常山口服液抗雞柔嫩艾美耳球蟲廣東分離株的療效研究

王 玲，郭志廷*，龔振興，蔡建平，楊 峰

(1. 中國農(nóng)業(yè)科學院蘭州畜牧與獸藥研究所，農(nóng)業(yè)部獸用藥物創(chuàng)制重點實驗室，甘肅 蘭州，730050;2. 中國農(nóng)業(yè)科學院蘭州獸醫(yī)研究所，家畜疫病病原生物學國家重點實驗室，甘肅 蘭州，730046)

中藥常山為虎耳草科植物常山(DichroafebrifugaLour.，DFL)的干燥根，味苦辛，性寒，具有殺蟲、截瘧、祛痰之功效[1]。常山作為具有抗球蟲活性的中藥材，可單獨使用或作復(fù)方制劑的主藥使用，而有效活性單體常山堿(即常山堿乙或常山乙素，febrifugine，dichroine B，β-dichroine)和異常山堿(即常山堿甲，isofebrifugine，dichroine A，α-dichroine)即為常山提取物中的抗球蟲有效組分[2-4]。雞球蟲病是一種全球流行、發(fā)病率高和死亡率高的腸道寄生蟲病，全球每年因該病造成的經(jīng)濟損失約為50億美元，我國在30億元左右，其中抗球蟲藥物費用約為6億元。目前雞球蟲病防治主要依靠化學藥物，包括地克珠利、妥曲珠利及常山堿衍生物(如常山酮)等[5-6]。鑒于抗球蟲化學藥物存在嚴重的耐藥性和藥物殘留，且中藥復(fù)方中抗球蟲有效活性成分常山堿的含量偏低，目前迫切需要研發(fā)新型安全高效的抗球蟲藥物。應(yīng)用現(xiàn)代中藥分離技術(shù)，提取中藥常山的有效活性成分常山堿，通過優(yōu)化生產(chǎn)工藝制備常山口服液，并將其用于防控雞球蟲病，具有抗球蟲療效好、低毒低殘留和不易產(chǎn)生耐藥性等優(yōu)點。本試驗擬通過人工感染雞柔嫩艾美艾球蟲(E.tenella)復(fù)制病理模型，探討常山口服液對雞球蟲病的臨床療效，并確定最佳給藥劑量，以期為今后常山口服液作為抗球蟲新獸藥的研發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗動物 1日齡的嶺南黃雛雞120只，購自甘肅省蘭州華隴家禽育種公司。雛雞飼料購自蘭州市富昌飼料廠，未添加任何抗球蟲藥物。飼養(yǎng)條件與管理：在中國農(nóng)業(yè)科學院蘭州畜牧與獸藥研究所標準化實驗動物房(經(jīng)嚴格消毒，無雞球蟲卵囊污染環(huán)境)，隔離籠養(yǎng)。按常規(guī)飼喂飼料，自由采食飲水，飼養(yǎng)至14日齡，按體重隨機分組，分籠飼養(yǎng)。

1.2 試驗藥物 常山口服液，由中國農(nóng)業(yè)科學院蘭州畜牧與獸藥研究所農(nóng)業(yè)部獸用藥物創(chuàng)制重點實驗室制備，黃色液體，常山堿含量為2.2 mg/50 mL。主要制備過程：常山提取物，加入1.0%的無水酒精助溶劑和4.0%的雙乙酸鈉防腐劑，調(diào)節(jié)pH值至7.2，過濾、分裝、冷藏，備用。

對照藥物：百球清(妥曲珠利溶液，口服制劑，含量2.5%)，購自拜耳(四川)動物保健有限公司，按生產(chǎn)廠家推薦劑量1.0 mL/L水，飲水給藥。

1.3 試驗蟲株 柔嫩艾美耳球蟲廣東株(1996年分離自廣東花都，對尼卡巴嗪輕度抗藥，對常山酮和克球粉中度抗藥，對球痢靈、氯羥吡啶、馬杜拉霉素、拉沙洛菌素、鹽霉素、莫能霉素嚴重抗藥)，由中國農(nóng)業(yè)科學院蘭州獸醫(yī)研究所蔡建平研究員提供。

1.4 抗球蟲試驗

1.4.1 分組與給藥 雛雞飼養(yǎng)至12日齡時，連續(xù)兩天對試驗雞進行糞便檢查，確定無球蟲感染后，于14日齡開始試驗。感染前選取90只健康無球蟲雛雞，飼喂前2 h禁止攝入飼料和水，逐只稱重。選取體重相近雛雞，隨機分為9個組，每組10只。常山口服液6個藥物劑量組(分別為2.5、5.0、15.0、25.0、35.0、50.0 mL/L水，飲水給藥)、妥曲珠利對照組(1.0 mL/L水，飲水給藥)、攻蟲不給藥組(感染對照組)和不攻蟲不給藥組(健康對照組)。除不攻蟲不給藥組外，其余各感染組每只雞經(jīng)口接種完全孢子化卵囊7×104個(卵囊為柔嫩艾美耳球蟲廣東株球蟲孢子化卵囊)，接種24 h后，開始給藥，連續(xù)給藥7 d。第8天試驗結(jié)束時，對每組存活雞進行單只稱重，統(tǒng)計存活率，計算各組相對增重率。

1.4.2 臨床及病理剖檢觀察 接種柔嫩艾美耳球蟲后，觀察和記錄各組試驗雞的發(fā)病情況及臨床表現(xiàn)。感染后第3天，每天檢查糞便，記錄血便情況，直至試驗結(jié)束。感染后第5～8天，每天收集糞便稱重，用麥氏蟲卵計數(shù)法(McMaster's法)計算每克糞便卵囊數(shù)(Oocysts per gramme，OPG)。試驗結(jié)束時(球蟲感染第8天)，每組存活雞逐只稱重后，全部撲殺，剖檢記錄盲腸病變值，同時，收集各組盲腸內(nèi)容物及粘膜上皮組織，進行盲腸內(nèi)容物稱重及盲腸卵囊數(shù)量檢測等。

1.4.3 藥物療效評定指標和標準 試驗雞稱重分別于感染前和試驗結(jié)束逐只稱量雛雞體重。按以下公式計算相對增重率。增重率=(試驗結(jié)束后平均體重-試驗開始時的平均體重)/試驗開始時的平均體重×100%，相對增重率=(感染試驗組的平均增重÷健康對照組平均增重)×100%

存活率：存活率(%)=(存活雞只數(shù)/開始雞只數(shù))×100%。

病變記分：試驗期間每日觀察各組雞的精神、食欲、糞便、死亡等情況，并記錄結(jié)果，對試驗期間死亡的雞進行尸體解剖。參考Johnson & Reid(1970)評價標準[7-8]，根據(jù)剖檢后腸道病變的嚴重程度對每組雞盲腸進行病變計分。病變記分在0～4+范圍之內(nèi)，0表示無肉眼病變；4+表示最嚴重病變，盲腸出血嚴重，高度腫脹，腸腔內(nèi)充滿凝血及黏膜碎片。試驗中因球蟲病死亡的雞只，其腸道病變記分均記為4分。病變值：每組雞的平均病變記分×10。

血便記分：參照Morehouse和Baron(1970)評價標準[7,9]，非正常糞便記分在0～4+范圍之內(nèi)，0表示未見異常，糞便不帶血；4+表示最嚴重的異常稀糞，糞便中帶有血液和黏液。

卵囊值[7,10]：按角田清(1986)方法計算，以感染對照組的卵囊量為100%(40分)，卵囊比數(shù)為0～1%(卵囊值記為0)；卵囊比數(shù)為1%～25%(卵囊值記為5)；卵囊比數(shù)為26%～50%(卵囊值記為10)；卵囊比數(shù)為51%～75%(卵囊值記為20)；卵囊比數(shù)為76%～100%(卵囊值記為40)。卵囊值=(試驗組卵囊/感染對照組卵囊)×100%。

效果判定：根據(jù)各組試驗雞的相對增重率、存活率、病變值和卵囊值，按美國Merck公司的方法，計算抗球蟲指數(shù)(Anticoccidial index, ACI)[7]。以ACI為標準判定藥物療效，ACI≤120為無效；ACI介于120～160為低效；ACI介于160～180為中效；ACI>180為高效。ACI=(相對增重率+存活率)×100-(病變值+卵囊值)。

2 結(jié)果與分析

2.1 臨床癥狀及血便情況 接種球蟲后第3天，除健康對照組雞只外，其他感染試驗組雞只均表現(xiàn)出不同程度的臨床癥狀，如采食量減少、羽毛蓬亂、兩翼下垂、縮頭縮頸、閉眼昏睡、不愿走動、離群呆立、排血便等情況。

接種球蟲后第4天和第5天，除健康對照組糞便記分為0外，感染對照組雞只仍表現(xiàn)排出大量血便癥狀(糞便記分為4)，所有藥物劑量組的雞只其血便明顯減少，精神狀況和采食量出現(xiàn)明顯好轉(zhuǎn)跡象(糞便記分為3)。

2.2 病理解剖學變化 病理解剖發(fā)現(xiàn)，所有健康對照組試驗雞只，其臟器均正常。感染對照組試驗雞只，盲腸和十二指腸顯著腫脹，內(nèi)含大量血樣內(nèi)容物。所有藥物劑量組試驗雞只，盲腸及十二指腸亦出現(xiàn)腫脹、血樣性內(nèi)容物，但病變程度較感染對照組明顯減輕，其他臟器未見明顯眼觀病變。病變值見表1。

2.3 抗球蟲及促生長效果 通過相對增重率、存活率、卵囊值和病變值等指標計算ACI，由表1可知，常山口服液各藥物劑量組的ACI值分別為87.7、136.2、141.8、136.2、109.7和108.0，均高于感染對照組；常山口服液按5.0、15.0和25.0 mL/L水的劑量飲水給藥，其ACI值均高于妥曲珠利藥物組(ACI值為124.8)。用藥各組雞(除2.5 mL/L藥物劑量組外)增重明顯高于感染對照組，其中以15.0 mL/L藥物劑量組雞增重最快，比對照藥妥曲珠利組雞高12.5%。

表1 常山口服液抗柔嫩艾美耳球蟲療效試驗結(jié)果Tab 1 Curative effect on anticoccidial of Radix dichroa oral liquid (RDOL) to E.tenella in chickens

3 討 論

球蟲病是危害極大、呈全球性分布的禽類傳染病之一，可導(dǎo)致家禽生長受阻、飼料轉(zhuǎn)化率降低和肉蛋品質(zhì)下降。在所有的雞球蟲屬中，柔嫩艾美耳球蟲(E.tenella)對雞危害最為嚴重[11]。目前，國內(nèi)外主要利用化學合成藥物來預(yù)防和治療雞球蟲病，如地克珠利、妥曲珠利和常山酮等，對上述藥物的抗球蟲作用及機理研究較多[12]。

中藥和化學合成藥物在防治球蟲病的過程中，由于來源不同，其作用效果、作用機制和治病理論存在很大差別，在防治疾病過程中中藥一般表現(xiàn)多靶點、多途徑和協(xié)同作用的特點。按照中獸醫(yī)辨證施治理論，雞球蟲病為外感濕熱，濕熱蘊集大腸，熱毒迫血妄行，導(dǎo)致糞便帶血，濕困脾土，致使雞群下痢，其治療原則應(yīng)以清熱燥濕、涼血止痢為主。中藥常山是我國著名的截瘧祛痰藥，中醫(yī)主要用于抗瘧疾和退熱藥物使用[13]。研究表明，由常山中分離提取出的常山堿具有良好的抗球蟲效果，其作為一種新型的ATP依賴性抑制劑所具有的定向捕獲作用可能也適用于人類其他tRNA合成酶，這一重大發(fā)現(xiàn)揭示了常山堿及其衍生物發(fā)揮抗瘧疾、抗球蟲等生物學功效的可能作用機理[14]。前期藥理試驗證實，純度為0.24%的常山堿提取物按照0.1 g/kg的劑量飼料拌服給藥，對人工感染雞柔嫩艾美耳球蟲發(fā)病的試驗雞只具有良好的治療效果；免疫學試驗表明，常山堿可顯著促進小鼠脾細胞的增殖反應(yīng)和巨噬細胞的免疫功能；毒理學試驗表明，常山提取物毒性較低，臨床用藥安全可靠[15]。

試驗結(jié)果表明，常山口服液按5.0、15.0和25.0 mL/L水劑量飲水給藥，可以提高試驗雞只的增重率，對人工感染E.tenella的發(fā)病試驗雞只具有良好的治療效果。但本次試驗所有給藥組的ACI值均低于160，可能與所用蟲株的毒力有關(guān)。柔嫩艾美耳球蟲廣東株自上世紀90年代中期分離得到，蔡建平研究員課題組長期以此蟲株進行雞球蟲病的研究[16]，此蟲株毒力較強，每只雞經(jīng)口感染7萬個新鮮孢子化卵囊(1個月內(nèi))，死亡率介于10%～20%。通常在藥物抗球蟲療效試驗設(shè)計中，感染對照組(攻蟲不給藥)以5～10%的死亡率為最佳，然而此次試驗中，設(shè)計的攻蟲劑量為7×104個孢子化卵囊，感染對照組的死亡率達到30%，說明實際攻蟲劑量偏大。盡管此次預(yù)試驗結(jié)果中對照藥物和試驗藥物的ACI值都偏低，但仍可從結(jié)果中獲得劑量與抗球蟲效果之間的關(guān)系，即常山口服液按5.0、15.0和25.0 mL/L水劑量，飲水給藥，具有良好的抗球蟲效果。結(jié)合臨床用藥成本，我們確定常山口服液的最低有效給藥劑量為5.0 mL/L水。

通過抗球蟲療效觀察試驗，結(jié)果提示，人工感染條件下，常山口服液能有效預(yù)防雞球蟲病，較化學藥物妥曲珠利具有更好的抗球蟲療效和促生長作用，且作為中藥提取物，使用安全范圍大，療效對比試驗效果理想，有望成為新型抗球蟲藥物。

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