假臭草和勝紅薊提取物抑菌活性及穩(wěn)定性研究

周怡 陳雅婷 王奇志 余巖

摘 要 為了更好地利用入侵植物假臭草[Praxelis clematidea（Griseb.）R.M. King & H. Rob.]與勝紅薊（Ageratum conyzoides L.），本文篩選了2種入侵植物不同乙醇濃度提取物對(duì)金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）抑菌的最適提取濃度，檢測(cè)抑菌活性高的提取物的最低抑制濃度（Minimum Inhibitory Concentration，MIC）和最低殺死濃度（Minimum Bactericidal Concentration，MBC），并評(píng)價(jià)其抑菌的熱穩(wěn)定性、紫外光輻射穩(wěn)定性和氧化穩(wěn)定性。結(jié)果表明：假臭草莖葉的70%乙醇提取物[抑菌圈直徑（34.70±0.93）mm]及勝紅薊葉的50%乙醇提取物[抑菌圈直徑（30.95±1.30）mm]抑菌活性高，MIC值分別是0.78和3.13 mg/mL，MBC值是 3.13和25.00 mg/mL，并且抑菌活性具有較好的熱穩(wěn)定性和紫外光輻射穩(wěn)定性，假臭草提取物的氧化穩(wěn)定性?xún)?yōu)于勝紅薊提取物。對(duì)金黃色葡萄球菌抑菌活性高的2種入侵植物提取物具有一定的抑菌活性穩(wěn)定性，在開(kāi)發(fā)植物源抑菌劑方面有潛在應(yīng)用價(jià)值。

關(guān)鍵詞 假臭草 ；勝紅薊 ；金黃色葡萄球菌 ；抑菌活性 ；抑菌穩(wěn)定性

中圖分類(lèi)號(hào) S482.2+92 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A Doi：10.12008/j.issn.1009-2196.2018.03.017

Abstract Invasive plants Praxelis clematidea （Griseb.） R.M. King & H. Rob. and Ageratum conyzoides L. were extracted with different concentrations of ethanol to observe their activities against Staphylococcus aureus in order to utilize the invasive plants. The optimum extraction concentrations of these 2 invasive plants were screened and the minimum inhibitory concentration （MIC） and the minimum bactericidal concentration （MBC） of the extracts with high antibacterial activity were detected. The thermal stability， UV stability and oxidation stability of the extracts against the bacterium S. Aureus were evaluated. The results show that the 70% ethanol extract [inhibition zone diameter （34.70±0.93）mm] of P. clematidea and 50% ethanol extract [inhibition zone diameter （30.95±1.30）mm] of A. conyzoides had the highest antibacterial activity with their MIC values being 0.78 mg/mL and 3.13 mg/mL， and the MBC value 3.13 mg/mL and 25.00 mg/mL， respectively. The antibacterial activity of the extracts had a good thermal and UV stability， and the P. clematidea extract had a higher oxidation stability than the A. conyzoides extract. The ethanol extracts of the 2 invasive plants with high antibacterial activity against S. aureus demonstrates antibacterial stability， suggesting the potential for development of plant-derived antimicrobial agents by using these 2 invasive plants in the future.

Keywords Praxelis clematidea ； Ageratum conyzoides ； Staphylococcus aureus ； antibacterial activity ； antibacterial stability

假臭草[Praxelis clematidea（Griseb.）R.M. King & H. Rob.]和勝紅薊（Ageratum conyzoides L.）是中國(guó)南方常見(jiàn)的惡性入侵雜草[1-2]，對(duì)農(nóng)林牧業(yè)及生物多樣性都造成嚴(yán)重的影響，目前對(duì)其防治措施主要以拔除和噴施化學(xué)除草劑為主，防治成本高且對(duì)環(huán)境污染嚴(yán)重[3]。因此對(duì)假臭草資源化利用是對(duì)其防除的新策略。

盡管假臭草和勝紅薊的主要化學(xué)成分有明顯差異[4-10]，但研究發(fā)現(xiàn)，2種入侵植物對(duì)多種病原微生物都具有一定的抑菌活性。Wang等[11]發(fā)現(xiàn)，假臭草精油對(duì)尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）和辣椒疫霉菌（Phytopthora capsici）具有一定抑制作用；Oliveira-filho等[12]研究結(jié)果表明，假臭草乙醇提取物對(duì)白色念珠菌（Candida albicans）有顯著抑制作用；Filho等[6]從假臭草中分離得到的5，7，4′-三甲氧基黃酮對(duì)金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）和大腸桿菌（Escherichia coli）均具有抑菌活性；孔垂華等[13]研究表明，勝紅薊對(duì)水稻紋枯?。═hanatephorus cucumeris）和花瓜灰霉病（Botrytis cinerea）有一定抑制作用；Okunade 等[14]發(fā)現(xiàn)，勝紅薊對(duì)產(chǎn)黃青霉（Penicillium chrysogenum）和蔓枯病菌（Didymella bryoniae）均有抑制活性；Nogueira 等[15]研究發(fā)現(xiàn)，勝紅薊揮發(fā)油可以抑制黃曲霉毒素B1的產(chǎn)生；Adetutu 等[16]在對(duì)勝紅薊乙醇提取物的研究過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，其對(duì)大腸桿菌、綠膿桿菌和金黃色葡萄球菌都有較好的抑制活性。更有研究表明，假臭草和勝紅薊的乙醇提取物對(duì)金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）的抑菌活性較為明顯[17]。綜上所述，2種入侵植物資源豐富，是潛在植物源抑菌劑的來(lái)源，并且未有關(guān)于2種植物不同乙醇濃度提取物抑菌活性穩(wěn)定性的報(bào)道。因此，本研究將進(jìn)一步探索2種入侵植物對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌活性，首次篩選出乙醇提取物抑菌的最適濃度，并檢測(cè)抑菌活性高的提取物的最低抑制濃度（Minimum Inhibitory Concentration，MIC）和最低殺死濃度（Minimum Bactericidal Concentration，MBC），評(píng)價(jià)其抑菌活性的穩(wěn)定性（熱、紫外光輻射和氧化穩(wěn)定性），為更好的利用2種入侵植物資源，實(shí)現(xiàn)變廢為寶提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

將假臭草的莖葉鮮樣和勝紅薊的葉部鮮樣沖洗干凈剪段后放入45℃鼓風(fēng)干燥箱，干燥3 d后，磨粉，過(guò)40目篩，放入塑封袋備用。

供試菌種：金黃色葡萄球菌（S. aureus）。

主要儀器和試劑：YB-2000A型高速多功能粉碎機(jī)，浙江康永市速鋒工貿(mào)有限公司；N-110型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，EYELA； SW-CJ-2F型超凈工作臺(tái)，蘇州凈化；SHP-250型恒溫培養(yǎng)箱，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備公司；UV-1200型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海美譜達(dá)儀器有限公司；細(xì)菌濾器，廈門(mén)綠茵試劑有限公司；中國(guó)藥典標(biāo)準(zhǔn)牛津杯，廈門(mén)綠茵試劑有限公司；無(wú)水乙醇，AR，國(guó)藥集團(tuán)有限公司；吐溫-80，AR，廈門(mén)泰京生物技術(shù)公司。

1.2 方法

1.2.1 提取物的制備

稱(chēng)取植物干粉40 g，按料液比1∶5（g/mL），用0、30%、50%、70%和95%不同濃度乙醇浸泡12 h后減壓抽濾，濾渣用等體積的溶劑浸泡，重復(fù)2次；合并3次所得濾液，35～45℃減壓旋蒸，得到有機(jī)提取物浸膏，浸膏用40 mL 50%乙醇和20%吐溫-80 混合溶液溶解稀釋?zhuān)蛊錆舛葹? g/mL，對(duì)照溶劑為50%乙醇和20%吐溫-80的混合液。

1.2.2 抑菌活性的測(cè)定

采用牛津杯法[18]對(duì)不同乙醇濃度提取物的抑菌活性進(jìn)行測(cè)定。向每個(gè)牛津杯中加入150 μL不同濃度乙醇提取物，對(duì)照溶劑為50%乙醇和20%吐溫-80的混合液，于37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后，觀察細(xì)菌生長(zhǎng)情況，采用十字交叉法，統(tǒng)計(jì)抑菌圈直徑，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。篩選出抑菌活性高的提取物，以備后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用。

1.2.3 MIC和MBC測(cè)定

取抑菌活性高的提取物，采用試管二倍遞減稀釋法[19]置入10支滅菌試管中的濃度分別為：50.00、25.00、12.50、6.25、3.13、1.56、0.78、0.39、0.20和0.10 mg/mL，每只試管中加入濃度為1×108 cfu/mL的細(xì)菌菌懸液50 μL，對(duì)照組加入等量無(wú)菌水，37℃的搖床培養(yǎng)24 h后，每管吸出2 mL在紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)上測(cè)定吸光值，若處理組和對(duì)照組的吸光度值為0，則認(rèn)為培養(yǎng)基中完全沒(méi)有菌生長(zhǎng)，未長(zhǎng)菌培養(yǎng)基中最低的濃度作為提取物的最低抑制濃度（MIC），將上述最低抑制濃度培養(yǎng)物繼續(xù)在37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24～48 h，求出最低殺死濃度（MBC）。

1.2.4 穩(wěn)定性評(píng)價(jià)

對(duì)抑菌活性高的提取物的熱穩(wěn)定性、紫外光輻射穩(wěn)定性和氧化穩(wěn)定性進(jìn)行測(cè)定。

1.2.4.1 熱穩(wěn)定性

取等量濃度為200 mg/mL的提取物分別置于4、40、60、80和100℃水浴及121℃濕熱條件下熱處理20 min。采用1.2.2牛津杯法測(cè)定不同處理后提取物的抑菌活性。

1.2.4.2 紫外光輻射穩(wěn)定性

將浸泡有提取物的濾紙片置入超凈工作臺(tái)上吹干后，使用紫外燈照射5、10、15、20和25 min后貼在涂過(guò)供試菌的平板上。倒置放在恒溫箱中，37℃培養(yǎng)18～24 h后測(cè)定抑菌活性。

1.2.4.3 氧化穩(wěn)定性

取提取物200 mg放于2 mL離心管中，在室溫條件下暴露于空氣中5、10、24、48和72 h后，用20%吐溫80溶液稀釋至1 mL。采用1.2.2牛津杯法測(cè)定不同處理后提取物的抑菌活性。

1.2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)與分析，Origin9.0軟件作圖。抑菌圈直徑均為3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差。采用最小顯著差法（LSD）多重比較進(jìn)行顯著性分析（p<0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同提取物的抑菌活性

如圖1所示，假臭草和勝紅薊不同濃度乙醇提取物均對(duì)金黃色葡萄球菌具有抑制活性。其中假臭草70%乙醇提取物（抑菌圈直徑34.70±0.93 mm）和勝紅薊50%乙醇提取物（抑菌圈直徑30.95±1.30 mm）抑菌活性最好。對(duì)照溶劑對(duì)金黃色葡萄球菌無(wú)抑菌活性。

2.2 MIC和MBC測(cè)定

如表1所示，假臭草莖葉70%乙醇的提取物不同濃度（50.00、25.00、12.50、6.25、3.13、1.56和0.78 mg/mL）都沒(méi)有菌落生長(zhǎng)，因此提取物對(duì)供試菌的MIC為0.78 mg/mL，最后結(jié)果檢測(cè)出MBC為3.13 mg/mL。

如表2所示，勝紅薊葉50%乙醇提取物物對(duì)供試菌的MIC為3.13 mg/mL，最后結(jié)果檢測(cè)出MBC為25.00 mg/mL。假臭草提取物對(duì)金黃色葡萄球菌的MIC和MBC均小于勝紅薊，因此假臭草提取物對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌活性要高于勝紅薊。

2.3 穩(wěn)定性研究

假臭草莖葉70%乙醇提取物和勝紅薊葉50%乙醇提取物對(duì)金黃色葡萄球菌的穩(wěn)定性研究結(jié)果如下。

2.3.1 熱處理對(duì)提取物抑菌穩(wěn)定性的影響

如圖2所示，不同溫度處理后的假臭草提取物的抑菌圈直徑差異均不顯著（p>0.05），最小和最大抑菌圈直徑分別為（21.53±0.85）mm和（23.10±0.13）mm，假臭草提取物抑菌活性物質(zhì)并沒(méi)有因溫度受到很大影響，說(shuō)明假臭草抑菌活性物質(zhì)耐高溫，具有很好的抑菌熱穩(wěn)定性。勝紅薊提取物經(jīng)過(guò)不同的溫度處理后，當(dāng)溫度低于75 ℃時(shí)，不同溫度處理的提取物抑菌圈直徑?jīng)]有顯著差異（p>0.05）；處理溫度為100 ℃時(shí)，抑菌圈達(dá)到最大值（12.37±0.71）mm，處理溫度為4 ℃時(shí)，抑菌圈最小為（11.24±0.18）mm，二者差異顯著（p<0.05）。低溫（4℃）和常溫條件對(duì)假臭草提取物抑菌活性物質(zhì)并沒(méi)有影響。在高溫條件下（100℃和121℃）勝紅薊提取物抑菌活性并沒(méi)有減弱，二者差異不顯著（p>0.05），說(shuō)明勝紅薊抑菌活性物質(zhì)耐高溫，具有一定的熱穩(wěn)定性。

2.3.2 紫外光輻射對(duì)提取物抑菌穩(wěn)定性的影響

如圖3 所示，假臭草提取物抑菌穩(wěn)定性受紫外輻射的影響，隨著紫外處理時(shí)間的增加，抑菌圈直徑有逐漸減小的趨勢(shì)，抑菌活性降低，當(dāng)紫外處理5 min時(shí)，抑菌活性最好，抑菌圈直徑為（24.10±0.58）mm；25 min時(shí)抑菌圈直徑最小為（21.05±0.61）mm，二者之間差異顯著（p<0.05）。勝紅薊提取物經(jīng)過(guò)紫外輻射不同時(shí)間后抑菌圈差異均不顯著（p>0.05），抑菌圈直徑最大值和最小值分別為（13.43±0.81）mm和（12.34±1.24）mm。假臭草提取物抑菌穩(wěn)定性受紫外輻射影響較大，勝紅薊提取物具有一定的紫外輻射穩(wěn)定性。

2.3.3 氧化處理對(duì)提取物抑菌穩(wěn)定性的影響

如圖4所示，假臭草提取物在經(jīng)過(guò)不同的氧化時(shí)間處理后對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌活性總體呈減弱趨勢(shì)。當(dāng)提取物經(jīng)氧化處理48 h后，抑菌活性相比之前顯著降低（p<0.05），其最大和最小抑菌圈直徑分別為（18.80±0.99）mm和（16.44±0.49）mm。氧化處理對(duì)勝紅薊提取物抑菌穩(wěn)定性影響較大，當(dāng)氧化處理時(shí)間小于48 h時(shí)，提取物抑菌圈直徑顯著差異（p<0.05），其最大和最小抑菌圈直徑分別為（14.34±0.47）m和（10.17±0.38）mm。結(jié)果顯示，長(zhǎng)時(shí)間氧化處理后會(huì)對(duì)假臭草提取物抑菌活性產(chǎn)生一定影響，而勝紅薊提取物抗氧化能力較差。

3 結(jié)論與討論

3.1 結(jié)論

研究結(jié)果顯示：假臭草和勝紅薊抑制金黃色葡萄球菌的粗提物的最佳乙醇提取濃度分別為70%和50%，并且假臭草的MIC值是0.78 mg/mL，MBC值是3.13 mg/mL；勝紅薊的MIC值是3.13 mg/mL，MBC值是25.00 mg/mL。在不同溫度條件下熱處理20 min后假臭草和勝紅薊的抑菌圈直徑變化較小，說(shuō)明假臭草和勝紅薊的提取物都有較強(qiáng)的熱穩(wěn)定性。使用紫外燈照射不同時(shí)間后顯示，假臭草抑菌圈直徑受紫外輻射影響有變小趨勢(shì)，而勝紅薊抑菌活性未有明顯變化，說(shuō)明勝紅薊提取物具有較好的抗紫外輻射穩(wěn)定性。當(dāng)在室溫條件下暴露于空氣中不同時(shí)間后，假臭草的抑菌活性隨時(shí)間延長(zhǎng)會(huì)出現(xiàn)微弱下降趨勢(shì)，勝紅薊抑菌活性下降趨勢(shì)相對(duì)于假臭草較為明顯，由此可見(jiàn)，假臭草提取物具有較好的抗氧化穩(wěn)定性。

3.2 討論

假臭草和勝紅薊是中國(guó)南方常見(jiàn)的惡性入侵雜草，為了實(shí)現(xiàn)對(duì)其資源化利用，本研究對(duì)其提取物抑菌的最適乙醇提取濃度、抑菌活性高的提取物的MIC、MBC以及抑菌的穩(wěn)定性進(jìn)行了探討。另有研究表明，在同樣使用牛津杯法和二倍稀釋法測(cè)得乙醇提取物抑菌活性的條件下，五味子的MIC值為7 mg/mL，在使用濾紙片法和二倍稀釋法測(cè)得乙醇提取物抑菌活性的條件下山胡椒的MIC值為0.062 5 g/mL[20-21]，與本實(shí)驗(yàn)的2種入侵植物相比其抑菌活性較弱。由此可見(jiàn)在抑菌活性方面相對(duì)于其他植物假臭草和勝紅薊更具優(yōu)勢(shì)，并且假臭草提取物具有較好的抑菌穩(wěn)定性，不受保存溫度的影響，方便儲(chǔ)存，也比較利于進(jìn)一步對(duì)其進(jìn)行分離純化，進(jìn)行工業(yè)化開(kāi)發(fā)利用；勝紅薊提取物具有較好的熱穩(wěn)定性和紫外光輻射穩(wěn)定性，而抗氧化性一般。因此，在對(duì)勝紅薊的提取物儲(chǔ)存時(shí)應(yīng)盡量密封儲(chǔ)藏，避免與空氣過(guò)多接觸。2種入侵植物假臭草和勝紅薊資源豐富，可以作為優(yōu)質(zhì)的天然抗菌植物資源，在植物源抑菌劑方面有良好的開(kāi)發(fā)前景。

參考文獻(xiàn)

[1] 王真輝，安 鋒，陳秋波. 外來(lái)入侵雜草—假臭草[J]. 熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)，2006，26（6）：33-37.

[2] 郝建華，強(qiáng) 勝. 外來(lái)入侵性雜草—?jiǎng)偌t薊[J]. 雜草科學(xué)， 2005（4）：54-58.

[3] 程漢亭，范志偉，沈奕德，等. 外來(lái)入侵植物假臭草的研究進(jìn)展[J]. 雜草科學(xué)， 2010（3）：1-4.

[4] Bohlmann F， Wegner P， Jakupovic J， et al. Struktur und synthese von n-（acetoxy）-jasmonoylphenylalaninmethylester aus Praxelis clematidea[J]. Tetrahedron， 1984， 40 （13）： 2 537-2 540.

[5] 鄧世明，楊先會(huì)，王 寧，等. 外來(lái)入侵植物假臭草的黃酮類(lèi)成分研究[J]. 西北植物學(xué)報(bào)，2009，29 （12）：2 548-2 550.

[6] Filho A A O， Fernandes H M B， Sousa J P， et al. Antibacterial activity of flavonoid 5.7.4'-trimethoxyflavone isolated from Praxelis clematidea R.M. King & Robinson[J]. Boletín Latinoameric ano Y Del Caribe De Plantas Medicinales Y Aromáticas， 2013， 12（4）： 400-404.

[7] Ekundayo O， Laakso I， Hiltunen R. Essential oil of Ageratum conyzoides[J]. Planta Medica， 1988， 54（1）： 55-57.

[8] Sundufu A J， Huang S S. Chemical composition of the essential oils of Ageratum conyzoides L.occurring in south China[J]. Flavour & Fragrance Journal， 2004， 19（19）： 6-8.

[9] De Melo N I， Magalhaes L G， De Carvalho C E， et al. Schistosomicidal activity of the essential oil of Ageratum conyzoides L.（Asteraceae） against adult Schistosoma mansoni worms[J]. Molecules， 2011， 16（1）： 762-773.

[10] Vera R. Chemical composition of the essential oil of Ageratum conyzoides L.（Asteraceae） from Réunion[J]. Flavour & Fragrance Journal， 2006， 8（5）： 257-260.

[11] Wang Z H， Christie P， Chen Q B， et al. Allelopathic potential and chemical constituents of volatile oil from Praxelis clematidea[J]. Allelopathy Journal， 2006， 18（2）： 225-235.

[12] Oliveira-filho A A， Fernandes H M B， Sousa J P， et al. Antibacterial and antifungal potential of the ethanolic extract of Praxelis clematidea R.M. King & Robinson[J]. International Journal of Pharmacognosy & Phytochemical Research， 2013， 5（3）： 183-185.

[13] 孔垂華，黃壽山，胡 飛. 勝紅薊化感作用研究V.揮發(fā)油對(duì)真菌、昆蟲(chóng)和植物的生物活性及其化學(xué)成份[J]. 生態(tài)學(xué)報(bào)，2001，21（4）：584-587.

[14] Okunade A L. Ageratum conyzoides L.（Asteraceae）[J]. Fitoterapia， 2002， 73（1）： 1-16.

[15] Nogueira J H， Goncalez E， Galleti S R， et al. Ageratum conyzoides essential oil as aflatoxin suppressor of Aspergillus flavus[J]. International Journal of Food Microbiology， 2010， 137（1）： 55-60.

[16] Adetutu A， Morgan W A， Corcoran O， et al. Antibacterial activity and in vitro cytotoxicity of extracts and fractions of Parkia biglobosa （Jacq.） Benth.stem bark and Ageratum conyzoides Linn.leaves[J]. Environmental Toxicology and Pharmacology， 2012， 34（2）： 478-483.

[17] 李書(shū)明，陳雅婷，王奇志. 入侵植物假臭草和勝紅薊提取物的抑菌活性研究[J]. 核農(nóng)學(xué)報(bào)，2017， 31（9）：1 717-1 722.

[18] 張艾青，劉書(shū)亮，敖 靈. 產(chǎn)廣譜細(xì)菌素乳酸菌的篩選和鑒定[J]. 微生物學(xué)通報(bào)，2007，34（4）：753-756.

[19] 杜仲業(yè)，陳一強(qiáng)，孔晉亮，等. 黃芩素對(duì)金黃色葡萄球菌生物膜抑制作用的體外研究[J]. 中國(guó)現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志，2012，22（12）：19-23.

[20] 張媛媛，馮亞凈，李書(shū)國(guó). 五味子乙醇提取物的抑菌穩(wěn)定性及抑菌機(jī)理研究[J]. 糧油食品科技， 2016， 24（1）：55-60.

[21] 游玉明，黃琳琳. 山胡椒提取物的抑菌活性及其穩(wěn)定性[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè)，2013，39（5）：116-119.