載體定性、定量殺菌實驗得出，在橡膠片載體上時，對于大腸桿菌8099，枸櫞酸碘溶液按1∶500稀釋，5 min殺滅率均達99.90%以上；對于金黃色葡萄球菌ATCC6538，枸櫞酸碘溶液按1∶1000稀釋，5 min殺滅率均達99.90%以上；稀釋倍數(shù)為1∶1200時，最低作用10 min，殺菌率才能達到99.90%；對于馬腺疫鏈球菌獸疫亞種強毒CVCC 556，枸櫞酸碘溶液按照1∶1200稀釋，30 min殺滅率均達99.90%以上，當藥物濃度提高至1∶800以上時，作用10 min殺菌率即可達到99.90%以上；對于蠟樣桿菌8008芽孢，枸櫞酸碘溶液1∶10稀釋，1.5 h殺滅率才達99.90%以上，當藥物濃度提高到1∶8及以上時，作用30 min殺滅率才能達標。

對照百勝-30溶液對大腸桿菌的殺滅效果要明顯強于枸櫞酸碘溶液；對金黃色葡萄球菌的殺滅效力與枸櫞酸碘溶液相比，起作用時間略晚一些；對馬腺疫鏈球菌獸疫亞種強毒，對照百勝-30溶液比枸櫞酸碘溶液稍好；對蠟樣芽孢，枸櫞酸碘溶液的殺滅效果比百勝-30溶液的殺滅效果略好。建議養(yǎng)殖場使用消毒劑前，綜合考慮本場微生物污染的情況，合理選擇消毒劑。此外，應交替使用不同的消毒劑，避免因長期使用一種消毒劑導致耐藥菌產(chǎn)生，影響消毒效果。選擇復方枸櫞酸碘溶液進行消毒時，應確保消毒劑使用濃度和作用時間。

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