漁藥的給藥方法與技術(shù)（3）

孟思妤 孟長明 陳昌福

（1.河南省新鄉(xiāng)市康大消毒劑有限公司，453700；2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，430070）

抗菌藥的稀釋劑通常用純水。一般可按商品藥使用說明書上的配制。按1.0g藥物需加多少毫升水或配多少毫克飼料，就相當(dāng)于配制試驗(yàn)藥液所加純水的毫升數(shù)。如10g藥物可配50kg飼料，其換算方法為1g本品加5000mL純水。此溶液即為用于做藥敏試驗(yàn)的藥液。

因?yàn)椴煌闹虏【鷮?duì)同種藥物的敏感性可能是不相同的，采用藥敏片法測(cè)定相同藥物對(duì)不同種類的致病菌的抑菌效果時(shí)，可能會(huì)觀察到直徑不同大小的抑菌圈。如果致病菌不純，該供試致病菌在試驗(yàn)中所產(chǎn)生的抑菌圈，與純培養(yǎng)狀態(tài)下菌株所產(chǎn)生的抑菌圈大小差異比較大，就會(huì)影響對(duì)藥敏試驗(yàn)結(jié)果判斷的準(zhǔn)確性，最終導(dǎo)致水生動(dòng)物執(zhí)業(yè)獸醫(yī)在疾病治療中，難以參考藥敏試驗(yàn)結(jié)果選擇到合適的藥物。

一般而言，應(yīng)該避免直接挑取初分離的菌落完成藥敏試驗(yàn)，除非在暴發(fā)性疾病流行的緊急情況下、當(dāng)革蘭染色提示出分離微生物為單一種類時(shí)，可以直接挑取分離菌落做藥敏試驗(yàn)。但是，其結(jié)果也僅能作為藥敏試驗(yàn)結(jié)果的初步報(bào)告，隨后必須用標(biāo)準(zhǔn)方法重復(fù)完成藥敏試驗(yàn)。

在涂有致病菌的平皿上，藥敏片中的抗菌藥物在瓊脂內(nèi)向四周擴(kuò)散，其藥物濃度呈梯度遞減。因此，在藥敏片周圍一定距離內(nèi)的致病菌生長受到抑制。在經(jīng)過一定時(shí)間培養(yǎng)后，可形成一個(gè)抑菌圈（圖1）。

以無菌操作將滅菌的不銹鋼小管（內(nèi)徑6nm、外徑8nm、高10nm的圓形小管，管的兩端要光滑，也可用玻璃管、瓷管），放置在培養(yǎng)基上，輕輕加壓，使其與培養(yǎng)基接觸無空隙，并在小管處標(biāo)記各種藥物名稱。每個(gè)平板可放4～6支小管。等待5分鐘后，分別向各小管中滴加一定數(shù)量的各種藥液，勿使其外溢。置適當(dāng)溫度條件下培養(yǎng)一定時(shí)間，觀察結(jié)果。

圖1 牛津杯法抑、殺菌試驗(yàn)結(jié)果

表1 藥敏試驗(yàn)結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)

抑菌圈越大，說明該菌對(duì)此藥物越敏感，反之就敏感性越差，若無抑菌圈形成，就說明該菌對(duì)此供試藥物具有耐藥性。其抑菌圈直徑大小與藥物濃度、劃線細(xì)菌濃度有直接關(guān)系。因此，藥敏試驗(yàn)的結(jié)果，應(yīng)按抑菌圈直徑大小作為判定敏感度高低的標(biāo)準(zhǔn)（表1）。

影響藥敏片試驗(yàn)結(jié)果的主要因素有很多：首先，就是培養(yǎng)基。致病菌藥敏試驗(yàn)所用的培養(yǎng)基種類較多，在一般情況下，可以參照美國國家臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)（NCCLS）統(tǒng)一要求的水解酪蛋白（Meller-Hinton，M-H）培養(yǎng)基，因?yàn)檫@種培養(yǎng)基中含有的低胸腺嘧啶是與磺胺類藥物競爭的物質(zhì)。因此，進(jìn)行致病菌藥敏試驗(yàn)的效果比較好。此外，這種培養(yǎng)基中還含有適量的Ca、Mg，在培養(yǎng)基中起到觸媒的作用。但是，有些致病菌對(duì)培養(yǎng)基中的成分有特殊的要求，這類特殊的微生物就需要用特殊的培養(yǎng)基才能完成藥敏試驗(yàn)。例如，對(duì)于弧菌中的專性嗜鹽菌株、美人魚發(fā)光桿菌殺魚亞種、發(fā)光桿菌美人魚亞種和殺鮭弧菌的藥敏試驗(yàn)培養(yǎng)基，最好是采用添加有1.5%NaCl的MHA培養(yǎng)基；柱狀黃桿菌、嗜鰓黃桿菌的藥敏試驗(yàn)培養(yǎng)基要用經(jīng)過稀釋的MHA培養(yǎng)基（或者采用Cytophaga agar，配方是0.05%（W/V）胰蛋白胨，0.05%酵母膏，0.05%醋酸鈉，0.02%牛肉膏，1.0%瓊脂，pH7.2～7.4）；而嗜冷黃桿菌的藥敏試驗(yàn)培養(yǎng)基要用Cytophaga agar培養(yǎng)基（或者采用TYE agar，配方是0.14%胰蛋白胨，0.04%酵母膏，0.05% MgSO47H2O，0.05%CaCl2H2O，1.0%瓊脂，pH7.2）、海豚鏈球菌的藥敏試驗(yàn)培養(yǎng)基要用添加5.0%羊血的MHA。培養(yǎng)基中還有適量的Ca、Mg，在培養(yǎng)基中起到觸酶的作用，其含量的變化，可影響氨基糖苷類和四環(huán)素對(duì)部分致病菌的藥敏試驗(yàn)結(jié)果，這些物質(zhì)的含量過高，抑菌圈會(huì)變小，含量過低，抑菌圈就會(huì)很大。致病菌藥敏試驗(yàn)的培養(yǎng)基厚度大約為4mm，若培養(yǎng)基厚度大于4mm，會(huì)使細(xì)菌出現(xiàn)耐藥；若厚度小于4mm，則可能導(dǎo)致本應(yīng)耐藥的容易出現(xiàn)敏感。所以，試驗(yàn)時(shí)最好不要把藥敏片放在中央部位，而應(yīng)均勻地排布在平皿周圍的培養(yǎng)基上。制作藥敏試驗(yàn)的培養(yǎng)基用水中的一些物質(zhì)，主要是Ca、Mg、A1等礦物質(zhì)離子，也會(huì)在很大程度上影響著藥敏試驗(yàn)的結(jié)果。