光聲/超聲實(shí)時(shí)雙模態(tài)顯影納米粒制備及示蹤實(shí)驗(yàn)

楊 露，成 涓，陳瑜莉，劉逢秋

(1.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院三腺外科，2.超聲科，重慶 400010；3.重慶醫(yī)科大學(xué)超聲影像學(xué)研究所，重慶 400010)

近年來，我國乳腺癌發(fā)病率已居女性惡性腫瘤之首。準(zhǔn)確判斷前哨淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，對乳腺癌分期、指導(dǎo)治療及改善預(yù)后均具有重要意義，但如何精確定位前哨淋巴結(jié)是目前臨床急需解決的關(guān)鍵難題之一。本研究采用高分子生物可降解材料攜帶具有良好光吸收屬性的納米炭及具有液氣相變特性的液態(tài)氟碳，構(gòu)建一種新型淋巴結(jié)示蹤劑——光聲/超聲實(shí)時(shí)雙模態(tài)顯影納米粒，并驗(yàn)證其示蹤能力，以期為臨床探索精確定位前哨淋巴結(jié)提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 儀器 主要包括：Heat System XL2020聲振儀，Mettler Toledo XS104電子分析天平，Malvern Zeta SIZER 3000HS激光粒徑儀，Hitachi H-7500透射電鏡，Esaote MyLab 90彩色多普勒超聲診斷儀(LA523探頭，頻率4～13 MHz)，Leica TCSSP2激光掃描共聚焦顯微鏡，ADR-1085激光儀(重慶理真科技有限公司)，Vevo LAZR光聲儀，F(xiàn)OTRIC 226紅外熱像儀，DAY型超聲圖像定量分析診斷儀(重慶醫(yī)科大學(xué)超聲影像學(xué)研究所研發(fā))。

1.1.2 試劑 主要包括：乳酸-羥基乙酸共聚物(ploy lactide-co-glycolide acid， PLGA；濟(jì)南岱罡生物工程有限公司)，納米炭(重慶萊美藥業(yè)股份有限公司)，全氟己烷(perfluorohexane， PFH；百靈威試劑公司)，二氯甲烷(重慶川東化工有限公司)，聚乙烯醇(polyvinylalcohol， PVA；Sigma公司)，巨噬細(xì)胞RAW264.7(南京賽泓瑞生物科技有限公司)，細(xì)胞膜紅色熒光探針Dil(碧云天生物有限公司)。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 新西蘭大白兔20只(由重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)，雌雄不限，體質(zhì)量2.0～2.5 kg；兔VX2腫瘤株由重慶醫(yī)科大學(xué)超聲工程研究所提供。

1.2 制備載納米炭及液態(tài)氟碳的PLGA納米粒 稱取PLGA 50 mg置于50 ml離心管中，以移液管吸取1 ml二氯甲烷加入上述離心管中溶解PLGA；吸取50 μl納米炭(50 mg/ml)至5 ml的EP管中，以2 ml雙蒸水稀釋后加入PFH 200 μl，并以聲振儀聲振30 s使其變?yōu)槿闈嵋海粚⑵浼尤胫烈讶芙釶LGA的離心管中聲振約1 min，而后加入6 ml 3%PVA均質(zhì)90 s，再加入直徑1 cm的磁珠后將其置于磁力攪拌器上攪拌2 h，使其揮發(fā)出二氯甲烷；磁力攪拌結(jié)束后離心洗滌3次，將離心洗滌后得到的沉淀物，即包裹納米炭和液態(tài)氟碳的納米粒(carbon nanoparticles incorporated liquid-gas phase-transition nanodroplets， CNPs)以1 ml雙蒸水稀釋，Co60輻照滅菌，4℃保存?zhèn)溆谩Ｖ苽銬il標(biāo)記的熒光納米粒(Dil-labeled CNPs，Dil-CNPs)，在稱取的PLGA中加入熒光染料Dil，制備及儲存過程中避光。

1.3 一般性狀檢測及光致相變實(shí)驗(yàn) 光鏡下觀察CNPs的大小、形態(tài)及分散性，并采用激光儀(808 nm，1 W/cm2)輻照CNPs 30 s，光鏡下觀察激光輻照后CNPs大小變化情況；透射電鏡下觀察其內(nèi)部結(jié)構(gòu)；以激光粒徑儀測量其粒徑分布及Zeta電位。

1.4 體外吞噬實(shí)驗(yàn) 將對數(shù)生長期的巨噬細(xì)胞RAW264.7接種于培養(yǎng)皿中，于37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。待細(xì)胞貼壁生長后，將已輻照滅菌的 Dil-CNPs以培養(yǎng)液稀釋成0.1 mg/ml加入培養(yǎng)皿中，共同孵育12 h后，以磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline， PBS)反復(fù)沖洗培養(yǎng)皿，于激光共聚焦顯微鏡下觀察Dil-CNPs被巨噬細(xì)胞吞噬情況。

1.5 體外光熱效應(yīng)、光聲顯影與超聲造影觀察 將CNPs分別稀釋成5、10、15、20 mg/ml共4種濃度，各取1 ml置入24孔板中，以激光儀(808 nm, 1 W/cm2)輻照30 s，并采用紅外熱像儀監(jiān)測溫度變化，每隔3 s對CNPs溫度進(jìn)行記錄，繪制溫度變化曲線。以等量生理鹽水作為對照，將4種不同濃度的CNPs與生理鹽水置入2%凝膠孔洞模型中，并設(shè)置3個(gè)復(fù)孔；采用光聲儀以波長700 nm激光激發(fā)，采集光聲圖像并測量光聲信號值；并以激光儀(808 nm,1 W/cm2)輻照30 s，采用超聲診斷儀以造影模式掃查，并采用DAY型超聲圖像定量分析診斷儀分析所采集圖像ROI的平均灰度值。

圖1 CNPs光鏡及透射電鏡圖像 A、B.光鏡下(×100)可見激光輻照前CNPs大小均一(A)，激光輻照后部分CNPs體積增大(B)； C.透射電鏡下可見深黑色的納米炭顆粒攜載于CNPs 圖2 CNPs激光共聚焦顯微鏡下(×800)可見CNPs被巨噬細(xì)胞吞噬

1.6 體內(nèi)光熱效應(yīng)、光聲顯影與超聲造影觀察 將兔VX2腫瘤接種于20只新西蘭大白兔雙側(cè)后肢小腿外側(cè)，4周后16只兔腘窩處出現(xiàn)腫瘤轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)共計(jì)30枚，隨機(jī)分為2組，實(shí)驗(yàn)組(8只兔，15枚淋巴結(jié))經(jīng)足底注射2 ml CNPs(20 mg/ml)，對照組(8只兔，15枚淋巴結(jié))經(jīng)足底注射2 ml生理鹽水。處理后6、12、24 h采用激光儀(808 nm,2 W/cm2)輻照30 s，并以紅外熱像儀監(jiān)測溫度變化，每隔3 s記錄淋巴結(jié)局部溫度，繪制溫度變化曲線。24 h后采用光聲儀以波長700 nm激光激發(fā)，采集光聲圖像并測量光聲信號值；并以激光儀(808 nm,2 W/cm2)輻照30 s，采集CEUS圖像并分析平均灰度值。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 19．0統(tǒng)計(jì)分析軟件，計(jì)量資料以±s表示，2組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD法，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CNPs一般性狀及光致相變結(jié)果 CNPs混懸液外觀呈黑色，CNPs粒徑為(483.32±45.09)nm，Zeta電位為(-26.30±5.02)mV。光鏡下可見CNPs形態(tài)規(guī)則，大小均一，分散性好(圖1A)；經(jīng)激光輻照后，CNPs內(nèi)的納米炭吸收光能，發(fā)生光熱轉(zhuǎn)換，致使CNPs內(nèi)的液態(tài)氟碳發(fā)生液氣相變，光鏡下可見部分CNPs體積迅速增大(圖1B)。透射電鏡下CNPs呈較規(guī)則球形，并攜載有深黑色納米炭顆粒(圖1C)。

2.2 體外吞噬結(jié)果 激光共聚焦顯微鏡下可見大量Dil-CNPs靠近藍(lán)色的細(xì)胞核(圖2)。

2.3 體外光熱效應(yīng) 不同濃度CNPs在激光輻照下溫度均升高，輻照約10 s后，溫度可達(dá)45～55℃，且濃度越高，升溫速度越快、幅度越大，而對照組溫度無明顯升高，見圖3。

2.4 體外光聲顯影 濃度為5、10、15、20 mg/ml的CNPs均可檢測到較強(qiáng)光聲信號，且光聲信號隨濃度增高呈增強(qiáng)趨勢，而生理鹽水未檢測到明顯光聲信號，見圖4。不同濃度CNPs及生理鹽水的平均光聲信號值見表1。

表1 不同濃度CNPs及生理鹽水的平均光聲信號值及平均灰度值(±s)

表1 不同濃度CNPs及生理鹽水的平均光聲信號值及平均灰度值(±s)

樣本平均光聲信號值平均灰度值CNPs 5 mg/ml 2.40±0.3416.90±2.60 10 mg/ml4.76±0.26△24.70±3.30 15 mg/ml6.08±0.25△▽36.90±3.41△ 20 mg/ml7.12±0.15△▽▲55.70±3.53△▽生理鹽水1.21±0.17△▽▲▼5.50±1.08△▽▲▼ F值1020.582432.778 P值<0.001<0.001

注：△：與5 mg/ml CNPs比較，P<0.05；▽：與10 mg/ml CNPs比較，P<0.05；▲：與15 mg/ml CNPs比較，P<0.05；▼：與20 mg/ml CNPs比較，P<0.05

2.5 體外CEUS 濃度為5、10、15、20 mg/ml的CNPs CEUS均可見不同程度增強(qiáng)，且CNPs濃度越高，增強(qiáng)效果越明顯，而生理鹽水CEUS無增強(qiáng)，見圖5。不同濃度CNPs及生理鹽水的平均灰度值見表1。

2.6 體內(nèi)光熱效應(yīng) 注射CNPs 6、12、24 h后實(shí)驗(yàn)組腘窩淋巴結(jié)局部溫度均升高，其中注射24 h后溫度升高最明顯，局部溫度約為50℃，而對照組溫度無明顯升高，見圖6。

圖4 生理鹽水及不同濃度(5、10、15、20 mg/ml)CNPs體外光聲顯影 圖5 生理鹽水及不同濃度(5、10、15、20 mg/ml)CNPs體外CEUS圖像

2.7 體內(nèi)光聲顯影 實(shí)驗(yàn)組腘窩淋巴結(jié)可檢測到較強(qiáng)光聲信號，而對照組腘窩淋巴結(jié)未檢測到明顯光聲信號，見圖7。實(shí)驗(yàn)組及對照組平均光聲信號值分別為3.16±0.25及0.93±0.17，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=28.819，P<0.001)。

2.8 體內(nèi)CEUS 實(shí)驗(yàn)組腘窩淋巴結(jié)CEUS增強(qiáng)效果明顯，而對照組腘窩淋巴結(jié)CEUS無增強(qiáng)，見圖8。實(shí)驗(yàn)組及對照組平均灰度值分別為41.67±4.89、15.20±2.78，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=18.207，P<0.001)。

圖3 生理鹽水及不同濃度(5、10、15、20 mg/ml)CNPs在30 s激光輻照下的溫度變化曲線

3 討論

圖6 經(jīng)足底注射生理鹽水及CNPs后不同時(shí)間(6、12、24 h)VX2腫瘤轉(zhuǎn)移新西蘭大白兔腘窩淋巴結(jié)在30 s激光輻照下的溫度變化曲線

隨著分子影像技術(shù)的發(fā)展，多種影像學(xué)技術(shù)已用于探查前哨淋巴結(jié)，多模態(tài)顯影可彌補(bǔ)單一影像學(xué)技術(shù)的不足，有效提高前哨淋巴結(jié)術(shù)前定位和活檢的準(zhǔn)確率。CEUS可實(shí)時(shí)顯示淋巴結(jié)甚至引流淋巴管情況，較為準(zhǔn)確地定位前哨淋巴結(jié)，安全性好，有助于初步判斷淋巴結(jié)性質(zhì)[1-3]，但目前所采用的微泡造影劑存在不能染色前哨淋巴結(jié)及代謝時(shí)間短等問題。光聲成像是一種無創(chuàng)性成像技術(shù)，結(jié)合了超聲成像高穿透深度和光學(xué)成像高對比度的特性，可提供實(shí)時(shí)高對比度和高分辨率圖像，且無輻射。目前光聲成像技術(shù)雖已應(yīng)用于前哨淋巴結(jié)的顯影[4-7]，但淋巴結(jié)本身吸收光的能力較差，必須借助外源性造影劑，目前應(yīng)用較多者包括亞甲藍(lán)、吲哚菁綠、納米金棒、碳納米管等一些染料、熒光材料及納米材料。

納米炭是一種可應(yīng)用于乳腺癌、結(jié)直腸癌、甲狀腺癌等惡性腫瘤淋巴結(jié)示蹤的新型染料，經(jīng)局部注射后可被巨噬細(xì)胞吞噬進(jìn)入淋巴結(jié)內(nèi)，具有高度淋巴結(jié)趨向性，極少引發(fā)局部及全身不良反應(yīng)，與美藍(lán)等傳統(tǒng)染料相比更加高效、安全[8-9]，且具有極強(qiáng)的光吸收屬性，是光聲造影劑的理想材料[10]。PLGA是一種可降解的高分子有機(jī)化合物，具有良好的生物相容性、生物可降解性、成球性和成球后穩(wěn)定性。Niu等[11]應(yīng)用包裹蘇丹藍(lán)的PLGA微球顯影前哨淋巴結(jié)，證實(shí)PLGA微球較脂質(zhì)體微泡在體內(nèi)具有良好穩(wěn)定性。此外，納米級PLGA微球經(jīng)皮下注射后可順利進(jìn)入淋巴結(jié)[11]，且PLGA微球易被巨噬細(xì)胞吞噬[12-13]。

圖7 生理鹽水(A)及CNPs(B)在新西蘭大白兔體內(nèi)光聲顯影 圖8 生理鹽水(A)及CNPs(B)在新西蘭大白兔體內(nèi)超聲造影及定量分析

本研究利用PLGA包裹納米炭與液態(tài)氟碳制備CNPs，其大小均一、形態(tài)規(guī)則，且該納米粒在體外可被巨噬細(xì)胞吞噬，且經(jīng)皮下注射后可進(jìn)入淋巴結(jié)。CNPs因納米炭的光學(xué)屬性，具有良好的光熱效應(yīng)和光聲顯影能力；而其具有超聲顯影的能力則是因?yàn)榧{米炭吸收光能后發(fā)生光熱轉(zhuǎn)換，使其內(nèi)部溫度迅速升高，促使液態(tài)氟碳發(fā)生液氣相變，產(chǎn)生大量的微氣泡，CNPs體積增大成為良好的超聲顯像劑[14-15]。

在體外實(shí)驗(yàn)中，本研究通過紅外成像儀記錄溫度變化曲線，發(fā)現(xiàn)CNPs濃度越高，其升溫速度越快，且幅度越大。本研究通過在體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，皮下注射CNPs 6、12、24 h后，在激光輻照下局部淋巴結(jié)升溫速度和幅度隨時(shí)間延長不斷增加(圖6)，可能是由于CNPs需經(jīng)巨噬細(xì)胞吞噬和毛細(xì)淋巴管等途徑進(jìn)入?yún)^(qū)域淋巴結(jié)，淋巴結(jié)內(nèi)CNPs濃度隨時(shí)間累積而不斷增高。

本研究證實(shí)CNPs在激光輻照下可產(chǎn)生良好的光熱效應(yīng)，并可用于光聲成像及CEUS，且隨著納米粒濃度增高，產(chǎn)生的微氣泡隨之增多，增強(qiáng)光聲顯影與CEUS的效果也隨之增加；且納米炭本身是一種黑色染料，用其制備的CNPs仍呈現(xiàn)為黑色，亦具有染色淋巴結(jié)的能力，可進(jìn)一步提高對淋巴結(jié)的顯示率。因此，CNPs有望成為一種新型的集雙模態(tài)顯影和染料為一體的淋巴結(jié)示蹤劑，這種實(shí)時(shí)追蹤、雙模態(tài)顯影及染色淋巴結(jié)的方式有助于簡便、快捷地精確定位惡性腫瘤前哨淋巴結(jié)。

本研究僅對CNPs的一般屬性、光熱效應(yīng)、光聲顯影和CEUS進(jìn)行初步研究，仍有諸多問題亟待解決，如CNPs的毒性與安全性、區(qū)域淋巴結(jié)中CNPs濃度的定量分析、光聲顯影與CEUS的持續(xù)時(shí)間等，均有待進(jìn)一步探索。

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