豬源耐黏菌素大腸桿菌PFGE分型及耐藥性研究

吳寧鵬，呂小月，于 輝，周 娟

(1.河南省獸藥飼料監(jiān)察所，鄭州 450008；2.河南省動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所，鄭州 450008)

大腸埃希菌(Escherichiacoli),通常稱為大腸桿菌，為腸桿菌科，埃氏菌屬的革蘭氏陰性菌。豬感染大腸桿菌通常引起仔豬腸道傳染性疾病，常見的有仔豬黃痢、仔豬白痢和水腫病三種[1]。近年，隨著抗菌藥物的不當(dāng)使用，耐藥菌株越來越多，耐藥問題日趨嚴(yán)重[2]，因此對(duì)大腸桿菌進(jìn)行長期的監(jiān)測研究工作十分重要。脈沖場凝膠電泳(Pulsed field gel electrophoresis, PFGE)是近年發(fā)展起來的一種重要的分離大分子量線性DNA分子的電泳技術(shù)，因其重復(fù)性好，分辨力強(qiáng)被譽(yù)為細(xì)菌分子分型技術(shù)的“金標(biāo)準(zhǔn)”，被廣泛應(yīng)用于分子分型研究[3]。通過微生物分型可以鑒定菌株是否一致、比較它們的親緣關(guān)系，對(duì)于細(xì)菌性傳染病的監(jiān)測、傳染源的追蹤、傳播途徑的調(diào)查和識(shí)別有著非常重要的意義[4]。

碳青霉烯類抗菌藥物通常被認(rèn)為是治療泛耐藥腸桿菌的最后手段，而黏菌素是治療耐碳青霉烯類病原體感染的關(guān)鍵藥物，因此，耐黏菌素的菌株的傳播，會(huì)嚴(yán)重影響臨床治療的有效性[5]。本研究對(duì)2014、2015年分離于河南省焦作市、許昌市養(yǎng)殖場的耐黏菌素大腸桿菌進(jìn)行PFGE基因分型及耐藥性研究，以達(dá)到對(duì)河南省內(nèi)耐黏菌素大腸桿菌流行情況的準(zhǔn)確判斷，從而對(duì)耐黏菌素大腸桿菌引起的疾病的防治提供依據(jù)和參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源 2014與2015年從河南省焦作市、許昌市規(guī)?；B(yǎng)殖廠健康豬或病豬中分離并保存的共333株大腸桿菌中32株耐黏菌素大腸桿菌。沙門菌標(biāo)準(zhǔn)菌株H9812由河南農(nóng)業(yè)大學(xué)牧醫(yī)工程學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.2 主要儀器和試劑 動(dòng)物源細(xì)菌耐藥性藥敏檢測板，購自上海星佰生物技術(shù)有限公司；營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、腦心浸萃液瓊脂培養(yǎng)基，購自北京路橋公司；蛋白酶K、限制性內(nèi)切酶XbaⅠ購自寶生物工程(大連)有限公司；PFGE專用瓊脂糖為Bio-Rad公司配套產(chǎn)品；細(xì)胞懸浮液(CSB)、細(xì)胞裂解液(CLB)均為新鮮配制；CHEF-MapperXA型脈沖電泳儀、GELDOC凝膠成像系統(tǒng)購自BIO-RAD公司。

1.2 方法

1.2.1 藥敏試驗(yàn) 使用藥敏檢測板對(duì)32株耐黏菌素大腸桿菌進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，結(jié)果判定依照美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)推薦的標(biāo)準(zhǔn)。

1.2.2 PFGE分型

1.2.2.1 細(xì)菌的培養(yǎng) 將受試菌株和標(biāo)準(zhǔn)菌株H9812劃線接種于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，37 ℃過夜培養(yǎng)。

1.2.2.2 膠塊的制備 挑取適量的過夜培養(yǎng)的新鮮菌落制備菌懸液，加入10 μL的蛋白酶K和200 μL溶化的56 ℃的1% SeaKem Gold 1% SDS瓊脂糖。

1.2.2.3 細(xì)胞裂解 將膠塊于細(xì)胞裂解液中(5 mL CLB，25 μL蛋白酶K)裂解，水浴搖床55 ℃，165 r/min孵育5 h。

1.2.2.4 裂解后洗膠 分別用超純水和TE緩沖液洗滌膠塊。

1.2.2.5 酶切 用刀片切下約1/3的小膠塊，加入XbaⅠ酶切體系，37 ℃水浴3 h。

1.2.2.6 電泳 棄去酶切體系，將膠塊按順序置于梳子上，倒入溶解的1%的瓊脂糖制膠；使用CHEF-mapperXA型脈沖場凝膠電泳儀和0.5×TBE進(jìn)行電泳。

1.2.2.7 染色與圖像的獲取 將凝膠置于500 mL含1 μg/mL的EB溶液中染色30 min，然后純水脫色30 min，用凝膠成像系統(tǒng)Gel Doc獲取膠圖，并用Bio Numerics軟件聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 藥敏試驗(yàn) 32株豬源大腸桿菌分離株對(duì)13種臨床常用抗菌藥物耐藥情況見表1。

藥敏試驗(yàn)結(jié)果表明，32株豬源耐黏菌素大腸桿菌對(duì)四環(huán)素的耐藥性(100%)最為普遍，其次是磺胺異噁唑(96.8%)，多西環(huán)素(96.8%)，復(fù)方新諾明(90.6%)，耐藥率均高達(dá)90%以上，對(duì)氟苯尼考、氨芐西林、大觀霉素、恩諾沙星的耐藥率分別為87.5%、84.4%、81.3%、59.4%，均在50%以上，對(duì)氧氟沙星(46.9%)、慶大霉素(31.3%)、阿莫西林/棒酸(12.5%)耐藥率較低，對(duì)頭孢噻呋耐藥率最低(0)。

2.2 PFGE 32株豬源耐黏菌素大腸桿菌的聚類分析見圖1，其中M14～39于2014年分離于許昌，2015M29、2015M31于2015年分離于許昌，2015M32、2015M35、2015M38、2015M39于2015年分離于焦作，分離株共存在30種帶型，其中，1、2、3、4帶型間相似性在90%以上，各菌株帶型間基本無差異，可認(rèn)為是同一流行亞種，5、6、7、8、9各帶型間相似性約為85%，可能存在克隆相關(guān)，其他帶型相似性均低于85%，說明親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，菌株遺傳基因之間不緊密相關(guān)，流行病學(xué)上可能不存在相關(guān)性。

表1 32株豬源大腸桿菌耐藥情況Tab 1 Antimicrobial resistance of 32 chicken E.coli isolates

圖1 32株耐黏菌素大腸桿菌PFGE聚類分析圖Fig 1 The cluster analysis of 32 strains of Colistin resistance E.coli

3 討論與小結(jié)

來自中國、英國和美國多所大學(xué)的研究者在期刊《柳葉刀·傳染病》上宣布[6]，發(fā)現(xiàn)了一種新形式的抗藥性，首次在腸桿菌科中發(fā)現(xiàn)了質(zhì)粒介導(dǎo)的黏菌素抗性機(jī)制，MCR-1。在此之前，黏菌素耐藥性僅由染色體突變介導(dǎo)，從未有過耐藥基因水平轉(zhuǎn)移的報(bào)道。面對(duì)最后的防線之一多粘菌素，而且這種抗藥性還在肉用動(dòng)物和人類中同時(shí)存在，可能是因?yàn)樵撍幍霓r(nóng)業(yè)使用。這種抗藥性可在細(xì)菌之間輕易地轉(zhuǎn)移，而且可能已經(jīng)蔓延至多個(gè)國家。

為了對(duì)河南省許昌市、焦作市兩規(guī)?；B(yǎng)殖場黏菌素耐藥菌株作流行病學(xué)分析，對(duì)分離于兩地市的黏菌素耐藥大腸桿菌進(jìn)行藥敏試驗(yàn)和分子分型研究，研究發(fā)現(xiàn)，32株豬源耐黏菌素大腸桿菌對(duì)四環(huán)素的耐藥性最為普遍，其次是磺胺異噁唑，多西環(huán)素，復(fù)方新諾明，耐藥率均高達(dá)90%以上，此外，對(duì)氟苯尼考、氨芐西林、大觀霉素、恩諾沙星的耐藥率均在50%以上，對(duì)氧氟沙星(46.9%)、慶大霉素(31.3%)、阿莫西林/棒酸(12.5%)耐藥率較低，對(duì)頭孢噻呋耐藥率最低，為0。分離株對(duì)多種抗菌藥物耐受，耐藥譜廣，可能與PFGE型較多有關(guān)。

脈沖場電泳(PFGE)技術(shù)重復(fù)性好，特異性、分辨性高，作為一種成功的基因分型方法，廣泛應(yīng)用于各種病原微生物分型和溯源中。在歐美等發(fā)達(dá)國家中，許多公共衛(wèi)生實(shí)驗(yàn)室采用PFGE技術(shù)進(jìn)行DNA指紋圖譜鑒定，確定食源性疾病發(fā)生時(shí)致病菌的種屬[7-8]。美國疾病預(yù)防及控制中心(CDC)通過建立細(xì)菌基因分型國家電子網(wǎng)絡(luò)(PulseNet)，將來自各地市的病人或可疑食品樣本的細(xì)菌PFGE實(shí)驗(yàn)結(jié)果與全國各地的結(jié)果進(jìn)行比較，根據(jù)來自同一親代的個(gè)體具有共同的遺傳物質(zhì)，故可以在PFGE實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出相同的指紋圖譜這一原理，確定各地致病菌的親緣關(guān)系，追溯共同的致病食品的源頭所在[9-10]。目前美國已應(yīng)用這種方式成功地查獲了多起食源性疾病的源頭食品，并通過對(duì)生產(chǎn)這些食品的單位進(jìn)行有效地干預(yù)控制[11]，從根本上防止了食源性疾病的發(fā)生[12]。

32株耐黏菌素大腸桿菌整體上表現(xiàn)出較大的遺傳多樣性，但不同菌株存在著不同程度的親緣關(guān)系，其中，帶型5中菌株M35和2015M31分別于2014年，2015年分離于許昌，其帶型具有較高的同源性，可能是許昌該養(yǎng)殖廠優(yōu)勢流行的菌株，菌株M20與2015M35分別于2014年，2015年分離于許昌和焦作，其帶型間相似性約為85%。

綜上所述，本研究為豬源耐黏菌素大腸桿菌的流行病學(xué)提供了一些本底數(shù)據(jù)，為今后大腸桿菌的監(jiān)測提供數(shù)據(jù)參考，為臨床篩選安全敏感抗菌藥物，初步建立細(xì)菌耐藥性流行病學(xué)調(diào)查數(shù)據(jù)庫及疾病流行和暴發(fā)過程中的追蹤溯源提供參考。

參考文獻(xiàn)：

[1] 曾俊棋，岳萬福. 豬源大腸桿菌耐藥性與毒力的研究[J]. 現(xiàn)代畜牧獸醫(yī). 2016，(1): 38-44.

Zeng J Q, Yue W F. Study on the Resistance and Toxicity ofEscherichiacoliin Swine[J]. Modern Journal of Animal Husbandry and Veterinary Medicine, 2016, (1):38-44.

[2] 王克領(lǐng)，張青嫻，徐引弟，等. 河南地區(qū)豬源性大腸桿菌血清型鑒定與耐藥性調(diào)查[J]. 河南農(nóng)業(yè)科學(xué), 2014，(9): 164-167.

Wang K L, Zhang Q X, Xu Y D,etal. Serotype Identification and Drug Resistance Investigation of SwineEscherichiacoliin Henan Area[J]. Journal of Henan Agricultural Sciences, 2014，(9):164-167.

[3] 葉 蕊，石麗媛，王 鵬，等. 脈沖場凝膠電泳技術(shù)簡介及其在細(xì)菌分子分型中的應(yīng)用[J]. 中國媒介生物學(xué)及控制雜志. 2013，(2): 182-185.

Ye R, Shi L Y, Wang P,etal. Brief introduction of pulsed-field gel electrophoresis and its application in bacterial molecular typing[J]. Chinese Journal of Vector Biology and Control. 2013，(2):182-185.

[4] 張惠媛，汪 琦，張 昕，等. 進(jìn)出境食品中單核增生李斯特菌的血清分型與脈沖場凝膠電泳分型分析[J]. 中國食品衛(wèi)生雜志, 2012，(5): 407-411.

Zhang H Y, Wang Q, Zhang X,etal. Analysis on pulsed-field gel electrophoresis and serotyping of Listeria monocytogenes isolates from import and export food[J]. Chinese Journal of Food Hygiene, 2012，(5):407-411.

[5] Johnson A P, Woodford N. Global spread of antibiotic resistance: the example of New Delhi metallo-beta-lactamase (NDM)-mediated carbapenem resistance[J]. J Med Microbiol, 2013, 62(Pt4): 499-513.

[6] Liu Y Y, Wang Y, Walsh T R,etal. Emergence of plasmid-mediated colistin resistance mechanism MCR-1 in animals and human beings in China: a microbiological and molecular biolo￣gical study[J]. Lancet Infect Dis, 2016, 16(2): 161-168.

[7] Felix B, Danan C, Van Walle I,etal. Building a molecular Listeria monocytogenes database to centralize and share PFGE typing data from food, environmental and animal strains throughout Europe[J]. J Microbiol Methods, 2014, 104: 1-8.

[8] Magnusson S H, Guethmundsdottir S, Reynisson E,etal. Comparison of Campylobacter jejuni isolates from human, food, veterinary and environmental sources in Iceland using PFGE, MLST and fla-SVR sequencing[J]. J Appl Microbiol, 2011, 111(4): 971-981.

[9] 游興勇，劉成偉，朱應(yīng)飛，等. 江西省食源性沙門菌血清分型及脈沖場凝膠電泳指紋圖譜研究[J]. 中國食品衛(wèi)生雜志, 2014, (6): 528-532.

You X Y, Liu C W, Zhu Y F,etal. Serotyping and PFGE type ofSalmonellaisolates from food in Jiangxi Province[J]. Chinese Journal of Food Hygiene, 2014, (6):528-532.

[10] Bakhshi B, Kalantar M, Rastegar-Lari A,etal. PFGE genotyping and molecular characterization of Campylobacter spp. isolated from chicken meat[J]. Iran J Vet Res, 2016, 17(3): 177-183.

[11] Lytsy B, Engstrand L, Gustafsson A,etal. Time to review the gold standard for genotyping vancomycin-resistant enterococci in epidemiology: Comparing whole-genome sequencing with PFGE and MLST in three suspected outbreaks in Sweden during 2013-2015[J]. Infect Genet Evol, 2017, 54: 74-80.

[12] Murase T, Nakamura A, Matsushima A,etal. An epidemiological study of Salmonella enteritidis by pulsed-field gel electrophoresis (PFGE): several PFGE patterns observed in isolates from a food poisoning outbreak[J]. Microbiol Immunol, 1996, 40(11): 873-875.