香水椰子主要香味化合物2AP的研究進展

吳玉雙 李靜 吳翼 許麗菁 楊耀東

摘 要 香水椰子（Cocos nucifera L.）是綠矮椰子中的一個突變品種，因具備特殊的香味而在市場中備受青睞。研究發(fā)現(xiàn)它的香味主要成分是2-乙酰-1-吡咯啉（2-acetyl-1-pyrroline，2AP），這對于具特殊香味椰子品種的早期選育具有重要的意義。本文主要綜述了2AP的相關研究進展，介紹2AP在其他作物的研究現(xiàn)狀及其定性和定量的分析方法，對2AP的生物合成、相關基因及其調(diào)控機理等方面的研究進行了論述，最后對2AP相關研究的應用前景進行了展望。

關鍵詞 香水椰子 ；2-乙酰-1-吡咯啉 ；生物合成

中圖分類號 S667.4 文獻標識碼 A Doi：10.12008/j.issn.1009-2196.2018.03.015

Abstract Aromatic coconut （Cocos nucifera L.） was a mutant of green dwarf coconut and favored in the market for its special aroma. The main component of its aroma was 2-acetyl-1-pyrroline （2AP）， which was of great significance for early breeding of coconut varieties with special flavor. The research progress of 2-acetyl-1-pyrroline （2AP） were reviewed. The current research status， qualitative and quantitative analysis methods of 2AP in other crops were introduced. The biosynthesis， related genes and regulatory mechanisms of 2AP were analyzed. A prospect of future application of 2AP was made.

Keywords aromatic coconut ； 2-acetyl-1-pyrroline ； biosynthesis

世界中充滿了風味和香味，是由于植物產(chǎn)生和散發(fā)出許多揮發(fā)性物質(zhì)。而香味和舒適的口感直接決定了消費者對食物的喜好和選擇，香味特征也有助于不熟悉的消費者接受產(chǎn)品。香水椰子（Cocosnucifera L.） 因具備特殊的香味而具有巨大經(jīng)濟價值，它是綠矮椰子中的一個特異變種類型，原產(chǎn)于泰國[1]，就像印度香米巴斯馬蒂、泰國香米Khao Dawk Mali、日本香米Kaorimai一樣，因具備香味而在市場中備受歡迎，并且價格較高。在泰國，香水椰子已經(jīng)變成了一個重要的農(nóng)業(yè)商品，嫩果和椰子水被出口到許多國家，包括美國、澳大利亞、新加坡和中國等（Thailand's Office of Agricultural Economics）。而中國是在20世紀90年代才引進香水椰子，它的生長周期長，種植后3～4 a才能開花結(jié)果，育種周期長，育種手段單一，因此無法滿足人們?nèi)找嬖鲩L的需求[2]。

隨著各種研究手段的不斷進步，對香水椰子的研究不斷深入，研究發(fā)現(xiàn)由于2-乙酰-1-吡咯啉（2-acetyl-1-pyrroline，2AP）的存在而使得香水椰子具備這種特殊香味，它產(chǎn)生的香味是一種隱性性狀，只有在純化的情況下才具有香味[3]。了解2AP的生物合成及其調(diào)控基因?qū)ο闼佑N方面具有重要的作用。本文對2AP的物質(zhì)成分及其生物合成途徑進行簡單概述。

1 香味主要化合物：2-乙酰-1-吡咯啉

對芳香和非香的香水椰子揮發(fā)性化合物的分析表明，2-乙酰-1-吡咯啉（2-acetyl-1-pyrroline，2AP）的存在使得香水椰子具備特殊的氣味[4]。2-乙?；?1-吡咯啉[2AP；IUPAC名稱為5-乙?；?3，4-二氫-2H-吡咯1-（3，4-二氫-2H-吡咯-5-基）-乙酮]的香味閥值是0.02 ng/L（風味閥值指人的嗅覺器官能感受到的該化合物所需的最小濃度值）[5]，它在自然界中廣泛存在，在香葉露兜樹葉、Bassia寬葉植物、菠菜、芋頭球莖、面包花（紐子花屬、馬藍細胞懸浮培養(yǎng)）、大豆、綠豆、高粱、黃瓜、大麥、燕麥和香水椰子等植物中均有發(fā)現(xiàn)。2AP還能從可可發(fā)酵箱中分離出的芽孢桿菌菌株、希氏乳桿菌和幾株真菌中鑒定出來，甚至在老虎的尿液中也有發(fā)現(xiàn)。2AP還在多種谷物產(chǎn)品、植物源和動物源性產(chǎn)品中被發(fā)現(xiàn)，例如，小麥面包、黑麥面包、面包、吐司、濕磨小米、爆米花和甜玉米制品、中度烤芝麻、長棍面包、淡水龍蝦的熟尾肉、煮土豆、野生芒果的烤種子、熟藍蟹、玉米粉、芋頭揮發(fā)物、牡蠣、熟的美國龍蝦尾巴、熱處理的脫脂奶粉、伊比利亞干凍火腿和熟食等。除了生活系統(tǒng)，2AP已被認為是大量加熱和加工食品的重要添加劑。2AP是高度不穩(wěn)定的化合物，不適于長期儲存，因此它以天然形式被使用，用于添加到各種食物，如面包店的產(chǎn)品、糖果、飲料、冰淇淋等。露兜樹葉也被加入到普通的米飯中，在烹飪時賦予香米香氣。2AP含量在香稻中差異很大，如Basmati rice（0.34 mg/L）、Jasmine rice（0.81 mg/L）、KDML brown rice （3.00 mg/L）和Texmati（0.53 mg/L）。在不同植物中含量也各不相同，如山檨子屬 （3.00 mg/L）、紐子花（0.34 mg/L）、香水椰子（3.29～21.98 mg/L）、香葉露兜葉（10～12 mg/L）、面包花（26.1 mg/L）。

幾十年來，研究人員致力于鑒定使動植物具備獨特香味和風味的化合物，報道了數(shù)百種揮發(fā)性化合物，但未能鑒定出其主要分子。Buttery等[6]在香稻中首次成功鑒定出2AP是產(chǎn)生獨特和令人愉快的香味的主要化合物。通過以無香味的水稻品種Texars、Long、Grain和Calrose為對照，測定Basmati370、Malagkit、Hieri和Sungsong等8個香稻品種的2AP含量，發(fā)現(xiàn)香稻糙米和精米的蒸餾揮發(fā)物中2-乙酰-1-吡咯啉的含量是對照品種的5～10倍，同時還發(fā)現(xiàn)8個香稻品種的飯米香味強弱與其含有2-乙酰-1-吡咯啉濃度的高低成正比。Buttery等[5]報道稱露兜樹葉也含有2-乙酰-1-吡咯啉，蒸煮大米時加入露兜樹葉能使米飯具有香稻的香氣，經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)，露兜樹葉主要揮發(fā)物的凍干品成分和人工合成的2-乙酰-1-吡咯啉是相同的，驗證了其先前得出的2-乙酰-1-吡咯啉是稻米香味主要成分的結(jié)論。Arikit等[7]在大豆中鑒定出2AP，并證明2AP是大豆芳香表型的決定因素。Saensuk等[4]在香水椰子中以不香的椰子 BEDO/KU0030、BEDO/KU0033和BEDO/KU0040等10個樣品作對照，測定BEDO/KU 0002， BEDO/KU0004等10個香水椰子樣品的香氣成分，利用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（GC-MS）進行定量分析，發(fā)現(xiàn)在所有10個不香的樣品中均檢測不到2AP的存在，而在10個芳香的香水椰子樣品中均能檢測出2AP，2AP含量變化范圍為（3.29±0.20）～（21.98±1.00） mg/L。上述結(jié)果表明，所有芳香椰子種質(zhì)中的這種揮發(fā)性化合物——2AP是香水椰子香味的主要化合物成分，其含量差異顯著，這可能是由于椰子果實的年齡有所差異，而且受環(huán)境因素和土壤性質(zhì)的影響；此外，遺傳控制也可能發(fā)揮作用，2AP提取和檢測的不同方法也會產(chǎn)生檢測水平的差異，這些都需要深入進行標記芳香性狀關聯(lián)分析，然后進行QTL分析，以確定基因效應和量化遺傳控制的程度。

2 2AP的鑒定方法

2.1 氫氧化鉀浸泡法[8]

稱取0.5 g的香水椰子的新鮮葉子，剪碎并放在含有10 mL1.7%氫氧化鉀溶液的培養(yǎng)皿中，蓋上蓋子10 min，打開蓋，聞氣味。

2.2 香味顯色法[9]

該法原理是2-乙酰-1-吡咯啉有一個非活性的吡咯啉環(huán)和活性甲基酮組，后者與2，4-二硝基苯肼發(fā)生反應得到橘紅色化合物2-乙酰苯腙。

2-acetyl-1-pyrroline+2，4-dinitrophenylhydrazine→2-acetyl-phenyl hydrazine

2.2.1 切片法

將樣品浸泡過夜使其軟化；第2天，用刀片將樣品進行手工切割獲得橫截面，將薄的部分利用不同的酒精級別（10%，20%，30%，50%，70%，90%和無水酒精）浸泡，使之變透明；然后將切片轉(zhuǎn)移到2，4-二硝基苯肼試劑（將2 g 2，4-二硝基苯肼溶解在15 mL濃硫酸中，然后加入15 mL 95%乙醇，用蒸餾水將溶液稀釋至150 mL）中，并在熱空氣烘箱中以60℃孵育30 min，然后制成石蠟切片；用顯微鏡觀察其結(jié)構(gòu)及顏色變化。

2.2.2 薄層層析法

稱取100 g的香水椰子葉于1L蒸餾水中蒸餾，將得到的蒸餾產(chǎn)品用乙醚提取揮發(fā)性物質(zhì)；用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將提取液在減壓、26℃的條件下濃縮至5 mL；將得到的濃縮提取物裝載在薄層層析板上，用2，4-二硝基苯肼試劑噴霧將其染色，觀察其顏色變化。

2.3 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[10]

取50 mL的椰子水（20 g椰肉），加入20 mL乙醚，在分液漏斗中輕搖10 min，重復2次，然后去掉下層水層，取上層有機層；在有機層里加1 g的無水硫酸鈉，以10 000 r/min常溫離心15 min，使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在減壓、26℃的條件下將提取液濃縮至0.5 mL；然后加內(nèi)標TMP，利用GC-MS進行分析，根據(jù)得到的峰面積計算2AP的含量。

3 2AP的生物合成

2AP在自然界中大量存在，與植物、動物、微生物的香味息息相關，而香味是衡量動植物、微生物品質(zhì)的一個重要指標，也是育種研究的重要內(nèi)容。在過去的幾十年中，大量研究人員對2AP生物合成進行了研究。遺傳分析顯示，主要的香味性狀是受細胞核基因控制的遺傳性狀，與細胞質(zhì)基因無關[11]，其中在研究的一些香稻品種中，有些顯示單基因控制；而在其他一些情況下，它被認為是一個數(shù)量性狀，許多基因參與其合成。因此，香味性狀是由復雜的遺傳控制的。

最初，研究人員采用許多不同的方法，例如RFLP標記，鑒定出一個位于8號染色體上的隱性基因，說明香味基因由它控制；并使用SSR標記芳香水稻和非芳香水稻，發(fā)現(xiàn)來自非芳香水稻品種IR36的易位；再通過水稻基因組測序和物理虛擬繪圖研究可知，位于8號染色體上的候選基因與甜菜堿醛脫氫酶2（BADH2）同源，并負責香稻2AP香味的合成，badh2基因上8個堿基對的缺失，導致過早產(chǎn)生了終止密碼子，一旦編譯，則會產(chǎn)生縮短了的非功能蛋白。因此，水稻badh2基因位點構(gòu)成的隱性基因被認為是香味性狀的主要遺傳決定因素[12]。在水稻中還發(fā)現(xiàn)2個沒有香味功能的badh2隱性基因，一個為badh2-E7，位于第7個外顯子上，由于8個堿基的缺失和3個單核苷酸多態(tài)性（SNPs）的差異而導致翻譯提前終止，編碼的甜菜堿醛脫氫酶（BADH2）蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，因積累2-乙酰-1-吡咯啉（2AP）而產(chǎn)生香味，預測badh2基因可能是控制香味性狀的基因[13]；另一個為badh2-E2，其具有與badh2等位基因相同的序列，但其在第二外顯子中存在7 bp缺失，這些badh2等位基因都有助于水稻風味合成[14]。Badh1與badh2是同源基因，均位于水稻的4號染色體上，它們有相似的分子功能，但其在香味方面的作用還沒有被鑒定[15]。通過對GmAMADH1和GmAMADH2基因在芳香族和非芳香族的大豆葉片、幼嫩種子和愈傷組織中的表達情況分別進行研究，利用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應（RT-PCR）進行分析，結(jié)果表明，這2個基因的表達模式不同，但是這些大豆品種中，5種芳香的大豆所有組織的GmAMADH2表達水平均低于5種非芳香品種[7]；相比之下，GmAMADH1的表達水平在所有的10個大豆品種中沒有差異，這說明芳香的品種中GmAMADH2低表達與2AP存在關聯(lián)。Vanavichit等[16]第一次證明badh2基因表達降低會導致2AP的積累，利用RNA干擾技術對Jasmine香米進行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)最強的RNAi表達抑制作用最強，但是2AP含量積累最高。另一項研究表明，轉(zhuǎn)基因水稻包含RNAi（通過cDNA反向重復）編碼Os2AP，累積相當數(shù)量的2AP。Chen等[17]證明在水稻中利用RNAi技術可使badh2基因表達量降低，導致2AP積累，可見badh2決定了水稻2AP的積累。負責高粱香味的基因也像大米一樣，高粱的BADH2中含有提前的終止密碼子，這損害全長功能性badh2蛋白的合成，導致2AP的積累。Yundaeng等[18]報道了BADH2基因和高粱香味之間的關聯(lián)，通過QTL分析，確定了BADH2基因決定香味的形成。Juwattanasomran等[19]第一次報道稱大豆中氨基酸的置換對BADH2蛋白的功能活性至關重要，表明BADH2中SNP負責大豆香味的合成。Arikit等[7]在黃豆中發(fā)現(xiàn)，氨基醛脫氫酶GmAMADH2的10號外顯子中等位基因TT缺失引起移碼突變和終止密碼子提前產(chǎn)生，導致氨基醛脫氫酶失活，從而使得2AP產(chǎn)生。Vongvanrungruang等[20]通過克隆香水椰子中的香味基因甜菜堿醛脫氫酶2（Badh2）發(fā)現(xiàn)，該基因與其他植物的Badh2基因高度同源，而芳香族和非芳香族椰子之間的單核苷酸差異導致在位點442處，丙氨酸（非芳香族）轉(zhuǎn)化為脯氨酸（芳香族），這是BADH2的底物結(jié)合位點，脯氨酸的環(huán)側(cè)鏈可能使結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，導致產(chǎn)生無功能的酶，從而使得香水椰子產(chǎn)生香味。Saensuk等[4]對香水椰子進行研究發(fā)現(xiàn)，CnAMADH2為水稻香味基因的同源物，在14號外顯子上單堿基G變成C，堿基替換引起氨基酸的改變，丙氨酸變成脯氨酸。位點442 （P442A）在此位置的存在可能改變環(huán)區(qū)域的空間構(gòu)象，產(chǎn)生不穩(wěn)定的二聚體構(gòu)象，隨后降低AMADH酶活性，使2AP積累。通過研究發(fā)現(xiàn)，香味2AP的生物合成主要是受BADH2基因調(diào)控，這對進一步了解其形成機理具有重要意義。

Bradbury等[21]發(fā)現(xiàn)，水稻BADH2基因?qū)Ζ?氨基丁醛（GABald）具有較高的活性，對甜菜堿醛具有中等活性。在水稻中，BADH2調(diào)控來自γ-氨基丁酸（GABA）的γ-氨基丁醛（GABald）的代謝，GABAld自發(fā)環(huán)化為Δ1-吡咯啉，這是2AP的關鍵前體；BADH2基因第7外顯子上8個堿基的缺失和3個核昔酸的多態(tài)性使基因翻譯提前終止，導致甜菜堿乙醛脫氫酶因不完整而失去原有的功能，從而使香味物質(zhì)2AP在香型水稻中積聚。功能性的BADH2基因能夠編碼完整的甜菜堿乙醛脫氫酶，其通過消耗2AP的前體物質(zhì)而使水稻缺乏香味。Chen等[17]研究表明，水稻中2AP的積累是由于BADH2活性喪失，導致其底物（GABald/Δ1-吡咯啉）水平升高，而游離GABald/Δ1-吡咯啉的利用率是2AP合成速率的控制因子。GABald/Δ1-吡咯啉的可用性取決于多胺和脯氨酸的降解以及BADH2酶的活性，BADH2利用GABald/Δ1-吡咯啉轉(zhuǎn)化成GABA，從而抑制2AP合成，而GABald/Δ1-吡咯啉的積累導致2AP合成增加。Romanczyk等[22]研究表明，在培養(yǎng)蠟狀芽孢桿菌的過程中，當用高含量的脯氨酸、鳥氨酸和谷氨酸輔以培養(yǎng)時，2AP的含量會增加，后來，脯氨酸、鳥氨酸、谷氨酸被鑒定為水稻和香葉露兜中2AP生物合成的基本前體。Costello等[23]提出鳥氨酸在2AP合成中作為氮源，通過利用γ-氨基丁醛（GABAld）（一種腐乳酸乳桿菌降解途徑中的產(chǎn)物），GABAld自發(fā)環(huán)化成Δ1-吡咯啉，隨后在C-2位置?；纬甚；o酶A衍生物，導致2AP的合成。Cheetangdee等[24]的研究還顯示，在香葉露兜中，谷氨酸、脯氨酸、葡萄糖和果糖是2AP可能的前體，甲基乙二醛（丙酮醛）、糖的降解產(chǎn)物被鑒定為2AP的碳源。Saensuk等[4]的研究表明，AMADH基因編碼將4-氨基丁醛（ABAL）轉(zhuǎn)化為γ-氨基丁酸（GABA）所必需的AMADH，AMADH基因的突變會導致ABAL的積累，游離ABAL或乙?；沫h(huán)狀1-吡咯啉將導致2AP的合成。因此，2AP生物合成已被認為是積聚ABAL的解毒途徑。與非芳香椰子相比，芳香椰子CnAMADH2基因的第14外顯子第442位（P442A）的丙氨酸變成脯氨酸，單個氨基酸改變的位置處于二聚化結(jié)構(gòu)域的環(huán)中，其遠離底物和輔因子NADH的結(jié)合位點；在二聚體模型中，芳香椰子CnAMADH2蛋白序列中的脯氨酸可能使環(huán)形區(qū)域中的二聚體不穩(wěn)定，這可能導致CnAMADH2的酶活性降低或喪失，從而導致2AP積累。這些研究結(jié)果表明，酶失活導致2AP的合成，這對早期育種具有重要意義。

4 展望

香水椰子糖分含量高，椰肉細膩松軟，營養(yǎng)豐富，是優(yōu)質(zhì)的天然綠色食品，更因為它具有特殊的香味而備受人們喜愛，在市場上大受歡迎[25]。但是目前為止國內(nèi)對香水椰子香味的形成機理研究較少，充分了解2AP的生物合成及其調(diào)控基因?qū)ο闼佑N方面具有重要的作用，可以通過與2AP相關聯(lián)的分子標記技術來輔助香水椰子的早期篩選和提高香水椰子的純度，從而縮短香水椰子的繁育周期，提高香味品質(zhì)，促進香水椰子產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。

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