不同聲強(qiáng)低強(qiáng)度脈沖超聲對(duì)SD大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞遷移的影響

蔣璟瑋，劉寶茹，梁丹丹，汪 威，羅 東，陳俊林，陳錦云，陳文直,2，王 嫣*

(1.重慶醫(yī)科大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)院 省部共建國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地—重慶市超聲醫(yī)學(xué)工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 重慶市生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 重慶市微無(wú)創(chuàng)醫(yī)學(xué)協(xié)同創(chuàng)新中心，重慶 400016；2.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院腫瘤治療中心，重慶 400010)

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs)是一種非造血類的成體多能干細(xì)胞，具有取材方便、增殖能力強(qiáng)、可多向分化、免疫原性低等特點(diǎn)[1]。組織損傷時(shí)，BMSCs可向受損位點(diǎn)遷移并進(jìn)行修復(fù)，其對(duì)心肌梗死、神經(jīng)退行性疾病、骨疾病等疾病的治療作用已經(jīng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)[2-4]。然而，外源移植BMSCs在體內(nèi)遷移時(shí)，向靶組織的遷移率低[5-6]。如何提高外源性BMSCs自身遷移能力，從而使BMSCs在體內(nèi)向受損組織遷移時(shí)具有更強(qiáng)的能力，是目前干細(xì)胞治療領(lǐng)域亟待解決的難題。低強(qiáng)度脈沖超聲(low intensity pulsed ultrasound, LIPUS)聲強(qiáng)范圍1～100 mW/cm2，目前臨床主要用于治療骨科疾病，具有費(fèi)用低廉、簡(jiǎn)便易行、效果理想的優(yōu)點(diǎn)[7-8]。LIPUS可促進(jìn)BMSCs的增殖[9]及多向分化[10-12]，加快骨折愈合，從而達(dá)到治療目的[13]。本研究通過(guò)體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)研究LIPUS對(duì)BMSCs遷移的影響，并篩選最佳聲強(qiáng)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞培養(yǎng) BMSCs(購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院干細(xì)胞庫(kù))來(lái)源于6周齡SD大鼠骨髓。將BMSCs從液態(tài)氮中取出后進(jìn)行復(fù)蘇，加入含10%胎牛血清(fetal bovine serum， FBS；Gibco公司)的低糖DMEM培養(yǎng)基(Hyclone公司)，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中以37℃、5%CO2條件培養(yǎng)。采用Olympus IX-70倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況。當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至80%時(shí)，采用0.25%胰蛋白酶(Hyclone公司)消化傳代。

1.2 LIPUS輻照及分組 將處理后的BMSCs分為4組，在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中對(duì)空白對(duì)照組不進(jìn)行LIPUS輻照(僅行假輻照操作)，對(duì)其余3組均采用海扶LIPUS儀樣機(jī)進(jìn)行輻照，并根據(jù)輻照聲強(qiáng)分為30 mW/cm2組、60 mW/cm2組及90 mW/cm2組。其他超聲輻照參數(shù)：頻率0.3 MHz，重復(fù)頻率1 kHz，占空比20%，每次輻照時(shí)間20 min。

1.3 劃痕實(shí)驗(yàn) 取生長(zhǎng)狀態(tài)良好BMSCs，接種至六孔培養(yǎng)板中進(jìn)行培養(yǎng)，每孔加入5×105個(gè)細(xì)胞，待細(xì)胞完全貼壁后采用無(wú)血清培養(yǎng)基“饑餓”培養(yǎng)24 h后，以 200 μl槍頭進(jìn)行劃痕。用磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer solution， PBS)洗去劃掉的細(xì)胞，加入無(wú)血清的低糖DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。而后分別對(duì)30 mW/cm2組、60 mW/cm2組及90 mW/cm2組進(jìn)行輻照，并于輻照后即刻及輻照后24 h、48 h，采用Olympus IX-70倒置相差顯微鏡觀察劃痕區(qū)并進(jìn)行拍照，通過(guò)image J軟件測(cè)定劃痕區(qū)面積。對(duì)空白對(duì)照組分別于相應(yīng)時(shí)間測(cè)定劃痕區(qū)面積。消化收集各時(shí)間點(diǎn)BMSCs，離心后棄上清，加入1 ml新鮮完全培養(yǎng)基及0.5 ml濃度為1 mg/ml的MTT[3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴；Sigma公司]，于細(xì)胞孵箱中培養(yǎng)4 h，離心后棄去培養(yǎng)液，加入150 μl二甲基亞砜(Sigma公司)溶解沉淀。采用Bio-Tek酶標(biāo)儀在490 nm波長(zhǎng)處測(cè)量吸光度值。

1.4 transwell小室模型構(gòu)建及細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn) 采用24孔濾膜孔徑8 μm的transwell小室(Corning公司)構(gòu)建細(xì)胞遷移模型。實(shí)驗(yàn)前將裝有含2% FBS的低糖DMEM培養(yǎng)基的transwell小室放入培養(yǎng)箱中平衡1 h。對(duì)BMSCs采用無(wú)血清低糖DMEM培養(yǎng)基重懸，將細(xì)胞密度調(diào)整為5×105/ml，每孔200 μl接種于transwell小室的上室，并向transwell小室的下室內(nèi)加入800 μl含10% FBS的完全培養(yǎng)基。接種后，對(duì)30 mW/cm2組、60 mW/cm2組及90 mW/cm2組進(jìn)行輻照，24 h后取出transwell小室，以棉簽擦去上室未遷移的細(xì)胞，4%多聚甲醛固定，亞甲藍(lán)染液染色；對(duì)空白對(duì)照組僅于相應(yīng)時(shí)間進(jìn)行固定及染色處理。采用Olympus Ⅸ-70倒置相差顯微鏡隨機(jī)選取5個(gè)視野進(jìn)行拍照并計(jì)數(shù)。

1.5 F-肌動(dòng)蛋白(F-actin)染色 對(duì)30 mW/cm2組、60 mW/cm2組及90 mW/cm2組分別進(jìn)行LIPUS輻照，爬片生長(zhǎng)24 h后(密度達(dá)50%的匯合度)，吸棄培養(yǎng)液，與空白對(duì)照組共同以37℃預(yù)熱的PBS(pH為7.4)清洗細(xì)胞2次后，于室溫下采用4%多聚甲醛固定10 min，再以PBS清洗細(xì)胞2次，以Tritonx-100溶液透化處理5 min，取200 μl異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate， FITC)標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽工作液(翊圣生物科技有限公司)進(jìn)行染色，室溫下孵育30 min，以抗熒光淬滅封片劑(華邁科生物技術(shù)有限責(zé)任公司)封片。采用Nikon TE200熒光顯微鏡觀察F-actin表達(dá)情況，隨機(jī)選取5個(gè)視野進(jìn)行拍照；采用image J軟件檢測(cè)各組細(xì)胞的相對(duì)熒光強(qiáng)度。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)分析軟件。計(jì)量資料以±s表示。采用單因素方差分析比較多組間劃痕面積、吸光度、細(xì)胞計(jì)數(shù)及相對(duì)熒光強(qiáng)度，兩兩比較采用LSD法。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 劃痕實(shí)驗(yàn)及MTT活性檢測(cè) 30 mW/cm2組、60 mW/cm2組及90 mW/cm2組LIPUS輻照后即刻、24 h及48 h及空白對(duì)照組相應(yīng)時(shí)間劃痕面積見表1、圖1。輻照后24 h時(shí)空白對(duì)照組劃痕面積[(0.93±0.26) mm2]最大，分別大于30 mW/cm2組(P<0.001)、60 mW/cm2組(P<0.001)及90 mW/cm2組(P=0.015)；30 mW/cm2組劃痕面積最小[(0.47±0.21)mm2]，分別小于60 mW/cm2組(P<0.001)、90 mW/cm2組(P<0.001)及空白對(duì)照組(P<0.001)。輻照后48 h空白對(duì)照組劃痕面積[(0.70±0.11)mm2]仍明顯大于30 mW/cm2組(P<0.001)、60 mW/cm2組(P<0.001)和90 mW/cm2組(P<0.001)，30 mW/cm2組劃痕面積[(0.19±0.10)mm2]仍明顯小于60 mW/cm2組(P<0.001)、90 mW/cm2組(P<0.001)及空白對(duì)照組(P<0.001)。

表1 30 mW/cm2組、60 mW/cm2組、90 mW/cm2組LIPUS輻照后不同時(shí)間及對(duì)照組相應(yīng)時(shí)間BMSCs劃痕面積比較(mm2，±s)

表1 30 mW/cm2組、60 mW/cm2組、90 mW/cm2組LIPUS輻照后不同時(shí)間及對(duì)照組相應(yīng)時(shí)間BMSCs劃痕面積比較(mm2，±s)

組別輻照后即刻輻照后24 h輻照后48 h30 mW/cm2 組1.50±0.060.47±0.210.19±0.1060 mW/cm2 組1.53±0.030.70±0.250.49±0.1590 mW/cm2 組1.50±0.050.81±0.180.56±0.13空白對(duì)照組1.51±0.050.93±0.260.70±0.11F值2.92126.559106.110P值0.063<0.001<0.001

MTT活性檢測(cè)結(jié)果顯示，30 mW/cm2組、60 mW/cm2組及90 mW/cm2組LIPUS輻照后即刻、24 h及48 h及空白對(duì)照組相應(yīng)時(shí)間吸光度差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表2。

表2 30 mW/cm2組、60 mW/cm2組、90 mW/cm2組LIPUS輻照后不同時(shí)間及對(duì)照組相應(yīng)時(shí)間BMSCs吸光度比較(±s)

表2 30 mW/cm2組、60 mW/cm2組、90 mW/cm2組LIPUS輻照后不同時(shí)間及對(duì)照組相應(yīng)時(shí)間BMSCs吸光度比較(±s)

組別輻照后即刻輻照后24 h輻照后48 h30 mW/cm2 組1.77±0.152.01±0.122.40±0.1060 mW/cm2 組1.68±0.321.95±0.142.39±0.1590 mW/cm2 組1.71±0.221.96±0.132.40±0.15空白對(duì)照組1.67±0.251.96±0.112.44±0.08F值1.6160.7201.408P值0.1960.5440.378

2.2 transwell遷移結(jié)果 對(duì)穿過(guò)transwell小室上室的BMSCs進(jìn)行染色(圖2)并計(jì)數(shù)結(jié)果顯示，各組間細(xì)胞計(jì)數(shù)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=43.145，P<0.001)；兩兩比較，30 mW/cm2組[(212.53±35.32)個(gè)]、60 mW/cm2組[(168.87±35.49)個(gè)]及90 mW/cm2組[(155.60±35.34)個(gè)]細(xì)胞計(jì)數(shù)均大于空白對(duì)照組[(89.53±19.27)個(gè)；P均<0.001]，30 mW/cm2組細(xì)胞計(jì)數(shù)分別大于60 mW/cm2組(P=0.013)及90 mW/cm2組(P<0.001)，而60 mW/cm2組與60 mW/cm2組間細(xì)胞計(jì)數(shù)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.226)。

圖1 倒置相差顯微鏡下觀察BMSCs劃痕愈合(×40) LIPUS輻照后即刻(A～D)、24 h(E～H)及48 h(I～L)30 mW/cm2組、60 mW/cm2組、90 mW/cm2組及空白對(duì)照組相應(yīng)時(shí)間細(xì)胞劃痕圖像，藍(lán)線之間為劃痕區(qū)

圖2 倒置相差顯微鏡下觀察穿過(guò)transwell小室上室的細(xì)胞，亞甲藍(lán)染色(×100) A.空白對(duì)照組； B.30 mW/cm2組； C.60 mW/cm2組； D.90 mW/cm2組 圖3 F-actin熒光顯微鏡下圖像，F(xiàn)ITC-鬼筆環(huán)肽熒光染色(×100) A.空白對(duì)照組； B.30 mW/cm2 組； C.60 mW/cm2 組； D.90 mW/cm2 組

2.3 F-actin 染色結(jié)果 F-actin染色(圖3)顯示，LIPUS輻照后30 mW/cm2組、60 mW/cm2組及90 mW/cm2組BMSCs微絲增粗變長(zhǎng)，數(shù)量增多。各組間相對(duì)熒光強(qiáng)度差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=64.350，P<0.001)。兩兩比較，30 mW/cm2組(125.43±17.43)、60 mW/cm2組[89.78±16.09]及90 mW/cm2組[73.54±13.04]相對(duì)熒光強(qiáng)度均高于空白對(duì)照組[(51.94±12.76)；P均<0.001]，30 mW/cm2組相對(duì)熒光強(qiáng)度高于60 mW/cm2組(P<0.001)及90 mW/cm2組(P<0.001)，60 mW/cm2組相對(duì)熒光強(qiáng)度高于90 mW/cm2組(P<0.001)。

3 討論

組織發(fā)生損傷時(shí)，BMSCs可向損傷位點(diǎn)歸巢并參與修復(fù)，此為BMSCs移植治療的理論基礎(chǔ)，而外源性注射的BMSCs在體內(nèi)遷移率低是目前BMSCs移植治療領(lǐng)域的瓶頸。研究[10]發(fā)現(xiàn)，LIPUS作用于BMSCs后，可對(duì)其生物學(xué)行為產(chǎn)生影響，但大多數(shù)研究[11-12]主要集中于LIPUS對(duì)BMSCs增殖能力和分化能力的影響。本研究探討LIPUS對(duì)BMSCs遷移能力的影響，并對(duì)LIPUS輻照的最佳聲強(qiáng)進(jìn)行篩選。

BMSCs向組織損傷位點(diǎn)遷移是BMSCs治療的關(guān)鍵一步。劃痕模型可模仿體內(nèi)傷痕康復(fù)時(shí)細(xì)胞遷移過(guò)程，是細(xì)胞遷移研究的經(jīng)典模型。本研究采用不同聲強(qiáng)LIPUS對(duì)BMSCs劃痕進(jìn)行輻照，發(fā)現(xiàn)LIPUS輻照后24 h及48 h時(shí)BMSCs劃痕面積均較相應(yīng)時(shí)間未輻照者減小(圖1)，且超聲強(qiáng)度為30 mW/cm2時(shí)劃痕面積最小，表明LIPUS可增強(qiáng)BMSCs向“損傷”部位的遷移能力，且超聲強(qiáng)度為30 mW/cm2時(shí)增強(qiáng)作用最明顯。本研究通過(guò)MTT實(shí)驗(yàn)對(duì)劃痕實(shí)驗(yàn)中BMSCs的細(xì)胞增殖活性進(jìn)行檢測(cè)結(jié)果顯示，各時(shí)間點(diǎn)4組BMSCs間吸光度差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明各組增殖活性相似，劃痕面積的改變僅與細(xì)胞遷移能力有關(guān)。

為進(jìn)一步確認(rèn)LIPUS促進(jìn)BMSCs遷移的作用，本研究進(jìn)行transwell遷移實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)分別以聲強(qiáng)為30 mW/cm2、60 mW/cm2、90 mW/cm2的LIPUS輻照后，傳過(guò)transwell小室上室的細(xì)胞計(jì)數(shù)均明顯高于未經(jīng)LIPUS輻照者，表明LIPUS可提高BMSCs的遷移能力，與Wei等[13]的研究結(jié)果一致。另有研究[14]報(bào)道，LIPUS聯(lián)合BMSCs移植可加速骨缺損愈合。組織損傷時(shí)通過(guò)LIPUS促進(jìn)BMSCs動(dòng)員，LIPUS不僅是促進(jìn)BMSCs增殖和多向分化，而是在BMSCs歸巢這一步就開始發(fā)揮增效作用。

F-actin是構(gòu)成微絲的主要細(xì)胞骨架蛋白，與細(xì)胞遷移能力密切相關(guān)。本研究以FITC-鬼筆環(huán)肽對(duì)LIPUS輻照后的BMSCs進(jìn)行熒光染色，觀察其F-actin表達(dá)，發(fā)現(xiàn)LIPUS可使BMSCs的細(xì)胞骨架發(fā)生改變，微絲數(shù)量增多，細(xì)胞骨架面積增大，采用圖像分析軟件對(duì)各組F-actin熒光強(qiáng)度進(jìn)行檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)30 mW/cm2組、60 mW/cm2組及90 mW/cm2組的相對(duì)熒光強(qiáng)度均明顯高于空白對(duì)照組，且30 mW/cm2組明顯高于60 mW/cm2組及90 mW/cm2組，表明LIPUS可增強(qiáng)BMSCs的黏附和遷移能力，且30 mW/cm2的LIPUS輻照促進(jìn)細(xì)胞遷移的能力最強(qiáng)。研究[15]發(fā)現(xiàn)，機(jī)械應(yīng)力作用于細(xì)胞膜后可激活細(xì)胞膜上的一系列受體，將機(jī)械刺激信號(hào)傳遞至細(xì)胞內(nèi)，從而產(chǎn)生生物學(xué)效應(yīng)改變。因此，LIPUS增強(qiáng)BMSCs遷移能力可能是由于超聲的機(jī)械應(yīng)力作用于BMSCs細(xì)胞膜上的受體，再由細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)分子將這種刺激傳遞至細(xì)胞骨架，使細(xì)胞骨架向利于細(xì)胞運(yùn)動(dòng)遷移的方向進(jìn)行重排，從而促進(jìn)細(xì)胞遷移。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)LIPUS可促進(jìn)BMSCs的體外遷移能力，超聲輻照最佳聲強(qiáng)為30 mW/cm2。但本研究?jī)H對(duì)BMSCs的體外遷移能力進(jìn)行了檢測(cè)，其在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及人體內(nèi)是否具有相同的生物效應(yīng)還需要進(jìn)一步研究證實(shí)。

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